专利名称：生物组织培养繁育考来木的方法
技术领域：
本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为生物组织培养繁育考来木的方法。
背景技术：
考来木(Cbrrea car )是芸香科考来木属常绿小灌木。该属有11个种，原产澳大利亚，分布较广泛，从南澳大利亚州东南部，维多利亚州西部,新南威尔士州东南部，并持续到昆士兰州东南部，它包括东部塔斯马尼亚州及南澳大利亚袋鼠岛。考来木生长环境类型多样，从沿海沙地到内 陆半干旱山地都有分布，有的生长在林下或靠近溪流的阴凉环境中，有的暴露在海岬或沙丘中。树型不规则，有的直立、有的半匍匐生长。叶片短小，对生，背面多有绒毛，逆光观察时可见半透明的油滴状斑点。花多着生于叶腋处，钟状、灯笼状、长管状或细长管状，长
2.5厘米左右，单株花朵数量众多，花瓣顶端多反卷呈星状，花蕊突出花瓣外，花期长，多数品种从夏末开至晚冬、甚至初春。花色多，有火红色、白色、绿色、粉色、橘红色等。在寒冷的冬日，考来木以其浓绿的叶片、纤细可爱的繁花、五彩缤纷的色彩夺人眼球，宛如冬季里的精灵。考来木属是澳大利亚的特有属，其常绿、冬花、耐盐碱、极抗寒、耐干旱等特性，使得其在城市园林绿化中必然大有用途，但每株引种费高达500元，到目前为止，未见国内其它研究机构或种苗企业有引种及繁育研究报道。本技术在单株选优的基础上，采用直接器官发生形式，通过对培养基成分、激素配比以及培养环境因子的确定，建立了考来木完整的再生体系，以芽繁芽进行组培快繁生产出来的试管苗无变异发生，可以保持母本的优良性状，使得这一昂贵的外来物种得以保存和繁育，为后期的推广应用奠定了技术基础和优质种苗。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物组织培养繁育考来木的方法，在离体条件下快速繁殖考来木,且生产的考来木种苗品质高,一致性好。本发明目的通过下述技术方案实现一种生物组织培养繁育考来木的方法，选取考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种，其按下列步骤进行
a、所述考来木外植体是选择生长健壮、无病虫害的考来木的带腋芽枝条作为起始外植体，用洗洁精擦洗表面后，流水冲洗20分钟，再进行表面消毒处理；
b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基中，进行初代培养，其中，初代培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg *L ^NAAO. 15 O. 25mg *L :+ 鹿糖 25 35g .L1+ 琼脂 4 12g *L 1 ；具体的，在初代培养基中，6-BA的激素浓度可以为O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg · L_S NAA的激素浓度可以为O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg ·Ι^，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35g · L—1，琼脂的浓度可以为 4、5、6、7、8、10、12 g · L-1。
C、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BA0. I
2.5mg · L_1+NAA0. I 2. 5mg · L-1+ 鹿糖 20 40 g · L-1+ 琼脂 4 12 g · L-1,诱导不定芽，具体的，BA的激素浓度可以为O. I、O. 2、O. 5、I. O、I. 5、2. O、2. 5mg .LlNAA的激素浓度可以为 O. 1,0. 2,0. 4,0. 8,1. 0,1. 2,1. 5,2. 0,2. 5 mg · Γ1，蔗糖的浓度可以为 20、25、28、30、32、35,40 g · L—1，琼脂的浓度可以为 4、5、6、7、8、10、12g · L-1 ；
d、将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，壮苗培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg · L_1+IBA0. 15 O. 25mg · L-1+ 蔗糖 25 35 g · L-1+ 琼脂 4 12 g · L—1，具体的，在壮苗培养基中，6-BA的激素浓度可以为O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25mg · L-1，IBA的激素浓度可以为O. 15、O. 18、O. 2、O. 22、O. 25 mg · L—1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 g · Γ1，琼脂的浓度可以为 4、5、6、7、8、10、12 g · Γ1 ;
e、将经壮苗培养生长到I.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为 1/2MS+NAA0. 5 4. 5mg · L ^IBAO. 5 2. 5 mg · L 1 + 鹿糖 15 35g · L :+ 琼脂4 12g · L—1，具体 NAA 的激素浓度可以为 O. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,3. 8,4. 0,4. 2、4.5 !!^ 171，18六的激素浓度可以为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg · L_\蔗糖的浓度可以为15、18、20、22、25、30、35 g · Γ1，琼脂的浓度可以为 4、5、6、7、8、10、12 g · Γ1 ;
f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。其中，步骤a中所述的外殖体为带腋芽的枝条切取成长度为O. 5 2. 5cm，腋芽位于中间的茎段，可以为O. 5,0. 7,0. 9、I、I. 5,2. 0,2. 5cm等该范围内的任一长度，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。在上述方案基础上，所述步骤a中，所述的消毒处理先用72%浓度的酒精消毒30 60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有O. 1 O. 2%的升汞液浸泡15 30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。具体的，72%浓度酒精消毒时间可以为30s、40s、50s、60s，升汞液浓度可以为O. 1%、0· 15%、0. 2%，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。优选的初代培养基为MS+6-BA0.2mg · L^+IBAO. 2mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂6g ·Ι^，在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为1(Γ15小时/天(h/d)，优选12h/d,光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为22 28天，优选25天。 其中，步骤C中所述的最佳增殖培养基为MS+BA2mg · L_1+NAAlmg · L—1+鹿糖30g · Γ1+琼脂6 g · L—1，在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为28 32天，优选30天，丛生芽增殖率为I : (4 5)，由此考来木试管苗的月增殖系数为1:4飞。其中，优选的壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg · L^+IBAO. 2mg · L—1+ 蔗糖 30g · L—1+ 琼脂6g · L_\在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为18 22天，优选20天，由此试管苗长至2飞cm高，叶片Γ8对，比较整齐。其中，步骤e中所述的最佳生根培养基为l/2MS+NAAlmg -L^+IBAlmg -Γ1+蔗糖20g · Γ1+琼脂6 g · L—1，生根率为85 95%，平均生根数4. 5条，根长2 5厘米，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，生根培养的周期为28 32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4. 5条，根长2飞厘米，诱导生成的根比较粗壮。其中，步骤f中将生根试管苗置于自然环境中6 10天，一般为一周，取出洗净根部，用500 600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，起始6 10天(一般为一周)内采用喷雾等手段保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后(约二周后)按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照 ，进行栽种。在上述方案基础上，所述步骤f中生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土 珍珠岩=2:1。其中所用到的培养基及激素包括
MS培养基(Murashing and Skoog medium,以下简称MS),MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，、在此不再赘述。1/2MS 是指 MS 培养基配方中 NH4N03、KN03、CaCl2 · 2H20、MgS04 · 7H20 ,KH2PO4 用量减半，而其余药品成分以及用量不变。附加的植物激素为6-节基氨基嘌呤(benzylaminopurine,简称为BA)、奈乙酸(naphthylene acetic acid,简称为 NAA)、卩引哚丁酸(3_Indolebutyric acid,简称为 IBA),基本培养基中所用药剂和各类激素均由sigma公司购得。本发明的有益效果是
本发明极大加快了考来木的繁殖速度，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系，年繁殖系数为I :1000000，成本由原来的引种每株500元，降低至每株2 3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了考来木引种费用高的问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的考来木种苗品质高，一致性好。利用本发明的技术参数和流程，我们已经用上述技术生产了 300000株工程苗，受到市场的认可欢迎，并将持续生产。
图I为本发明繁育品种母本之一；
图2为本发明繁育品种母本之一；
图3为本发明诱导增殖培养；
图4为本发明壮苗培养；
图5和图6为本发明生根试管苗；
图7和图8为本发明炼苗移栽图。
具体实施例方式如图I为本发明繁育品种母本之一、图2为本发明繁育品种母本之一、图3为本发明诱导增殖培养、图4为本发明壮苗培养、图5和图6为本发明生根试管苗，以及图7和图8为本发明之炼苗移栽实样图所示
一种考来木离体培养和快速繁殖的方法，考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行移栽，包括下述步骤
a:考来木叶片多有绒毛，并有半透明的油滴状斑点，枝条上密布黄色的树脂腺体，又长期生长于野外自然条件下，自身附带的污染物较多，表面消毒获得无菌材料具有难度。本技术采用较温和的洗洁精浸泡擦洗，去掉枝条表面的毛并初步降低污染后，再流水冲洗20分钟，切取成为长度O. 5^2. 5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，在超净工作台上，先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用O. Γ0. 2%的升汞液浸泡15 30分钟，用无菌水冲洗至消毒液无残留，得到无菌的外植体，平均无菌率80%。其中升汞溶液过滤后可反复加以使用，消毒效果不变，可减少对环境的破坏。b :在步骤a中消毒所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0. 15^0. 25mg Γ'+ΝΑΑΟ. 15 O. 25mg · Γ1+ 蔗糖 25 35g · Γ1+ 琼脂 4 12g · Γ1 上。培养基 pH 调为 5. 8 左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为20001χ，培养温度为25 °C的无菌室内培养25天。
无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121°C条件下高压灭菌35分钟，培养基在121°C条件下高压灭菌18分钟。c :将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基MS+BA0. Γ2. 5mg · Γ'+ΝΑAO. f2. Smg·!/1+蔗糖2(T40 g·!/1+琼脂Γ 2 g ·Ι^，结果表明，考来木增殖需要浓度较高的细胞分裂素，当BA为Img · Γ1时，增殖速度非常缓慢，当BA浓度为3 mg · Γ1时，对考来木丛生芽的增殖效果最好，而当浓度达到3. 5mg -Γ1时，考来木又非常容易出现玻璃化的畸形现象，添加生长素对考来木的增殖有促进作用。本发明中所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为MS+BA2mg · L^+NAAlmg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+琼脂6 g · L—1 ;在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，培养周期优选30天，考来木试管苗的月增殖系数为I: Γ5。诱导出的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，可以做为考来木扩繁增殖的培养基。d :在增殖培养基上，考来木试管苗生长高度参差不齐，将丛生芽分切后，转移至壮苗培养基 MS+6-BA0. 15 O. 25mg · Γ1 +ΙΒΑ0. 15 O. 25mg · Γ1+ 蔗糖 25 35 g · Γ1+ 琼脂 4 12g七1。本发明优选的壮苗培养基为MS+6-BA0. 2mg -L^+IBAO. 2mg -Γ1+蔗糖30g -Γ1+琼脂6g -Γ1 ;在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001χ，培养温度优选25 °C，培养周期优选20天，试管苗长至2飞cm高，叶片4飞对，比较整齐，可以用来诱导生根。e :大量元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，本发明中生根培养基为1/2MS+NAAO. 5 4. 5mg L^+IBAO. 5 2. 5mg Γ1+ 蔗糖 15 35g Γ1+ 琼脂 4 12g .L' 当 NAA、IBA 浓度低于I mg · L4时，生根率比较低；当上调至4. 5 mg · L-1时，生根率虽然可以达到100%，但是在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；蔗糖含量为20 g · L—1时，也能够提高生根率及平均生根数。考来木生根培养时最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为l/2MS+NAAlmg · L^+IBAlmg · L-1+ 蔗糖 20 g · L-1+ 琼脂 6 g · L—1 ;培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，生根培养的周期优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4. 5条，诱导生成的根比较粗壮。第六步将考来木生根试管苗置于自然环境中6 10天，一般为一周，取出洗净，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，本发明中草炭土 珍珠岩=2:1，起始 Γ Ο天(一般为一周)内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后(约二周后)按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。考来木成活率可以达到90%。采用本发明所提供的方法 ，对加快考来木的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数为1:1000000，成本由原来的引种每株500元，降低至每株2 3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了考来木引种费用高的问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的考来木种苗品质高，一致性好。利用本发明的技术参数和流程，我们已经生产了 300000株工程苗，受到市场的认可欢迎，并将持续生产。
权利要求
1.一种生物组织培养繁育考来木的方法，选取考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种，其特征在于按下列步骤进行 a、所述考来木外植体是选择生长健壮、无病虫害的考来木的带腋芽枝条作为起始外植体，用洗洁精擦洗表面后，流水冲洗20分钟，再进行表面消毒处理； b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基中，进行初代培养，其中，初代培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg *L ^NAAO. 15 O. 25mg *L :+ 鹿糖 25 35g .L1+ 琼脂 4 12g *L 1 ； C、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BA0. I 2. 5mg · L_1+NAA0. I 2. 5mg · L-1+ 鹿糖 20 40 g · L-1+ 琼脂 4 12 g · L-1,诱导不定芽； d、将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，壮苗培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg · L_1+IBA0. 15 O. 25mg · L-1+ 蔗糖 25 35 g · I/1+ 琼脂 4 12g * L-1 ； e、将经壮苗培养生长到2.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为 1/2MS+NAA0. 5 4. 5mg *L ^IBAO. 5 2· 5 mg *L 1 + 鹿糖 15 35g *L :+ 琼脂 4 12g · L-1 ； f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。
2.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤a中，所述的外殖体为带腋芽的枝条切取成长度为O. 5 2. 5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。
3.根据权利要求I或2所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤a中，所述的消毒处理先用72%浓度的酒精消毒30 60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有O. I O. 2%的升汞液浸泡15 30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
4.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，优选的初代培养基为MS+6-BA0. 2mg · L^+IBAO. 2mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6g · L-1，在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为1(T15小时/天，光照强度150(T25001x，培养温度为室温，培养周期为22 28天。
5.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤c中，所述的最佳增殖培养基为MS+BA2mg · L_1+NAAlmg · I71+鹿糖30g · I71+琼脂6 g · L-1,培养条件为无菌室内光周期为1(Γ15小时/天，光照强度150(Γ25001Χ，培养温度为室温，培养周期为28 32天，丛生芽增殖率为I : (4 5)。
6.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤d中，优选的壮苗培养基为MS+6-BA0. 2mg · I^+IBAO. 2mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6g · L—1，培养条件为无菌室内光周期为1(T15小时/天，光照强度150(T25001x，培养温度为室温，培养周期为18 22天，苗高达到2 6厘米，4 8对叶片。
7.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤e中，所述的最佳生根培养基为l/2MS+NAAlmg · L^+IBAlmg · L-1+蔗糖20 g · L-1+琼脂6 g · L-1，生根率为85 95%，平均生根数4. 5条，根长2 5厘米，培养条件为无菌室内光周期为1(Γ15小时/天，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温，生根培养的周期为28 32天。
8.根据权利要求I所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6 10天，取出洗净根部，用500 600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，起始6 10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
9.根据权利要求9所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于步骤f中，所述的混合基质的营养成分为草炭土 珍珠岩=2:1。
全文摘要
本发明涉及一种生物组织培养繁育考来木的方法，包括下述步骤取带腋芽的枝条作为外植体，并对外植体进行清洗，表面消毒处理；将外植体接种到初代培养基中，进行初代培养；将初代培养的无菌苗转入增殖培养基MS+BA0.1~2.5mg·L-1+NAA0.1~2.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12g·L-1，诱导不定芽；将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；试管苗分切后，转移至生根培养基为1/2MS+NAA0.5~4.5mg·L-1+IBA0.5~2.5mg·L-1+蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1中；将生根试管苗清洗，移至基质中栽种。优点是年繁殖系数提高到11000000，成本降低至每株2~3元，且不受季节限制，环境易控，减少变异植株的产生，种苗品质高，一致性好。
文档编号A01H4/00GK102613087SQ201210115528
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者吕秀立, 崔心红, 施季森, 李永胜, 沈烈英, 钱又宇 申请人:上海城投绿化科技发展有限公司, 上海市园林科学研究所