专利名称：粉状葡萄土壤杆菌菌株ae206生物农药的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物农药的制备方法，特别是葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的制备方法，属于葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药制备领域。
背景技术：
根癌病是由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一种世界范围的细菌性病害，病原菌寄主范围广，可侵染93科331属643种高等植物，除侵染桃、李、杏、樱桃、梨、苹果等主要果树外，还能危害葡萄、枣、木瓜、板栗、核桃等多种果树。病树树势衰弱，生长迟缓，产量降低，寿命缩短，严重者绝产甚至死亡。葡萄土壤杆菌菌株AE206 (Agrobacteriun vitis AE206)为细菌生物制剂，该菌属于土壤杆菌，能在葡萄等苗 木根部定殖，保护伤口、产生抗菌素抑制根癌病菌，对根癌病有良好的预防作用。关于葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的制备方法目前报道的不多。CN101451112A(CN101451112B，2010年9月15日授权)公开了一种葡萄土壤杆菌菌株AE206(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No. 2408)、其菌剂和制备方法，但不具备规模化生产水平。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，通过对葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药制备方法中各种工艺条件的选择，提供一种可大规模生产葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的方法，获得的葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的袍子产量高、生产成本低。本发明通过如下技术方案实现一种粉状葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的制备方法，其包括如下步骤制备菌种；第一次发酵，即种子罐发酵；第二次发酵，即生产罐发酵；制造粉状生物农药，其特征在于，所述制备菌种中，摇瓶培养基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4WH2O和蒸馏水构成；所述第一次发酵中，所用培养基由蔗糖、酵母膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水构成；所述第二次发酵中，所用培养基由绵白糖、玉米浆膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水构成。如上所述制备方法，所述制备菌种中的摇瓶培养基的具体组成为蔗糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉Ig、MgSO4 7H20 0. 5g和蒸馏水1000ml。如上所述制备方法，所述第一次发酵中所用培养基的具体组成为蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HP04 3g、MgS04 7H20 0.3g、KCl 0. 15g, CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。如上所述制备方法，所述第二次发酵中所用培养基的具体组成为绵白糖20g、玉米浆膏 15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。如上所述制备方法，所述制备菌种中，摇瓶培养的摇瓶的装量为1/3，摇床转速为180rpmo如上所述制备方法，所述第一次发酵中，发酵罐的装罐系数为0. 6-0. 7、搅拌速度为 200_300rpm。如上所述制备方法，所述第二次发酵中，发酵罐的装罐系数为0. 6-0. 7、搅拌速度为 200_300rpm。本发明的有益效果通过本发明的方法，可以获得含水量为10-30%的粉状制剂，每批次可生产所述粉状制剂2000kg以上，优选2400kg至2800kg，其活菌数在109cfu/g以上，可以实现大规模生产，且生产成本低。
具体实施例方式根据本发明的制备方法，其中菌株为葡萄土壤杆菌菌株AE206，是可以购买得到的，也可以通过如CN101451112A中公开的方法培养得到，即采用平板培养基(牛肉膏，NaCl，琼脂等)，在25 33° C培养48小时。所述菌株可通过以下方法保存(I)长期保存方法冷冻干燥保存；(2)短期保存方法试管斜面液体石蜡封存2-4° C低温保存。 根据本发明的制备方法，所述菌种通过以下方法制备得到(I)平板及试管菌种的制备将低温保存的菌株在平板培养基上划线25 33° C活化，挑取单菌落在斜面培养基上扩繁备用。(2)摇瓶菌种的制备摇瓶培养基配方鹿糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgS04 *7H200. 5g和蒸馏水 1000ml, pH 为 7. 0-7. 2。(3)摇瓶培养条件摇瓶装量为1/3，在28±1° C下，培养24-36小时，摇床转速为180rpm。(4)接种用无菌水将试管斜面菌种配制成菌悬液，按2-5%体积比接种。(5)获得菌种显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞；革兰氏染色，为阴性；摇瓶菌种微黄色，无臭味，活菌数在109cfu/ml以上。根据本发明的制备方法，所述第一次发酵(种子罐发酵)具体为配置种子罐培养基蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HP04 3g、MgS04 *7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml, pH=7. 2。种子罐灭菌、接种量和接种温度121° C灭菌I小时；接种量为5%体积比，接种温度为28±1° C；发酵控制及发酵时间装罐系数为0. 6-0. 7，温度为28±1° C，搅拌速度为200 300rpm，取样间隔时间为4小时，发酵周期为18-24小时；所得的种子液，微黄色，无臭味，活菌数在109cfu/ml以上。在显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞。根据本发明的制备方法，所述第二次发酵(生产罐发酵)具体为配置生产罐培养基绵白糖20g、玉米浆膏15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H200. 3g、KCl0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml, pH=7. 2。生产罐灭菌、接种量和接种温度121° C灭菌I小时；接种量为2%体积比，接种温度为28±1° C；发酵控制及发酵周期装罐系数为0. 6-0. 7，温度为28±1° C，搅拌速度为200 300rpm，不需调节pH值。取样间隔时间为3小时，发酵周期为24-30小时；所得菌液，微黄色，无臭味，活菌数在109cfu/ml以上。在显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞。根据本发明的制备方法，所述粉状制剂的制备具体为将上述第二次发酵后的AE206发酵液与灭菌后的草炭直接混合，重量份数比为I :5，搅拌均匀，然后遮荫风干。使其成为含水量为10-30%的粉状制剂，分装即可。根据本发明的制备方法，所述制剂通过以下步骤储存
常温(18° C-25° C)避光保存，防止日晒，保质期为100-120天，避免与强酸、强碱等接触，避免与挥发性农药共同存放。本发明的有益效果通过本发明的方法，可以获得含水量为10-30%的粉状制剂，每批次可生产粉状制剂2000kg以上，优选2400kg至2800kg，其活菌数在109cfu/g以上，可以实现大规模生产，且生产成本低。下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。实施例I通过以下步骤制备粉状制剂(I)制备菌种葡萄土壤杆菌菌株AE206 (Agrobacteriun vitis AE206)米用试管斜面液体石腊封存2-4° C低温保存。将上述低温保存的菌株在平板培养基上划线30° C活化，挑取单菌落在斜面培养基上扩繁备用。配置摇瓶培养基鹿糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgSO4 IW2O 0. 5g和蒸馏水 1000ml, pH 为 7. 0-7. 2。摇瓶装量为1/3，在28±1° C下，培养36小时，摇床转速为180rpm。用无菌水将试管斜面菌种配制成菌悬液，按4%体积比接种。显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞，革兰氏染色，为阴性；摇瓶菌种微黄色，无臭味，活菌数在IO9CfuAil以上。 (2)第一次发酵(种子罐发酵)配置种子罐培养基蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2O. Olg 和水1000ml, pH=7. 2。种子罐灭菌、接种量和接种温度121° C灭菌I小时；接种量为5%体积比，接种温度为28±1° C。发酵控制及发酵时间装罐系数为0. 6，温度为28±1° C，搅拌速度为250rpm，取样间隔时间为4小时。发酵周期为20小时。所得种子液，微黄色，无臭味，活菌数在2 X 109cfu/ml。在显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞。( 3 )第二次发酵(生产罐发酵)
配置生产罐培养基绵白糖20g、玉米浆膏 15g,K2HPO4 3g、MgS04 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg和水 1000ml, pH=7. 2。生产罐灭菌、接种量和接种温度121° C灭菌I小时。接种量为2%体积比，接种温度为28±1° C。发酵控制及发酵周期装罐系数为0. 6，温度为28±1°C，搅拌速度为250rpm，不需调节pH值。取样间隔时间为3小时，发酵周期为26小时。所得菌液，微黄色，无臭味，活菌数在2X109cfu/ml。在显微镜下观察菌体形态，与纯菌种一致，菌体为短杆状，单细胞。(4)成品制备和储存第二次发酵的AE206发酵液与灭菌后的草炭直接混合，重量份数比为I :5，搅拌均匀，然后遮荫风干。使其成为含水量为20%的粉状制剂，分装即可。产品的储存常温(18°C_25°C)避光保存，防止日晒，保质期为100-120天，避免与强酸、强碱等接触，避免与挥发性农药共同存放。实施例2 步骤同实施例1，具体参数及结果见表I。实施例3 步骤同实施例I，具体参数及结果见表I。表I
权利要求
1.一种粉状葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的制备方法，其包括如下步骤制备菌种；第一次发酵，即种子罐发酵；第二次发酵，即生产罐发酵；制造粉状生物农药，其特征在于，所述制备菌种中，摇瓶培养基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4 7H20和蒸馏水构成；所述第一次发酵中，所用培养基由蔗糖、酵母膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水构成；所述第二次发酵中，所用培养基由绵白糖、玉米浆膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水构成。
2.如权利要求I所述制备方法，所述制备菌种中，摇瓶培养的摇瓶的装量为1/3，摇床转速为180rpm。
3.如权利要求I或2所述制备方法，所述第一次发酵中，发酵罐的装罐系数为0.6-0. 7、搅拌速度为 200-300rpm。
4.如权利要求I至3之一所述制备方法，所述第二次发酵中，发酵罐的装罐系数为0.6-0. 7、搅拌速度为 200-300rpm。
5.如权利要求I至4之一所述制备方法，所述制备菌种中的摇瓶培养基的组成具体为蔗糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgSO4 7H20 0. 5g和蒸馏水1000ml。
6.如权利要求I至5之一所述制备方法，所述第一次发酵中所用培养基的组成具体为蔗糖 20g、酵母膏 5g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0.3g、KCl 0.15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。
7.如权利要求I至6之一所述制备方法，所述第二次发酵中所用培养基的组成具体为绵白糖 20g、玉米浆膏 15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KC10. 15g、CaCl2 0. Olg 和水IOOOml0
全文摘要
本发明提供一种粉状葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的制备方法，其包括如下步骤制备菌种；第一次发酵，即种子罐发酵；第二次发酵，即生产罐发酵；制造粉状生物农药，其特征在于，所述制备菌种中，摇瓶培养基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4·7H2O和蒸馏水构成。通过对葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药制备方法中各种工艺条件的选择，提供一种可大规模生产葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的方法，获得的葡萄土壤杆菌菌株AE206生物农药的袍子产量高、生产成本低。
文档编号A01P1/00GK102960368SQ20121049179
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者梁洪柱, 田会鹏, 陈倩, 李学燕 申请人:北京市西山试验林场