专利名称：荻的组织培养基及组培方法
技术领域：
本发明涉及以荻种子为外植体，进行组织培养的培养基及组培方法。
背景技术：
荻(Miscanthus saccharif lorus (Maxim.) Benth)是禾本科芒属草本水陆两生植物。在自然环境下，荻具粗壮被鳞片的根茎，秆直立，无毛，具多节，节上具须毛，高100 400cm。分布全国各地，多生长于山谷、山坡及滩地上。荻喜光、耐寒、耐涝，抗逆性强，地上部分的生物量大。在环境保护、景观营造、生物质能源、制浆造纸、防沙固提中有巨大的潜力， 还可代替木材和塑料作制造人造板的原料等。因此，荻是开发价值很高的重要能源植物和材料植物。芒属植物的组织培养从二十世纪90年代开始陆续有报道，但多集中在芒和五节芒愈伤组织及植株再生等方面的研究。经检索，至今未发现通过荻组织培养，建立不定芽快繁体系，并繁殖生根，培育成完整植株的相关报道。
发明内容
组培快繁技术已在很多植物上作为经济、高效的繁殖方法应用，周期短、繁殖系数高、成本低，并不受时间和空间的制约。现有繁殖技术中，荻作为商业项目开发时人工繁育的成本高，而且其有效种子量少，难以大面积人工种植。为满足荻人工快速繁育、大面积丰产栽培的需要，本发明要解决的技术问题是以荻的种子为外植体，建立一种荻的不定芽诱导、增殖和诱导生根的培养基及组培快繁方法。本发明的技术问题通过如下技术方案解决荻的组织培养基，包括不同诱导时期的四种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是(1)初代培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L， 培养基的PH值为5.7;(2)不定芽诱导培养基以MS为基本培养基，附加6-BA0. 5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(3)不定芽增殖培养基以MS为基本培养基，附加6-BA0. 3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(4)诱导生根培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20 30g/L，琼脂6. 5 8. Og/L、NAA 0. 2 1. Omg/L,培养基的 pH 值为 5. 7 ；用上述培养基进行荻的组织培养方法，按如下步骤进行(1)外植体采集与消毒选取健壮的荻种子，依次进行洗涤剂清洗Imin、自来水冲洗2h、超净工作台上用75%乙醇灭菌30s、无菌水冲洗3 4次、浓度为0. 525%的NaClO 真空灭菌20min、无菌水冲洗5 6次后和用灭菌滤纸吸干种子表面水分；(2)初代培养将经步骤(1)无菌条件下获得的种子接入初代培养基中，其中前7天置于暗柜中培养，后7天置于光暗周期为光16h/暗他的条件下培养，培养温度为25 士 2°C，获得幼苗；(3)不定芽诱导将初代培养后发育健壮的幼苗切去胚根根，接入不定芽诱导培养基中，经过15d诱导培养，获得不定芽，每日光暗周期为光16h/暗他，光照强度为40 50 μ mo 1 πι 培养温度为 25士2°C ；(4)不定芽增殖培养将获得的不定芽接入不定芽增殖培养基中，经过28天增殖培养，增殖系数为10 20，观天继代1次，共继代3次；光照培养，光暗周期为光16h/暗 8h，光照强度为40 50μπιΟ1 HT2s-1,培养温度为25士2°C，培养出不定芽；(5)生根诱导选取健壮不定芽接入生根培养基中，进行生根诱导，培养21天，生根率达99% ；光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40 50 μ mol πΓ、—1，培养温度为25 士 1 °C，培养出幼苗，组培的全过程结束。本发明的有益效果是应用荻种子为外植体，用萌发后的幼苗进行不定芽诱导并进行生根培养，有效地提高荻的繁殖系数，为荻商业化生产提供充足的种苗源。与播种繁殖相比，组织培养法能有效利用种子，提高萌发率，缩短育苗周期，无菌条件下种子只需2周即可萌发，在一个为期6 个月的生长周期内组织培养法的繁殖系数为播种繁殖的100 150倍。
具体实施例方式本发明下面结合实施例作进一步详述本荻不定芽诱导和不定芽增殖的培养基中，选用MS作基本培养基，这是经过用MS、1/2MS、B5、N6四种基本培养基各自均附加蔗糖 20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L、6_BA即6-氨基腺嘌呤0 2. Omg/L, KT即激动素0 2. Omg/L、NAA即α -萘乙酸0 0. lmg/L, pH值5. 7，进行试验，每组重复3次，每种基本培养基有20个外植体的对比试验得出的。因用MS作基本培养基中处理28天后，不定芽发育最好，诱导的不定芽数最多，质量最好，决定选用MS作基本培养基。总之，本发明所公开的培养基其配比值、温度、凝固剂等也可用诸如白砂糖、水晶洋菜等替代，培养基各原料的配比值也可分别采用本发明最佳方案定值的接近值取代。下面给出的是本发明的实施例。荻的组织培养基，包括不同诱导时期的四种培养基。现将四种培养基的原料及其附加量分别按七项实施例列于表1-4 初代培养基(表1):
基本培养基附加原料 (g/L)实施 例1234567MS蔗糖20-3020253020302525琼脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.58.5不定芽诱导培养基(表2)基本培养基附加原料 (g/L 或 mg/L)实施 例1234567MS6-BA0.5-20.51.220.51.21.22NAA0.05-0.10.050.070.10.070.10.050.07琼脂 6.5-8.56.57.58.56.57.57.58.5蔗糖20-3020253025302025不定芽增殖培养基(表3)
基本培附加原料实施例养基(g/L 或 mg/L)12345676-BA 0.3-1.50.30.91.50.30.90.91.5MSNAA 0.1-0.20.10.150.20.150.20.10.15蔗糖20-3020253020202530琼脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.57.5诱导生根培养基(表4)
基本培养基附加原料 (g/L 或 mg/L)实施 例1234S67蔗糖20-3020253020252530琼脂6.5-86.57.287.286.57.2NAA0.2-10.20.610.20.60.61实施例1 (对照表1-4中相应实施例的原料及附加量)(1)初代培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20g/L、琼脂6. 5g/L，培养基的pH 值为5. 7 ；(2)不定芽诱导培养基以MS为基本培养基附加6-BAO. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L、蔗糖20g/L、琼脂6. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(3)不定芽增殖培养基MS基本培养基附加6-BA 0. 3mg/L, NAA 0. lmg/L、蔗糖 20g/L、琼脂6. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(4)诱导生根培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20g/L，琼脂6. 5g/L、NAA 0. 2mg/L,培养基的pH值为5. 7 ；用上述的培养基进行荻的组织培养方法按如下步骤进行(1)外植体采集与消毒选取健壮的荻种子，依次进行洗涤剂清洗Imin、自来水冲洗2h、超净工作台上用75%乙醇灭菌30s、无菌水冲洗3 4次、浓度为0. 525%的NaClO 真空灭菌20min、无菌水冲洗5 6次后和用灭菌滤纸吸干种子表面水分；(2)初代培养将经步骤(1)无菌条件下获得的荻种子接入初代培养基中，其中前7天置于暗柜中培养，后7天置于光暗周期为光16h/暗他的条件下培养，培养温度为 25士2°C，获得幼苗；(3)不定芽诱导将初代培养后发育健壮的幼苗切去胚根根，接入不定芽诱导培养基中，经过15d诱导培养，获得不定芽，每日光暗周期为光16h/暗他，光照强度为40 50 μ mo 1 πι 培养温度为 25士2°C ；(4)不定芽增殖培养将获得的不定芽接入不定芽增殖培养基中，经过28天增殖培养，增殖系数为10 20，28天继代1次，共继代3次，光照培养，光暗周期为光16h/暗 8h，光照强度为40 50μπιΟ1 HT2s-1,培养温度为25士2°C，培养出不定芽；(5)生根诱导选取健壮不定芽接入生根培养基中，进行生根诱导，培养21天，生根率达99%，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40 50 μ mol πΓ、—1，培养温度为25士 1°C，培养出幼苗，组培的全部过程结束。上述培养基中MS基本培养基及其它相关化学品可市售获得，按商品说明书配用， 为同行所公知。其余实施2-7，均对照表1-4中对应实施例原料及附加量，与实施例1相同方法获得组织培养基和组培幼苗。七项实施例中，以实施例1-3优选。
权利要求
1.一种荻的组织培养基，其特征是包括不同诱导时期的四种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是(1)初代培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20 30g/L、琼脂6.5 8. 5g/L，培养基的PH值为5.7 ；(2)不定芽诱导培养基以MS为基本培养基，附加6-BA0.5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(3)不定芽增殖培养基以MS为基本培养基，附加6-BA0.3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、琼脂6. 5 8. 5g/L，培养基的pH值为5. 7 ；(4)诱导生根培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖20 30g/L，琼脂6.5 8. Og/L、 NAA 0. 2 1. Omg/L,培养基的pH值为5. 7 ；
2.一种用权利要求1所述的培养基进行荻的组织培养方法，其特征是经过以下步骤(1)外植体采集与消毒选取健壮的荻种子，依次进行洗涤剂清洗Imin、自来水冲洗池、超净工作台上用75%乙醇灭菌30s、无菌水冲洗3 4次、浓度为0. 525%的NaClO真空灭菌20min，无菌水冲洗5 6次后和用灭菌滤纸吸干种子表面水分；(2)初代培养将经步骤(1)无菌条件下获得的荻种子接入初代培养基中，其中前7天置于暗柜中培养，后7天置于光暗周期为光16h/暗他的条件下培养，培养温度为25士2°C， 获得幼苗；(3)不定芽诱导将初代培养后发育健壮的幼苗切去胚根根，接入不定芽诱导培养基中，经过15d诱导培养，获得不定芽，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40 50 μ mo 1 m、—1，培养温度为 25士2°C ；(4)不定芽增殖培养将获得的不定芽接入不定芽增殖培养基中，经过观天增殖培养， 增殖系数为10 20，28天继代1次，共继代3次；光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40 50μπιΟ1 HT2s-1,培养温度为25士2°C，培养出不定芽；(5)生根诱导选取健壮不定芽接入生根培养基中，进行生根诱导，培养21天，生根率达99%;光照培养，光暗周期为光16h/暗他，光照强度为40 50 μ mol πΓ、—1，培养温度为 25士 1°C，培养出幼苗，组培的全过程结束。
全文摘要
一种荻的不定芽诱导、增殖和生根培养基，包括不同培养时期的四种培养基(1)初代培养基，(2)不定芽诱导培养基，(3)不定芽增殖培养基，(4)诱导生根培养基，这四种培养基均以MS为基本培养基，附加蔗糖、琼脂等物质，pH5.7。用上述四种培养基进行荻不定芽诱导、增殖及生根的组培方法经过如下五个步骤一是外植体的采集与消毒，二是初代培养，三是不定芽诱导，四是不定芽增殖培养，五是生根诱导。经过上述五步骤的培育为快速而优质地培养出荻幼苗打好坚实的基础。应用本培养基组培，再生植株能保持母本优良性状，提高幼苗繁殖速度，扩大繁殖数量，并能有效利用种子、缩短育苗周期，满足社会需求。
文档编号A01H4/00GK102239808SQ20111020738
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者张启香, 洪春桃, 胡恒康, 郑炳松, 郭海鹏 申请人:浙江农林大学