除上清，同（I)MES溶液洗涤2-3次；
[0058] (3)偶联：将赭曲霉毒素 A单克隆抗体溶解到60 μ L pH5. 0、25mmol/L MES溶液中， 用所述MES溶液调节总体积至100 μ L，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4°C偶 联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
[0059] ⑷封闭：磁分离后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反应15min封闭磁 珠；
[0060] (5)保存：磁分离后移除上清，用IOOyL含0· 1% -0.3% BSA、0. 1%吐温-20的 TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠 3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0. 1 % -0. 5 % BSA、0. 01% -0· 1%吐温-20、0· 02%似队的TRIS溶液中（浓度为lOmg/mL)，2-8°C保存备 用。
[0061] 实施例2免疫磁珠的特性检测
[0062] 取按照实施例1制备的富集赭曲霉毒素 A的免疫磁珠0.1 mL (浓度为lOmg/mL)于 IOmL离心管中，用5mL去离子水润洗磁珠2次，磁分离后移除上清；然后加入ImL待测样品 (将赭曲霉毒素 A标准品用PBS缓冲液分别配制成浓度为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/ mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL的赭曲霉毒素 A溶液作为待测样品，并以PBS缓冲 液作为空白待测样品），混匀，25°C捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；磁分离后移除上 清，用5mL去离子水润洗磁珠2次，除去干扰杂质。最后加入ImL甲醇洗脱，收集洗脱液，用 HPLC法按照GB/T 25220-2010检测待测样品中赭曲霉毒素 A的含量。结果见表1。
[0063] 表1免疫磁珠的特性检测结果
[0065] 结果表明：①空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出赭曲霉毒素 A ;②当标准品量 在5ng~20ng之间时，用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素 A分别为4. 73ng、9. 37ng、13. 05ng、 17. 88ng，回收率均达到了 85%以上；③当标准品量大于20ng时，免疫磁珠偶联上的赭曲霉 毒素 A趋向饱和，回收率反而下降。说明用于赭曲霉毒素 A富集净化的免疫磁珠对赭曲霉 毒素 A的富集率为20ng/mg (每毫克免疫磁珠可以捕获20ng赭曲霉毒素 A)，对赭曲霉毒素 A的回收率达到85%以上。
[0066] 实施例3免疫磁珠的使用方法
[0067] 1、样品前处理
[0068] 谷物、伺料样品：用均质器均质样品；称取5g(精确到0.0 lg)样品至样品瓶中，加 入I. 5g氯化钠和30mL 60%甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床震荡20min，3000g以 上，室温（20-25°C /68-77 °F )离心5min ;吸取5mL离心上清液，加入5mL去离子水，混匀， 待用。
[0069] 2、免疫磁珠捕获
[0070] 取赭曲霉毒素 A免疫磁珠 0. 2mL于IOmL离心管中，用5mL去离子水润洗2次，每 次用磁分离架分离洗液（每次在磁分离架上静置3min，确保磁珠全部吸附）；向润洗好的赭 曲霉毒素 A免疫磁珠中加入处理好的样品5mL，混匀，25°C捕获20min，期间5min混匀一下 磁珠；用磁分离架分离免疫磁珠，用5mL去离子水润洗免疫磁珠2次（方法同前）。
[0071] 3、免疫磁珠洗脱
[0072] 用ImL甲醇洗免疫磁珠，混匀，静置lmin，用磁分离架分离免疫磁珠，回收甲醇液， 即为富集净化后的赭曲霉毒素 A样品，可应用于化学分析仪器检测（HPLC，高效液相色谱 法）、酶联免疫吸附法检测或胶体金测试条的快速测试。
【主权项】
1. 一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠上偶联有 赭曲霉毒素A单克隆抗体；所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是用赭曲霉毒素A人工抗原免疫 白鼠所得到的；所述赭曲霉毒素A人工抗原是赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白的偶联物，其 分子结构式如式I所不：2. 根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述赭曲霉毒素A人工抗原是按照 如下方法制备得到的： 18mg赭曲霉毒素A半抗原溶于lmLN,N-二甲基甲酰胺中，50mg载体蛋白溶于 3. 75mL0.lmol/L的CB缓冲液（pH9. 6)中，将半抗原溶液加入到蛋白溶液中，4°C搅拌反应 24h;再加入0. 25mLlmol/L的赖氨酸溶液（pH7. 0)，4°C反应2h，将得到的产物透析，得到所 述赭曲霉毒素A人工抗原； 所述赭曲霉毒素A半抗原的分子结构式如式II所示：3. 根据权利要求1或2所述的免疫磁珠，其特征在于：所述赭曲霉毒素A半抗原是按 照如下方法制备得到的：I、将l〇〇mg赭曲霉毒素A溶于5mL丙酮中，再加入50yL3-溴 丙缩醛和40mg碳酸钾，回流反应5h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，分去水相，加无水硫 酸钠干燥蒸干，得到粗产物，加石油醚洗涤结晶，得到中间产物；II、将中间产物加乙醇溶解 后，再加入2mL稀盐酸和5mL蒸馏水，60°C反应4h，停止反应，加氢氧化钠水溶液调节pH到 6,加二氯甲烷萃取，蒸干，加乙醚重结晶，得到赭曲霉毒素A半抗原。4. 一种权利要求1所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：以粒径2. 8μm的羧基磁珠 为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂H)C-NHS组合处理后，活化磁 珠可与赭曲霉毒素A单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化赭曲霉毒素A的免疫磁珠。5. 根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤： (1)清洗：取100yL羧基磁珠于离心管中，用100yL含0.05%吐温-20的pH5.0、 25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清； ⑵活化：用4°C贮存的pH5. 0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶 液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化 30min，磁分离后移除上清，同（l)MES溶液洗涤2-3次； (3)偶联：将赭曲霉毒素A单克隆抗体溶解到60yLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用 所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4°C偶联 2h，期间使磁珠保持混匀状态； ⑷封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7. 4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠； (5)保存：磁分离后移除上清，用100yL含0. 1%-0.3%牛血清白蛋白、0. 1%吐温-20 的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0. 1 % -0. 5% 牛血清白蛋白、0. 01% -0. 1%吐温-20、0. 02%NaNj9TRIS溶液中，2-8°C保存备用。6.权利要求1所述免疫磁珠在富集净化赭曲霉毒素A中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，它是以羧基磁珠为载体，赭曲霉毒素A单克隆抗体为识别中间体，经过活化-偶联-洗涤-封闭的过程制备出偶联有赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫磁珠，在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的赭曲霉毒素A。本发明用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠具有浓缩待测样品中赭曲霉毒素A浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。
【IPC分类】G01N1/34, G01N33/577, G01N33/68
【公开号】CN105301252
【申请号】CN201510562641
【发明人】崔海峰, 徐念琴, 冯静, 崔廷婷, 彭鸽, 朱亮亮, 张瑜, 万宇平
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月7日