专利名称：水稻蛋白OsCPN1及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻蛋白OsCPm及其编码基因与 应用。
背景技术：
土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。全世界共有10亿公顷的盐碱地， 约占世界陆地面积7. 6%，我国盐碱地近1亿多公顷，农业耕地因盐渍化引起的减产、弃耕 地就近333. 5万公顷。近年来，我国设施农业的快速发展，特别是蔬菜和花卉大棚生产面积 不断扩大，据统计，2005年全国蔬菜、花卉、瓜果等作物设施栽培面积达210万公顷。设施农 业的发展为农业生产结构调整和提高农业生产效益发挥了重要作用，但是随着设施栽培时 间延长，土壤次生盐渍化的问题日益加剧，严重影响了设施栽培作物的产量和品质，效益也 随之下降，从而影响设施农业的健康发展。解决设施栽培土壤盐渍化一般采取以下两种措 施，一是用石膏和硫磺等化学方法或用排水和灌溉洗盐等物理方法改良土壤；二是通过常 规育种或生物技术手段培育耐盐作物品种，而前者投入成本高。通过培育适宜在盐碱地区 栽培和设施栽培的农作物抗盐新品种将不仅能有效解决设施栽培土壤盐渍化问题，而且还 能通过有效利用部分盐渍化土地而大大地缓解我国土地资源匮乏的问题。近年来，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成，植物基因组学研究已转入 到功能基因组学。目前一些研究功能基因组学的新方法和实验技术体系如cDNA微阵列、 基因芯片、基因表达系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、基因高支除 (gene knockout)和RNAi分析均能有效分析大量基因的表达和功能模式，并在耐盐性相 关功能基因资源发掘上取得了一定进展。一些与渗透调节相关基因已从不同植物种类中 被成功克隆并转化应用，如脯氨酸合成相关基因P5CS (Kishor PBK, Hong Z，Miao G H，Hu CAA, Verma DPS.Overexpression of P5CS increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol, 1995,108 :1387_1394)和甜菜喊 脱氢酶BADH基因(肖岗，张耕耘，刘凤华等，山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因研究，科学通报， 1995,40(8) :741-745)。植物体内Na+离子平衡是植物自身耐盐调节的重要机制。朱健康研究小组发现拟 南芥SOS基因系列的调控信号是植物自身调节Na+离子平衡的重要途径之一。2005年，林 鸿宣研究小组与美国栾升教授合作，成功克隆了水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1。该基 因能控制水稻植株地上部钠离子和钾离子的含量，维持钠和钾离子平衡，使过量钠离子不 在茎叶等部位积累，并使钠离子回流到根部，减轻钠离子毒害，同时增加营养元素钾离子， 从而增加水稻耐盐性。
发明内容
本发明提供了一种水稻蛋白，名称为OsCPm，它是一个受盐诱导表达方式的蛋白， 有助于提高水稻耐高盐性能。
一种水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO 1所述的氨基酸序列。该蛋白能够上调超过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶活性，清除因高 盐胁迫产生的过多的活性氧(超氧离子或过氧化氢)，维持细胞体内活性氧水平在正常范 围内，保护幼苗、植株免遭因高盐引发的氧化损伤，提高植物抗逆能力。根据上述水稻蛋白OsCPm的氨基酸序列，通过NCBI和TIGER数据库搜索，比对到 编码水稻伴侣蛋白的基因OsCPm (Qryza sativa Chaneronin丄)，基因OsCPm的基因号为 0s06g0114000 (ID 4339910)，该基因的开放阅读框(ORF)为1806bp，具有序列表中SEQ ID NO :2所述的核苷酸序列；mRNA长度为2130bp，具有序列表中SEQ ID NO :3所述的核苷酸序 列。本发明还提供一种编码上述水稻蛋白的基因以及该基因在提高植物耐盐性能中 的应用。所述的植物优选为水稻、拟南芥、草莓、辣椒、茄子、一串红或非洲菊。上述基因应用于提高植物耐高盐的性能，具体操作优选如下(1)将编码所述的水稻蛋白OsCPm的基因连接到载体中，得到重组载体；(2)将重组载体通过农杆菌介导转化到目标植物中；(3)筛选得到具有耐盐性能的植株。本发明水稻蛋白可以提高水稻耐高盐性能，将编码该蛋白的基因导入其它植物当 中，如草莓、辣椒、茄子、一串红、非洲菊、水稻和拟南芥等，也有可能提高这些植物的耐盐性 能。通过上述手段，可以增加作物在盐碱地上的产量，提高我国滨海地区的盐碱地的利用， 提高其产量和品质，增加农民收入。
具体实施例方式基因的获得(1)以杂交水稻耐盐组合汕优10号和盐敏感组合两优培九为材料，将它们的种子 播在含IOOmM NaCl溶液浸湿滤纸培养皿中，置于30°C培养箱中发芽，每天更换盐溶液，以 保持盐浓度基本一致。待幼苗生长至10d，分别收集汕优10号和两优培九幼苗的叶片。(2)用冷丙酮 / 三氯乙酸沉淀法(Salekdeh G H，Siopongco J，Wade L J， Ghareyazie B, Bennett J. A proteomic approach to analyzing drought—and salt-responsiveness in rice. Field Crop Res, 2002, 76 (2-3) 199-219)快速提取叶总 蛋白，具体操作如下1)水稻叶片用液氮研磨成细粉，分装入1.5ml离心管中，加入Iml蛋白提取液 1(含10%三氯乙酸和0.07% β-巯基乙醇的丙酮溶液)在-20°C沉淀粗蛋白lh，在4°C、 13000rpm下离心20min，取沉淀，弃上清；2)然后往沉淀中加入Iml蛋白提取液II (含0. 07% β -巯基乙醇的丙酮溶液)， 在_20°C悬浮粗蛋白丸lh，在4°C、13000rpm下离心20min，取沉淀，弃上清，再重复用蛋白提 取液II，在相同条件下悬浮提取3次后，真空抽干沉淀；3)用裂解液(含 7mol/L 尿素、2mol/L 硫脲、4% Chaps (Ameresco 公司，美国)、 50mmol/L DTT(Promega公司，美国)和0. 5% pH3_10的40%两性电解质)溶解沉淀，裂解 液用量为25 μ 1裂解液/mg沉淀，然后在室温下放置lh，裂解期间不断涡旋5-6次。
(2) Iflig Bradford ^ (Bradford M Μ. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72 :248_54)用考马斯亮兰 G-250 (Sigma 公司) 测定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用双向凝胶电泳(第一向采用17cm PH7-10的IPGs干胶条(Bio-Rad公司)聚焦，第二向采用变性/SDS-2D-PAGE分离)分离。第一向等电聚焦分四步进行，第一步，电压250V 15min ；第二步，电压10000V 5h ； 第三步，电压10000V，60000Vh ；第四步，电压500V直到结束。在第一向等电聚焦向第二向转换时，需要平衡胶条，分两步进行，第一步， 在平衡液 I (含 6. Omol/L 尿素、2 % SDS (Promega 公司，美国)、0. 375mol/L pH 8. 8 Tris-HCl (Promega 公司，美国)、20%甘油和 130mmol/L DTT (Promega 公司，美国))中平衡 IOmin ；第二步，在平衡液 11(含 6. Omol/L 尿素、2% SDS (Promega 公司，美国)、0. 375mol/L pH 8. 8Tris-HCl (Promega公司，美国)、20%甘油和135mmol/L碘乙酰胺)中平衡lOmin，然 后转移到第二向SDS-2D-PAGE胶，跑胶采用恒流，每块胶的电流24mA，运行5_6h。剥离凝胶，蒸馏水短暂洗涤两次，放入胶体考马斯亮蓝染液(0. 12%考马斯亮蓝 G-250+10%硫酸铵+10%磷酸+20%乙醇)水平摇床上染色12h，然后用蒸馏水洗涤至背景 清晰。扫描后用PDQUEST (Bio-Rad公司)软件分析胶图匹配情况，结果发现在汕优10号 幼苗叶片中一个高表达蛋白点，估测其等电点和分子量分别为pi 5. 6和64KD左右。(3)在胶上切下该高表达蛋白点，加入8μ 1 IOng/μ 1胰蛋白酶(Trypsin，Roche， 美国)进行胶内消化，然后置于4°C冰箱放置40min使胶片完全吸收酶液，再补加10 μ 1 25mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)，于371温育12h，胶内蛋白质被酶解成肽段混合物。(4)在上述肽段混合物中加入30_50μ 1 5% TFA(Merk公司，德国)于40°C提取 上述酶切肽段1小时一次，再用相同体积的50% CAN和2. 5% TFA(Merk公司，德国)溶液 于30°C提取1小时一次，最后用25μ lCAN(Fischer公司，美国)超声提取一次，合并3次 提取液。真空干燥，然后用4μ1 0.5%三氟乙酸溶解，将0.6μ1溶解物用一级质谱和二级 质谱(MS+MS/MS，美国ABI公司)分析，获得肽质量指纹(P印tide MassFingerprint, PMF) 图谱，查询Mascot数据库，有22个肽段比对到水稻OsCPm蛋白，匹配序列占总氨基酸序列 35%，比对分值(107)达显著水平(高于Mascot数据库默认比对分65)。其中得到7个肽 段序列，所有离子分值(76，91，49，102，110，141，75)高于Mascot数据库默认离子比对分值 38，达到显著水平。根据已有的水稻OsCPm的氨基酸序列，通过NCBI和TIGER数据库搜索，比对到编 码水稻伴侣蛋白基因，基因号为0s06g0114000(ID4339910)。该基因的开放阅读框(ORF)为 1806bp, mRNA 长度为 2130bp。基因克隆与转化 以汕优10号幼苗(播后10天)总mRNA为模板，利用RT-PCR方法扩增到OsCPm 基因的编码序列。 具体操作如下首先，将mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录试剂盒为TaKaRa 公司的 High Fidelity PrimerScript RT-PCR Kit，反应体系 20 μ 1，依次加入 1 μ 1 20Μ 随机引物、1 μ 1 IOmM dNTP、2 μ 1总RNA和DEPC水至10 μ 1，在65°C变性5分钟，迅速在冰上冷却2分钟，稍微离心，然后依次加入4μ 1 5XPrimerScript RT buffer.O. 5μ 1 RNase inhibitor、。· 5μ 1 PrimerScript RTase 和 5 μ 1 DEPC 水。轻微混合均勻，30°C 反应 10 分 钟，42°C反应30分钟，95°C 5分钟使酶失活。为了去掉与cDNA互补的RNA链，加入1 μ 1 RNase H在37°C温育20min，_20°C保存。然后以第一链cDNA为摸板扩增目的基因OsCPm， 所用扩增配对引物OsCPNl-F, 5' -TCTAGA ATGGCTTCAA CATTCGGTGC-3，，OsCPNl-R, 5 ’ -GGTACCTCAGTACCCGTAGCCGGAGT-3 ’，PCR 反应体系为 50 μ 1，依次加入 2 X PCR buffer 25 μ 1,2. 5mM dNTPs4yl、反转 录产物 2μ 1、20μΜ 正向引物(OsCPNl-F)Iy 1、20 μ M 反向引物(OsCPNl-R) 1 μ 1,2. 5U/μ 1 Tag DNA聚合酶0. 5μ 1，最后加水至50μ 1。PCR反应条件预变性95°C 3min，变性94°C 15s， 退火55°C 15s，延伸72°C90s，30个循环，最后延伸72°C 10min，4°C保存。将回收纯化的OsCPm基因的DNA与pMD19_T载体进行连接反应，连接体系10 μ 1， 各组分分别为0. 5 μ 1 PMD19-T载体、4. 5 μ 1纯化的OsCPNl基因的DNA,5 μ 1 Solution I。 在14°C _16°C下连接8-12小时，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，将 OsCPNl基因装入pMD19-T载体后经测序正确，用TakaRa公司生产的EcoRI和HindIII酶 切，酶切体系40μ 1，包括4μ 1 10Xbuffer、8y 1已插入OsCPm基因的pMD19_T载体、1 μ 1 Xbal、l μ 1 KpnI和26 μ 1水，在37°C水浴中温育6h。用北京博大泰克生物技术公司生产的Glassmilk kit回收基因片段，操作如下 上述混合基因经凝胶电泳以后，从凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml的Eppendorf管 中。加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5min，期间轻摇Eppendorf管几次使胶完全溶化。 加入10 μ 1玻璃奶，颠倒混勻，冰浴下放置lOmin。每隔2_3min混勻1次，12000rpm离心30s， 吸弃上清。加入250 μ 1漂洗液，用移液器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混勻，12000rpm 离心30s，吸弃上清。重复漂洗1次。用枪头将剩余的漂洗液吸干净。然后，放置于37°C温 箱干燥15-20min。加入20 μ 1的无菌蒸馏水，混勻，60°C水浴5min，12000rpm离心lmin，回 收上清液，即为纯化的基因OsCPm。将回收的基因片段连入Superl300载体中，操作如下连接体系10μ 1，包括2μ 1 Superl300 载体、6μ 1 纯化的 OsCPm 基因的 DNA、1 μ 1 10 X Τ4 连接酶 buffer 和 1 μ 1 Τ4 连接酶，在4-10°C下连接12h，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，提取 质粒进行鉴定。基因片段连入Superl300载体后再转入EHA105农杆菌中，操作如下取200 μ 1农 杆菌感受态细胞，加入5-10 μ 1构建好的质粒DNA，30°C冰浴30min，液氮中速冻lmin，37°C 水浴5min，然后加入Iml YEB培养基(1升YEB培养基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋 白胨、5g 蔗糖和 0. 5g MgSO4 ·7Η20，ρΗ 7. 0)，28°C恢复培养 4h ； IOOOOg 离心 30s，弃上清， 加入0. Iml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100 μ g/ml卡那霉素和125 μ g/ml利福 平的YEB平板(1升YEB培养基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖、0. 5g MgSO4 · 7H20 和 12g 琼脂，ρΗ 7. 0)上，28°C培养约 48h。经鉴定正确后(挑取阳性克隆作为模板，用菌落PCR方法进行鉴定)，通过农杆 菌介导转化模式植物水稻，操作如下接种含有目的质粒的农杆菌菌落于10ml YEB培养基 (含0. 酵母提取物、0. 5%牛肉浸膏、0. 5%蛋白胨、0. 5%蔗糖、0. 05% MgSO4 ·7Η20、1· 2%
6琼脂、100 μ g/ml卡那霉素和125 μ g/ml利福平)中28°C、200rpm震荡培养过夜，转化前一 天按1 50接种于200ml含相同抗生素的YEB培养液中扩大培养至OD6tltl为0. 6-0. 8。取 菌液，按 2%的比例，转入新配制的无抗生素的YEB液体培养基中，6小时后，菌液0D_ 为0.2 0.5时即可用于转化。取粳稻品种爱知旭(Oryza sativa L cv Aichi Asahi)幼胚，用70%酒精浸泡 lmin，然后用0. 升汞溶液灭菌30min，再用无菌水冲洗3次，置无菌滤纸上吸干，接种于 诱导培养基(NB培养基外加2mg. ^2,4-0)上诱导愈伤组织ll_13d后继代，继代后4d用于 共培养。愈伤组织在含有lOOmol. L—1乙酰丁香酮和含目的基因质粒的农杆菌的液体培养 基中培养20min，用滤纸吸去多余的菌液后，转到含乙酰丁香酮的固体培养基上26°C暗培 养2d，经共培养的愈伤组织转移到选择培养基(NB培养基外加2mg. Lld-DjOmg. L—1潮霉 素B和头300mg. L—1头孢噻肟)上。IOd后挑选成活的愈伤组织进行复筛，抗性愈伤转移到 分化培养基(NB 培养基外加 2mg. Lld-DJmg. U\6~M,0. 5mg. L-1NAAdmg. L-1KTJOmg. Γ1 潮霉素B和头SOOmg.L—1头孢噻肟)上诱导出苗。培养温度26°C，每天光照15h。抗性植株 转到含 1/2N6 大量元素(1415mg. L^1KNO3>231. 5mg. I^1NH4SCM、83mg. L-1CaCl2 · 2Η20、92· 5mg. [1MgSO4 · 7H20、200mg. L-1KH2PO4^OOmg. L-1FeSO4 · 7H20 和 2. 2mg. L-1MnSO4 · 4H20)的无激素 培养基上使其生根。当试管苗长到约8cm高并有发达的根系时，即可移栽入土。单株收获 Tl代种子。繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因68个株系。通过农杆菌介导浸花法转化模式植物拟南芥，操作如下接种含有目的基因质粒 的农杆菌菌落于10ml YEB培养基(含0. 酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、 0. 5% 蔗糖、0. 05 % MgS04 · 7!120、1.2%琼脂、10(^8/1111 卡那霉素和 125 μ g/ml 利福平) 中28°C、200rpm震荡培养过夜，转化前一天按1 50接种于200ml含相同抗生素的YEB 培养液中扩大培养至0D600为1. 2 1. 6，约6h，5000g离心15min集菌，重悬于渗透缓冲 液，使0D600为0. 8,200ml重悬液可使用3次。转化所用浸泡液含有0. 5XMS大量元素、 0. 5XMS 微量元素、0. 5mg/L VB5、5%蔗糖、44nM 6-BA(Sigma 公司，美国)和 0. 03% Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司，美国)。将200ml含目的农杆菌的渗透转化液置于一容器中，翻转 种有拟南芥的花盆，使植株浸入含有待转化农杆菌的渗透缓冲液中，浸5分钟，缓慢取出花 盆，侧放于托盘中，盖上黑塑料布避光24小时，第二天取下塑料布，直立放置花盆。制备MS筛选平板(MS培养基外加80g/ml潮霉素和50g/ml氨苄青霉素)，转化收 获的Tl代种子经消毒后播种于筛选平板，每15cm的平板上可以筛选100 μ g左右的拟南芥 种子。4°C春化3天，平放在生长箱中培养(22°C恒温，24h光照)，7-10天后挑选在筛选培 养基上根系和地上部生长正常的阳性植株，移入正常MS培养基缓苗3-5天后移植入土壤， 单株收获T2代种子。繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因56个株系。基因功能鉴定取T3代纯合转基因株系和野生型(粳稻品种爱知旭)种子，均勻放在两层用蒸馏 水润湿的发芽纸上，在25°C光照条件下培养10d，观察幼苗生长情况。然后将转基因株系和 野生型的水稻幼苗分别移入含200mMNaCl或正常清水的发芽盒内，置于相同光温条件的培 养箱中培养。培养5d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发现在 200mM NaCl处理下，野生型水稻幼苗叶片出现白化表型，严重时幼苗白化死亡，而转OsCPm 基因株系叶片仍保持绿色。叶片最大光化学效率测定(Fv/Fm)结果表明，在200mM NaCl下，野生型幼苗地上部最大光化学效率显著降低，而转OsCPm基因株系幼苗地上部最大光化 学效率未出现明显变化，说明OsCPm基因在水稻中超量表达可以提高水稻幼苗耐盐性。
T3代纯合转基因株系和野生型(ecotype Columbia))拟南芥种子用次氯酸钠 消毒，在4°C冰箱中春化3天，然后置于温度22°C、湿度50%、连续24h光照的培养箱中培 养。培养7d后，观察幼苗生长情况。待幼苗子叶完全展开后，将转基因株系和野生型幼苗 移入含200mM NaCl和正常的MS固体培养基(含IX大量元素、IX微量元素、IX铁盐、 3%蔗糖和0.8%琼脂)上，然后置于相同光温条件(22°C、湿度50%、连续24h光照)的培 养箱中培养。培养12-15d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发 现在200mMNaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，转OsCPm基因株系幼苗叶片仍保持绿色，说 明OsCPm基因超量表达可以缓解拟南芥盐害。
权利要求
一种水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO1所述的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的水稻蛋白的基因，具有序列表中SEQ IDNO :2所述的核 苷酸序列。
3.编码权利要求1所述的水稻蛋白的基因在提高植物耐盐性能中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的植物为水稻、拟南芥、草莓、辣椒、 茄子、一串红或非洲菊。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤(1)将编码所述的水稻蛋白的基因连接到载体中，得到重组载体；(2)将重组载体通过农杆菌介导转化到目标植物中；(3)筛选得到具有耐盐性能的植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻耐盐蛋白OsCPN1，具有序列表中SEQID NO.1所述的氨基酸序列。本发明蛋白在水稻幼苗中得到过量表达，可以提高水稻幼苗耐高盐能力。若将编码该蛋白的基因转化拟南芥、辣椒、茄子、草莓、一串红、非洲菊等蔬菜、花卉等植物，有可能提高其耐高盐性能，有助于增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我国滨海地区的盐碱地的利用；克服设施条件下因土壤返盐引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质，促进农业增效和农民增收。
文档编号A01H5/00GK101942016SQ20091015583
公开日2011年1月12日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者余红, 忻雅, 方献平, 来文国, 王世恒, 王淑珍, 白宇杰, 童建新, 肖文斐, 郑桂珍, 阮松林, 马华升 申请人:杭州市农业科学研究院