专利名称：：湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植株再生方法
技术领域：
：本发明属林业中的通过组织培养的植物再生
技术领域：
，具体涉及一种湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植抹再生方法。二、
背景技术：
湿地松(TV/wseJ7iot"iEnglem)原产美国东南部，力。勒比松(尸i/7〃scari6aesMorelet)原产古巴和洪都拉斯等南美洲国家，20世纪30年代少量引进我国，60年代以后我国在广东省湛江地区引种湿地松和古巴加勒比松。湿地松在中国的适应范围广，较抗寒，可以种植到河南南阳、信阳，山东半岛部分地区；而加勒比松耐寒性较弱，在北绵23度以北地区栽培经常遭到冻害。天然状态下未见两种间存在种间杂交种的报道。引种的两个树种在我国都生长迅速，且两种引种的植才朱花期相遇，20世纪80年代前后，国内开始湿地松和加勒比松的杂交育种研究，培育出了少量的湿地松和加勒比松杂交种。湿地松和加勒比松杂种(简称杂交松)显示出比亲本更为速生的优良特性，具备两个亲本生长快，干形通直，耐水湿与耐贫瘠沙地，且抗风性也较强的特性，显示出湿地松与加勒比松杂种的巨大潜力。但是，杂交制种种子来源有限，无性扦插繁殖相对專交困难，限制了这一优良杂交种的推广应用。林木组织培养技术具有繁殖周期短、繁殖数量大、受天然环境影响小、适合大规模生产等优点。我国植物组织培养研究起步较早，到上世纪70年代以后已在一些领域中处于国际先进水平。近20年来，植物组织培养技术有了极大的进展，其中木本植物的组织培养也取得了巨大的成就，如花药培养、茎尖与嫩叶培养、幼胚培养、原生质体培养、体细胞杂交、突变体筛选、脱毒培养、人工种子等方面进展十分迅速。但是，由于针叶树生长周期长，再生难度大，细胞胚胎发生植林再生过程复杂，不同树种间体细胞胚植抹再生条件和频率差异较大，因此研究进展緩慢。目前的研究进展通常认为，针叶树细胞胚胎发生植林再生过程包括以下4个主要步骤一、胚性愈伤的诱导诱导出稳定的具有形态发生能力的胚性愈伤组织是体胚发生的基础。松柏类植物中，影响胚性愈伤组织诱导的重要因素包括外植体的年龄和生理状态、基因型、基本培养基、植物激素的种类和浓度、碳源以及温度条件等。胚性愈伤的诱导一般在含有较高浓度的生长素(如10mg/L2,4-D)和较高浓度的细胞分裂素(如5mg/LBA)的固体培养基上进行。Tautorus等(1991)认为，胚性愈伤的诱导是外植体细胞重排其发育方向、由分化状态转化为脱分化状态的过程。针叶树可选择雌配子体、未成熟胚、成熟胚、、幼龄无菌，上的子叶、上、下胚，、芽或般来说分化程度低的组织有利于胚性愈伤组织的诱导，随着组织的发育和成熟，诱导率逐渐降低。对于松属树种来说，子叶前合子胚最适于胚性愈伤组织的诱导，但用该材料作为外植体通常会受到严格发育季节的限制。在此情况下，一般考虑将发育成熟的外植体用冷处理或激素预处理来提高胚性愈伤组织的诱导率。基本培养基和基因型是影响胚性愈伤组织诱导及形态发生的另外两个重要因素。不同品种间甚至同一品种内的不同基因型之间，诱导产生胚性愈伤组织的能力都有很大差异。在松柏类植物的组织培养中，目前还没有建立一种像在被子植物组织培养中被广泛采用的MS培养基一样的培养基。MS培养基在许多研究中被证明不合适用于松柏类植物的组织培养。因此，研究者纷纷对MS培养基进行改良，同时也设计了一些新的基本培养基，其中比较重要的有DCR、GD、BMS、LM、LP、画CL、P6及SH等。二、胚性愈伤组织的继代和增殖胚性愈伤组织的保持和增殖，通常在组成成分与诱导胚性愈伤的培养基相同但降低激素浓度(通常各降低10倍)的固体或液体培养基上进行。在固体培养基上增殖时12~18天继代一次，在液体培养基上增殖时要缩短继代时间。研究表明，在多数情况下，2,4-D是诱导体细胞胚发生的必要条件但长时间培养在含2,4-D的培养基上，易造成体细胞胚成熟能力的丧失。因而在增殖阶段，用NAA代替2,4-D更有利于体细胞胚的发生。Lulsdorf等(1993)认为，将增殖的胚性愈伤组织转移到成分相同但渗透压更高的培养基上，有利于形成粗壮的后期原胚，并且在内地云杉和黑云杉的研究中发现，和固体培养基相比，液体培养条件下的胚性愈伤组织增殖速度更快。三、体细胞胚的发育和成熟体细胞胚的成熟是反映体细胞胚在生理学及形态学上具有萌发和早期发育的能力。目前，人们对植物体细胞胚在生理学及形态学上具有萌发和早期发育的能力。目前，人们对植物体细胞胚成熟的机理了解甚少。从已有的报道来看，能够成熟的体细胞胚在早期体细胞胚中所占的比例很低，并且在不同基因型间的差异很大。但是Robert等(1990)发现，在体细胞胚成熟培养基中添加一定浓度的ABA有利于体细胞胚的成熟。Robert等(1991)在内地云杉的研究中发现，体细胞胚发育的程度依赖于培养基中ABA的浓度培养基中无ABA时，早期体细胞胚停止发育；随着ABA浓度的升高，体细胞胚出现一系列的形态学变化，小于lOumol的低浓度ABA导致形成瘦弱的芽状体胚，10-20nmol的中等浓度ABA导致形成早熟的双极性体胚，30-40iamol的高浓度ABA导致形成停止发育、进入休眠期的子叶形体细胞胚。在ABA+IBA的条件下，体细胞胚的同步化程度提高，成熟胚的数量也明显增加。一般认为，ABA的作用机理是促进细胞内淀粉、脂类和蛋白质等储存物资的积累，从而促进体细胞胚的成熟。此外，ABA还有中止裂生多胚(Cleavagepolyembryony)继续产生并抑制体细胞胚早成熟萌发。由于活性炭有吸附细胞产生代谢废物及培养基中部分激素的功能，在此阶段培养基中加入活性炭，可改善子叶胚顶端分生组织发育的作用，使其更加接近合子胚。四、体细胞胚的萌发和植纟朱再生Attree等(1993)认为，针叶树体细胞胚的萌发是指体细胞胚成熟后生长发育成再生植抹的过程，它包括根、子叶和胚轴的伸长。促进体细胞胚萌发的方法是将体细胞胚转移到无激素或极低浓度的激素，其有机成分及渗透压均降低。Becwar等(1990)认为这种转移是保证体细胞胚萌发的关键。他们还发现，将挪威云杉成熟体细胞胚进行倒置培养，可获得高达56%的萌发率。体细胞胚的诱导及体细胞胚的成熟是在黑暗及弱光条件下完成的。但体细胞胚的萌发则需要光照条件。在萌发培养基上光照培养2个月后，大部分生长为高约2cm的根部、胚轴和子叶均发育良好的小植抹。加勒比松(尸fmwcan'k/e")(1992)、辐射松(ft'm^raW加a)(1995)、津唐*>(P/mw/aw6eW/awa)(1986)和展叶木>(尸/mwpfl^/a)(1993)等松属植物的体细胞胚的萌发也是在光照条件下完成的。有关大规模针叶松体细胞胚再生植抹田间试验的研究报道不多。Becwar等(19卯)研究了6个基因型挪威云杉幼苗的生长情况。Webster等(1991)研究了71个基因型内地云杉体细胞胚再生植林在田间的生长情况。他们发现，大多数基因型体细胞胚再生植抹经温室过渡后，移栽成活率高于80%。David等(1989)在加勒比松的体细胞胚再生植林的移栽试验中也获得了高于60%的成活率。因此，他们认为来自体细胞胚发生的优质针叶树种苗完全可以用于山地造林和园^木种才直。唐巍等(1997)认为，尽管松柏类植物组织培养形态发生的研究取得了可喜的进展，但研究中尚存在一些问题，具体包括(1)缺乏良好的研究形态发生的组织培养模式系统；(2)没有建立起适用范围较广的松柏类植物组织培养的基本培养基；(3)外植体的选择仍局限于合子胚等幼嫩组织；(4)胚性愈伤组织及体细胞胚的诱导频率在绝大部分树种中仍末达到中等水平。自1985年Hakman等报道挪威云杉首次获得针叶树的体细胞胚胎再生植林以来，陆续报道冷杉属(JWm)、落叶松属(丄an'x)、云杉属(P/cm)、松属(i^'"tw)、黄杉属(i^ewc/owga)、金钱松属(i^ewtfo/ar/x)、红杉属(S^wo&)、杉木属的30多种针叶树上诱导出了体细胞胚胎发生。1990年，Laine和David报道加勒比松体细胞胚胎发生和植抹再生，但诱导率极低，不能批量生产优质品种的苗木。Jain(1988)报道过湿地松的体细胞胚胎发生和植抹再生。目前尚未见湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植林再生成功的报道。三、
发明内容本发明的目的是，针对当前优良湿地松和加勒比松杂交树种制种种子来源有限，无性扦插繁殖相对困难的现状，寻找湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植抹再生的有效方法，提供工业化快速繁育湿地松和加勒比松杂种苗木的成套技术，解决当前工业化造林中湿地松和加勒比松杂种苗木的紧缺问题。本发明的技术解决方案为一种湿地松与加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植林再生方法，其特征是采用湿地松与加勒比松杂种的未成熟合子胚进行体细胞胚胎发生和植林再生，其体细胞胚胎发生和植抹再生主要过程和条件如下a.体细胞胚性诱导阶段的培养基为改良P6培养基，附加植物生长素2,4-D1-2mg/L,细胞分裂素6-BAl-2mg/L;b.胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物快速增殖阶段采用多次液体和固体改良P6培养基相交替组合调控培养的方法，附加的植物激素最佳组合为l-2mg/L2,4-D,0.5-lmg/L6-BA和0.5-lmg/LKT;c.体细胞胚胎诱导阶段、胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物增殖中止阶段采用液体改良P6培养基，附加5~10mg/L脱落酸(ABA)和5~10mg/L赤霉素(GA3);d.胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物产生的体胚发育成熟阶段和体细胞胚萌发出苗阶段采用固体改良P6培养基，附加多种氨基酸、聚乙二醇(PEG8000)。外植体取样部位、时间控制和预处理条件为从种树球果获取未成熟胚，最佳采集时间为每年的6月份；为了有利于胚性愈伤的诱导，采集后的球果可用湿纱布、塑料袋包裹后，放在4'C冰箱中保存1周以上。可以使用的3种不同改良P6培养基配方分别如下改良P6培养基配方1改良P6培养基配方2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>改良P6培养基配方3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>体细胞胚性诱导阶段的最佳培养基为第三种改良P6培养基。四图1为胚性愈伤诱导启动阶段状态的显微照片；图2为胚性愈伤诱导启动阶段观察到胚头胚柄结构显微照片，图中a为胚头胚柄结构团，b为单个胚头胚柄结构的放大照片；图3中a为诱导出的胚性愈伤培养物，b为局部^:大照片；图4为诱导出的非理想状态的愈伤培养物，呈黄色或黄褐色，含水量高，不能继续分化发育；图5中的a、b、c分别为3幅未成熟胚培养物在显孩i镜下观察到的增殖胚头胚柄结构团照片；图6中的a、b为两幅成熟胚培养物在显微镜下观察到无明显的胚头胚柄结构照片；图7为肌醇浓度为5000mg/L时胚性愈伤生长不良的照片；图8中的a、b为两幅经过ABA调整的胚性细胞悬浮培养物显示与自然状态合子胚发育前期类似状态的照片；图9为体胚的发育和成熟萌发情况，a、b为体胚的发育照片，c、d为成熟萌发照片；图10为合子胚不同发育时期胚性愈伤诱导情况，横坐标表示为6月初开始采集球果的周数，纵坐标表示胚性愈伤诱导率；图11为不同培养基胚性愈伤诱导情况，配方3的诱导率相对较高，但3种配方的总体差异不是^艮大。五具体实施方式杂交松未成熟胚，采自广东某种子园，重复两个年度。自六月初开始采集球果，每周采集一次，直到八月初球果胚胎发育成熟。将采集的球果用湿纱布包裹以防球果失水，用塑料袋包好，放在4'C冰箱中保存(至少一周，低温有利于胚性愈伤的诱导)。未成熟种子去除种壳和内外种皮，先用75%酒精消毒30s,无菌水冲洗3-5次；然后用1:10的84消毒液消毒8min，无菌水沖洗3-5次。直接将带胚乳的种子接种于培养基中。以前述3种不同改良P6培养基，附加l-2mg/L2,4-D和0.5-2mg/LBA，谷氨酰胺(Glu)1000mg/L,水解酪蛋白(CH)500mg/L，肌醇1000mg/L，麦芽糖30g/L,水晶洋菜1.86g/L。a.杂交松的胚胎接种到培养基中，6周后发现，由幼胚诱导出来的胚性愈伤组织呈半透明、湿度比较大、粘性，表面呈丝状(参见附图1)。在体式镜下观察到束状胚头胚柄结构(简称ESM)培养物(参见附图2),这种ESM培养物，在适宜的培养条件下，同时具有不断自我增殖的能力和形成体细胞胚胎的能力。未成熟胚诱导的愈伤有两种状态一种为胚性愈伤，主要产生于胚柄处，水分较多、颜色浅白或者白色、半透明、结构疏松(参见附图3);另一种为非胚性愈伤组织，颜色浅黄色或者是黄色，结构疏松，表面呈结晶状，水分多(参见附图4)。合子胚的发育时期对能否实现愈伤组织的诱导、增殖和体胚形态发生十分关键。不同发育时期的未成熟合子胚诱导率差异很大。经实验表明，仅有六月初到六月中下旬的未成熟合子胚才诱导出良好的胚性愈伤组织(参见附图10)。经显微镜观察，可见诱导出来的胚性愈伤基本上已经具备了胚头胚柄细胞，而且组织分化良好，结构致密(参见附图5)。而用成熟胚诱导出的非胚性愈伤，在显微镜下观察，大部分是圆形细胞，没有明显的组织结构(参见附图6A)。虽然在后期的调整状态的过程中也可以形成胚性愈伤，有明显的胚头胚柄组织，但其转化率极低。由成熟胚诱导的培养物，在显微镜下观察到大量胚柄细胞，但没有胚头的分化(参见附图6B)。而且其状态不稳定，在增殖的过程中逐渐褐化死亡。不同的碳源对植物组织培养的影响。以麦芽糖或乳糖为碳源培养JgTO幼、对o/om/era愈伤组织，其绿苗率达76~93%,,比蔗糖高出436倍(Asano等,1994)。胡萝卜悬浮培养中也发现麦芽糖优于蔗糖(Verma等,1977)。亚麻培养物长芽以麦芽糖为好；长根则以蔗糖为佳(Millam等,1992)。本发明采用同构二糖作为碳源，代替异构二糖一_蔗糖，效果良好。不同培养基的诱导程度对胚性愈伤诱导的影响参见附图11。b.胚性愈伤的增殖阶段。使用改良的第一种基本培养基，釆用固体和液体交替培养的工艺路线。固体培养基添加lmg/L2,4-D+lmg/L6-BA+1000mg/L肌醇、lmg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+1000mg/L肌醇，液体培养基添加lmg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+5000mg/L肌醇。固体培养每14天继代一次，液体培养每7天继代一次。固体培养基用于ESM增殖和胚胎发生能力保持，液体培养基除维持胚性状态外主要用于大规模生产过程中的快速增殖，其增殖速度约为固体培养的1.5倍。在不同的激素组合中，胚性愈伤的增殖状态不一样。在与诱导培养基一致的环境中生长的胚性愈伤，其结构紧密，水分少，容易褐化，但其内部结构保持良好，胚头结构紧密，发育完整(参见附图5A-C);将6-BA变为6-BA与KT的组合，其愈伤的含水量增加，其愈伤的结构同样保持良好，只是愈伤状态比前者稍微差一点。不过在肌醇为1000mg/L的组合中，其愈伤增殖较快，褐化緩慢(参见附图3A,B);而肌醇用量增加至5000mg/L的情况下，其含水量增加1.5-2倍，从愈伤外形看，结构不紧密，刺状突起减少(参见附图7)。显微镜下观察，可看到其胚头胚柄细胞较刚诱导出来的愈伤结构退化。总其三种组合的表现，认为lmg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+1000mg/L肌醇的组合是适合胚性愈伤的保持与增殖的方式。c.中止胚裂生和诱导体胚发育阶段。液体培养基中，去除生长素和细胞分裂素，添加5-10mg/L脱落酸(ABA)和7,5mg/L赤霉素(GA3)。胚性愈伤经过增殖培养后，形成一个组成极其复杂的胚性状态既有未进入前子叶胚时期的各种类型的原胚，也有前子叶胚时期形成的裂生多胚，如果不继续加以控制，即使可以得到成形的子叶胚，也无法保证其质量。因此在液体培养基使用5-10mg/L高浓度ABA,中止胚性悬浮培养物中的裂生多胚进程。该阶段胚性悬浮系增殖停止，开始胚胎发育过程。通过ABA的作用，中止裂生多胚，从而使得原胚可以继续发育，形成球形胚，并且可使球型胚的同步化效果更好。实验结果表明，经过3-4周的液体ABA悬浮调整，胚性与愈伤的状态基本上都形成球形胚，其胚头细胞结构更加紧密，体积变大，同时胚柄细胞变的修长且有紧密，与合子胚发育过程中的前子叶期类似(参见附图8)。d.体细胞胚成熟阶l殳。固体培养基中，添加5-10mg/L脱落酸ABA和7.5mg/L赤霉素GA3，170g/L聚乙二醇PEG800，活性炭lg/L，同时添加多种氨基酸成分，两个月继代一次。在由液体培养转到固体培养的时候，要注意其培养基水分不要太多，以免影响到促进体细胞胚胎发生过程中的干化处理。在体细胞胚的分化培养中加入ABA可以明显地促进体细胞胚成熟在针叶树体细胞胚分化。体细胞胚发育的程度依赖于培养基中ABA的浓度培养基中无或者低浓度ABA时，体细胞胚停止发育，褐化死亡；当ABA浓度增加到5-10mg/L时，体细胞胚胎发生一定的形态变化。从形态上，原来呈透明状分布在培养基中的愈伤，可明显观察到其细胞内含物增加，呈现深黄色，可分辨出一个个的有结构的组织来(参见附图9A,B)。在培养一个月以后，可观察到3-5mm子叶胚的形成(参见附图9C，D)。培养基中加入一定浓度的活性炭，对体细胞胚的分化和发育有一定的促进作用。Gupta等的研究表明，在含有ABA的分化培养基中加入活性炭，有改善子叶胚顶端分生组织发育的作用，使其发育更加接近合子胚。渗透压对针叶树后期体细胞胚的发育有重要的影响作用。最早用来提高低分子量的渗透剂其作用效果不如分子量较大的聚乙二醇(PEG)。Attree等(1987)认为，这主要是因为低分子量的物质能离体培养条件下水分胁迫的方法是加入高浓度的糖和盐。然而，象蔗糖、盐以及甘露醇这些低分子量的物质可以透过细胞质膜被共质体吸收，使细胞的渗透值得到恢复，达不到水分胁迫的目的。因此就选用了高分子量的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖作为代替物，长以产生长时间的水分胁迫，效果较好。体细胞胚培养成熟到3-5mm子叶胚的形成后，即可使用常规培养方法进入植林再生和育苗阶段。本发明提供了一种工业化快速繁育湿地松和加勒比松杂种苗木的成套技术，可以解决当前湿地松和加勒比松杂种造林中苗木的紧缺问题。也为建立能被普遍接受的松柏类植物组织培养形态发生模式系统，为多种重要松柏类植物的离体繁殖、遗传转化和品种改良研究提供了重要的实践基础，可使刚刚起步的无性系林业更多更快地造福于人类社会。权利要求1.一种湿地松与加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征是采用湿地松与加勒比松杂种的未成熟合子胚进行体细胞胚胎发生和植株再生，体细胞胚胎发生和植株再生主要过程和条件如下a.体细胞胚性诱导阶段的培养基为改良P6培养基，附加植物生长素2，4-D1-2mg/L，细胞分裂素6-BA1-2mg/L；b.胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物快速增殖阶段采用多次液体和固体改良P6培养基相交替组合调控培养的方法，附加的植物激素最佳组合为1-2mg/L2，4-D，0.5-1mg/L6-BA和0.5-lmg/LKT；c.体细胞胚胎诱导阶段、胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物增殖中止阶段采用液体改良P6培养基，附加5～10mg/L脱落酸(ABA)和5～10mg/L赤霉素(GA3)；d.胚头胚柄结构(ESM)胚性培养物产生的体胚发育成熟阶段和体细胞胚萌发出苗阶段采用固体改良P6培养基，附加多种氨基酸、聚乙二醇(PEG8000)。2.如权利要求1所述的湿地松与加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植抹再生方法，其特征是外植体取样部位、时间控制和预处理条件为a.从种树球果获取未成熟胚，最佳采集时间为每年的6月份；b.采集后的球果用湿纱布、塑料袋包裹后，放在4。C冰箱中保存1周以上。3.如权利要求1所述的湿地松与加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植林再生方法，其特征是体细胞胚性诱导阶段的最佳培养基配方如下KN。31250mg/LMgS04.7H20400mg/LCaCl2.2H20200mg/LKH2P04340mg/LKI1mg/L5mg/LZnS04.7H208mg/LMnS04.4H2015.8mg/LNa2Mo04.2H200.2mg/LCuS04.5H200.024mg/LCoCl2,6H200,02mg/LFeS04.7H2027.85mg/LNa2-EDTA37.25mg/L肌醇100mg/L烟酸0.5mg/L盐酸硫胺素1.0mg/L盐酸吡哆醇0.5mg/L甘氨酸2.0mg/L添加氨基酸如下L-proline100mg/LL-asparagine100mg/LL-arginineHCl50mg/LL-alanine20mg/LL-serine20mg/L'全文摘要一种湿地松与加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征是采用湿地松与加勒比松杂种的未成熟合子胚进行体细胞胚胎发生和植株再生，其体细胞胚胎发生和植株再生过程中使用多次液体和固体改良P6培养基相交替组合调控培养的方法，附加适量的植物激素组合。本发明提供了一种工业化快速繁育湿地松和加勒比松杂种苗木的成套技术，可以解决当前湿地松和加勒比松杂种造林中苗木的紧缺问题。文档编号A01H4/00GK101218894SQ20071013270公开日2008年7月16日申请日期2007年9月26日优先权日2007年9月26日发明者敏于,席梦利,施季森,赵奋成,边黎明申请人:南京林业大学