专利名称：鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用反义基因技术改造野生核型多角体病毒(NPV)，构建鳞翅目害虫新型NPV的方法。
背景技术：
鳞翅目昆虫，如尺蠖、毛虫等，是为害农作物的重要害虫种类之一。这些害虫大量发生时，造成作物严重减产和品质劣化。因此，尺蠖等鳞翅目昆虫是农作物生产上的重要防治对象之一。目前生产上应用的农药主要有两类一类是化学合成农药，如菊酯类农药、有机磷农药和杀虫脲等；另一类是生物农药，如核型多角体病毒(NPV)制剂、苏云金杆菌(Bt)制剂以及一些捕食性昆虫等。化学合成农药，防治速度快、效果好，但容易引起农产品的农药残留、环境污染以及害虫的抗药性问题。生物农药NPV属于昆虫杆状病毒，其外被为多角体蛋白，其内为双链环状DNA分子。游离NPV病毒粒子可通过昆虫进食和体壁创伤感染；而具有包含体的NPV病毒只能由昆虫进食感染，进入害虫中肠的NPV粒子在消化液的作用下，多角体蛋白被破坏并释放出游离病毒粒子，之后通过附着、融合、去壳等过程进入害虫细胞，并在核中大量复制并利用宿主细胞核糖体合成多角体包装成完整的NPV。受NPV侵染的害虫逐渐出现拒食等症状，最终死亡。但是，野生型的NPV病毒株侵染后潜伏期长，杀虫速度慢，防治效果不理想。因此，NPV生物农药在实际生产中推广应用还比较有限。在大力倡导无公害、绿色和有机农产品的今天，新型高毒力NPV的构建和生产具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明技术基于以下两个事实①几丁质是尺蠖等鳞翅目害虫的卵膜、蛹壳、幼虫表皮和中肠围食膜以及成虫体壁等组织的重要组分。而几丁质是由尿嘧啶二磷酸-N-乙酰-葡糖胺通过β-1，4方式连接形成的聚合物，该反应由几丁质合成酶(CS)催化完成。CS为大分子量的细胞膜结合蛋白，主要由位于细胞膜内侧的催化活性中心和多个亲脂跨膜区域组成。而且该酶的催化活性中心和亲脂跨膜区域相当保守。②反义基因技术是将一段与宿主细胞基因核苷酸组成互补且方向相反的序列，通过基因工程技术导入宿主细胞并表达。通过反义基因mRNA与靶基因mRNA互补配对而抑制目标蛋白的合成，从而导致基因转录后沉默。
本发明的思路是利用现代分子生物学手段，将鳞翅目害虫CS反义基因(CSr)导入NPV，形成包含CSr序列的重组NPV(NPV-CSr)，利用NPV本身的侵染和表达系统，使CS反义基因在鳞翅目害虫细胞中表达，抑制害虫自身内源CS基因的表达活性，从而使害虫无法正常合成几丁质。缺乏几丁质合成的尺蠖等鳞翅目害虫将无法形成正常的细胞壁，不能进行有效的细胞分裂和生长，而且害虫重要的消化器官“中肠围食膜”也因为缺乏几丁质而丧失正常消化功能。由于害虫细胞无法形成正常的细胞壁，改造后的新型NPV具有更快的扩散和再侵染速度，同时具有更高毒力。
本发明的技术路线是在克隆尺蠖等鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)基因保守序列的基础上，根据反义基因技术的原理，构建包含鳞翅目害虫CS反义基因序列的转移载体，并通过同源重组将CS反义基因成功导入NPV基因组，通过筛选、验证获得快速、高效杀灭鳞翅目害虫的重组NPV。
本发明方案主要包括以下几个步骤1、根据鳞翅目害虫CS基因保守序列设计2-4对包含酶切位点的特异引物，提取害虫mRNA，并进行RT-PCR，获得CS基因保守序列，并进行序列分析验证；2、将验证后的CS基因RT-PCR产物纯化后连入pUCm-T载体，并转化大肠杆菌，经过抗性筛选和PCR验证，获得包含CS保守序列的T载体(pUCm-T-CS)；3、以特异的内切酶酶切pUCm-T-CS载体回收包含CS基因的特异片段，并反向导入同样酶切后的包含多角体基因(ph)的NPV转移载体pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr；4、将pFASTBacI-ph-CSr转化包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，形成重组的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)；5、NPV-CSr侵染草地夜蛾细胞株sf9扩增，获得完整的重组病毒；6、通过PCR方法对重组NPV进行验证，以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。
上述步骤进一步叙述如下①.尺蠖等鳞翅目害虫CS保守序列克隆根据鳞翅目害虫CS基因保守序列设计2-4对包含酶切位点的特异引物，提取害虫mRNA，并进行RT-PCR，获得CS基因保守序列，并进行序列分析验证。CS基因RT-PCR产物纯化后连入pUCm-T载体，并转化大肠杆菌，经过抗性筛选和PCR验证，获得包含CS保守序列的T载体(pUCm-T-CS)。
②.鳞翅目害虫反义CS基因转移载体构建以特异的内切酶酶切pUCm-T-CS载体回收包含CS基因的特异片段，并反向导入同样酶切后的包含多角体基因(ph)的NPV转移载体pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr。
③.重组NPV将pFASTBacI-ph-CSr转化包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，形成重组的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)，并以NPV-CSr侵染草地夜蛾细胞株sf9，获得完整的重组病毒。
④.新型重组NPV-CSr病毒分子生物学验证和杀虫能力评价通过PCR等方法对重组NPV进行验证；以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。
图1为本发明方法的流程框图。
具体实施例方式
实施例 含茶尺蠖几丁质合成酶(CS)反义基因序列的NPV构建方法1)取3龄茶尺蠖幼虫1条约100mg，以Trizol(Invitrogen公司)试剂提取总RNA，电泳检测RNA质量，并以GENQUENT分析RNA浓度。具体操作参照试剂和仪器说明；2)以MMLV第一链cDNA合成试剂盒合成茶尺蠖幼虫cDNA第一链，具体操作参照试剂盒说明；3)以包含酶切位点的以下引物对进行RT-PCR，PCR条件如表1；L 5’AA
TTCGAATACGCCATCGGCCATTGG (划线部分为Xba I酶切位点)R 5’AA
CCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(划线部分为BamH I酶切位点)表1
4)上述PCR后获208bp左右CS目标产物(含酶切位点序列)，经纯化后与pUCm-T于16℃条件下连接过夜，连接产物转化感受态DH5α，经蓝白斑筛选，以菌落PCR方法进行连接结果验证，同时进行序列分析(序列分析委托上海联合基因公司进行)，具体序列如下
CS序列(包含酶切位点)AATCTAGATT CGAATACGCC ATCGGCCATT GGCTGCAAAA GGCCACGGAGCACATGATTGG CTGCGTGCTC TGTTCACCTG GATGCTTCTC CCTGTTCAGGGGCAAGGCCC TCATGGATGA CAATGTGATG AAGAAATACA CGACACGGTCGGATGAGGCT CGTCACTACG TGCAGTACGA TCAGGGCGAG GATCGTTGGGGATCCTT5)阳性菌落经扩繁后，抽提质粒。对质粒进行Xba I、BamH I双酶切并回收目标片段(该序列中BamH I酶切位点位于Xba I之后)；同时以Xba I、BamH I对包含多角体基因(ph)的NPV转移载体pFASTBacI-ph(该载体中BamH I酶切位点位于Xba I之前)进行双酶切，并回收目标片段；并将两个目标进行反向连接，获包含反义几丁质合成酶序列(CSr)的转移载体(pFASTBacI-ph-CSr)。
6)将pFASTBacI-ph-CSr转化包含NPV DNA和帮助质粒的感受态大肠杆菌细胞DH10Bac(Invitrogen公司)，并筛选重组子，获含反义CS的NPV DNA(NPV-CSr)。
7)将NPV-CSr侵染草地夜蛾细胞株sf9，获得完整的重组病毒。
8)以不包含外源CS反义序列的野生NPV为对照，比较重组病毒(NPV-CSr)对尺蠖幼虫的侵染和毒杀能力的差异。具体做法为将上述培养获得的重组NPV以及野生NPV病毒配制成1×104PIB/ml溶液，直接注射3龄尺蠖幼虫(每头注射2μl，每个处理30头尺蠖，重复3次)，定时进行观察并统计尺蠖死亡情况。结果显示，含CSr的重组病毒侵染尺蠖后，潜伏期缩短1天以上，茶尺蠖感染病毒后前期死亡率超过野生型对照30％以上。
上述结果显示，利用本方法进行NPV改造，并获得高毒力NPV的技术是成功的。
权利要求
1.鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法，其特征在于如下步骤(1)根据鳞翅目害虫CS基因保守序列设计2-4对包含酶切位点的特异引物，提取害虫mRNA，并进行RT-PCR，获得CS基因保守序列，并进行序列分析验证；(2)将验证后的CS基因RT-PCR产物纯化后连入pUCm-T载体，并转化大肠杆菌，经过抗性筛选和PCR验证，获得包含CS保守序列的T载体(pUCm-T-CS)；(3)以特异的内切酶酶切pUCm-T-CS载体回收包含CS基因的特异片段，并反向导入同样酶切后的包含多角体基因(ph)的NPV转移载体pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr；(4)将pFASTBacI-ph-CSr转化包含NPV DNA和帮助质粒的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，形成重组的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)；(5)NPV-CSr侵染草地夜蛾细胞株sf9扩增，获得完整的重组病毒；(6)通过PCR方法对重组NPV进行验证，以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。
2.按权利要求1所述的鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法，其特征在于按照本方法获得的重组NPV应用于鳞翅目害虫的防治。
全文摘要
鳞翅目害虫核型多角体病毒的改造方法属于生物技术领域，涉及一种利用反义基因技术改造野生核型多角体病毒(NPV)，构建新型鳞翅目害虫NPV的方法。发明方案主要包括以下几个步骤①尺蠖等鳞翅目害虫几丁质合成酶(CS)保守序列克隆；②鳞翅目害虫反义CS基因转移载体构建；③重组NPV；④通过PCR等方法对重组NPV进行验证；⑤以野生NPV病毒为对照，对重组NPV进行杀虫能力评价和筛选，获得高毒力的重组NPV病毒株。用本发明方法改造后的NPV具有更快的扩散和再侵染速度，并对鳞翅目害虫具有更高毒力。
文档编号A01N63/00GK1804031SQ20051006213
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者陆建良, 林晨, 梁月荣, 张广辉, 杜颖颖, 叶俭惠 申请人:浙江大学