一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法
【专利摘要】一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，本发明要解决现有毛果杨组培苗作为外植体诱导不定芽成功率低、愈伤组织诱导不定芽周期长的问题，该方法是在组织培养幼苗的培养基中添加0～5μM组蛋白去乙酰化酶抑制剂溶液，诱导毛果杨根尖再生出不定芽的方法。本发明具有以下优点：（1）方法简便有效，不需要复杂的组培体系和培养条件，只需要在普通的杨树组培培养基中添加适当浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂溶液，就能有效诱导不定芽的再生；（2）周期较短，一般经30天左右即可诱导出不定芽。
【专利说明】一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法。
【背景技术】
[0002]表观遗传调控主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰，组蛋白修饰又包括组蛋白乙酰化、磷酸化和糖基化等。组蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰基转移酶(histoneacetyl transferase, HAT)所介导的组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases, HDACs)所介导的组蛋白去乙酰化共同调节,缺一不可,二者共同作用保证细胞内组蛋白乙酰化水平处于动态平衡。组蛋白乙酰化影响染色质的结构，基因的转录，以及多种生命活动。HDAC催化组蛋白上的赖氨酸(lysine)所结合的乙酰基团的去除，乙酰基团去除后染色质结构变得紧密，不利于转录因子以及转录调节因子与DNA的结合。因此，HDAC一般与基因抑制或基因沉默有关。根据与酵母HDAC (RPD3、HDA1和SIR2)序列的同源性比较，植物HDAC可分为3个亚家族:RPD3/HDA1、HD2和SIR2。其中，RPD3/HDA1和HD2类型的组蛋白去乙酰化酶活性能够被HDAC特异性的抑制剂如trichostatinA (TSA)或butynate(NaB)所抑制，而SIR2类型的组蛋白去乙酰化酶则不能被这些抑制剂所抑制。HDACs调节植物多种生命活动包括生长、 发育和胁迫反应等。当HDAC的酶活性被其特异的抑制剂如TSA或NaB抑制后，植物会出现多种表型上的改变。例如，拟南芥HDA18对根表皮细胞分化过程中模式形成具有重要的调节作用，TSA处理引起根毛细胞在非根毛形成部位的出现和发育。HDAC抑制剂TSA和NaB能够抑制豌豆根表皮细胞的有丝分裂，NaB能够抑制水稻根的生长。上述这些研究表明HDAC在植物根发育的多个过程中发挥非常重要的调控作用。
[0003]毛果杨是一种再生很困难的杨树。目前，以毛果杨组培幼苗的叶片和茎段作为外植体，通过调节培养基成分、激素种类和浓度以及培养条件均很难诱导不定芽，仍没有一个成熟的组培体系；而采用温室成熟苗(4-6个月龄)的茎段能够诱导出愈伤组织，再通过愈伤组织诱导出不定芽，但这种方法周期长(3-6个月)，涉及复杂的组织培养体系。因此，急需一种新的方法来提高毛果杨不定芽的再生率和缩短得到再生植株的时间。目前，木本植物组织培养体系的研究主要集中在培养基种类、盐浓度、生长调节物质、碳水化合物、光照和温度等方面，而表观遗传调控对木本植物再生和发育的影响很少有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决目前毛果杨幼嫩叶片、茎段作为外植体不定芽诱导率低和采用愈伤组织诱导不定芽费时长的问题。而提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法。
[0005]本发明的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法是按照以下步骤进行的:一、取毛果杨含腋芽的茎段在WPM培养基上诱导腋芽萌发，至长出幼苗；二、将步骤一的毛果杨幼苗在WPM培养基中培养，至长出不定根；三、将步骤二长出不定根的幼苗放入含O~5 μ M组蛋白去乙酰化酶抑制剂的水溶液，继续培养，至不定芽诱导再生，即完成组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生。
[0006]本发明包含以下有益效果:
[0007]目前，有关植物HDAC的研究主要涉及根的生长速率、根表皮细胞模式形成、侧根形成等方面，而有关HDAC酶活性抑制后能诱导根再生出不定芽的研究结果未见报道。本发明以毛果杨组培苗的根为外植体，通过TSA处理诱导外植体直接分化出不定芽，省略了愈伤组织诱导培养过程，简化了组织培养体系，缩短不定芽诱导周期，一般经30天左右即可完成不定芽的诱导过程，再生频率较高(再生芽簇/根数目=37%)，是快速获得再生植株的一个有效方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为实施例在加入5 μ MTSA处理下不定芽的诱导再生图片；
[0009]图2为实施例在加入I μ MTSA处理下不定芽的诱导再生图片；
[0010]图3为实施例在加入O μ MTSA处理下不定芽的诱导再生图片。
【具体实施方式】
[0011]【具体实施方式】一:本实施方式的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法是按照以下步骤进行的:一、取毛果杨含腋芽的茎段在WPM培养基上诱导腋芽萌发，至长出幼苗；二、将步骤一的毛果杨幼苗在WPM培养基中培养，至长出不定根；三、将步骤二长出不定根的幼苗放入含O~5 μ M组蛋白去乙酰化酶抑制剂的水溶液，继续培养，至不定芽诱导再生，即完成组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生。
[0012]本实施方 式包含以下有益效果:
[0013]目前，有关植物HDAC的研究主要涉及根的生长速率、根表皮细胞模式形成、侧根形成等方面，而有关HDAC酶活性抑制后能诱导根再生出不定芽的研究结果未见报道。本发明以毛果杨组培苗的根为外植体，通过TSA处理诱导外植体直接分化出不定芽，省略了愈伤组织诱导培养过程，简化了组织培养体系，缩短不定芽诱导周期，一般经30天左右即可完成不定芽的诱导过程，再生频率较高，是快速获得再生植株的一个有效方法。
[0014]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中所述的诱导腋芽萌发的诱导条件为:在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下进行诱导至长出幼苗的苗高为2~3cm。其它与【具体实施方式】一相同。
[0015]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:步骤二中所述的培养条件为:在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下培养至长出不定根长度为0.5~1.5cm。其它与【具体实施方式】一或二相同。
[0016]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤三中所述的不定芽诱导再生的条件为:在温度为20~25°C，光照时间为16小时/天的条件下诱导出不定芽。其它与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0017]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)的浓度为I~5μΜ。其它与【具体实施方式】一至四之一相同。[0018]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是:步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)的浓度为2~5μΜ。其它与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0019]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是:步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)的浓度为3~5μΜ。其它与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0020]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是:步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)的浓度为4~5μΜ。其它与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0021]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一至八之一不同的是:所述的WPM培养基均含有质量百分含量为2%的蔗糖、浓度为0.lmg/L的IBA和质量百分含量为0.6%的琼脂；所述的WPM培养基pH=5.8。其它与【具体实施方式】一至八之一相同。
[0022]本实施方式所述的WPM培养基为市售产品。
[0023]通过以下实施例验证本发明的有益效果:
[0024]本实施例的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法是按照以下步骤进行的:一、取毛果杨组培苗去除叶片，用解剖刀切成小的茎段，每个茎段含一个腋芽，直立放在WPM培养基上，在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下进行诱导诱导腋芽萌发至长出幼苗的苗高为2~3cm ;二、将步骤一的毛果杨幼苗，用解剖刀将毛果杨幼苗从茎段上切下，直立放入WPM培养基中，在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下诱导生根，至长出Icm不定根；三、将步骤二长出不定根的幼苗分别放入含O μ M，I μ M和5 μ M组蛋白 去乙酰化酶抑制剂的水溶液，在温度为20~25°C、光照时间为16小时/天的条件下继续培养，至不定芽诱导再生，即完成组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生。
[0025]本实施例所述的WPM培养基均含有质量百分含量为2%的蔗糖、浓度为0.lmg/L的IBA和质量百分含量为0.6%的琼脂；所述的WPM培养基pH=5.8 ;所述的WPM培养基为市售
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[0026]通过对本实施例实验结果分析，得到以下结论:
[0027]组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)浓度为5μ M时能有效诱导不定芽的再生(如图1所示)，每个主根在加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)两周后根尖重新生出幼嫩的新根，在加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)四周后，在旧根的根尖处再生出幼芽和发育成幼苗。不加TSA或TSA浓度为I μΜ时，均不能有效诱导芽的再生(如图2和图3所示)。
【权利要求】
1.一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的: 一、取毛果杨含腋芽的茎段在WPM培养基上诱导腋芽萌发，至长出幼苗；二、将步骤一的毛果杨幼苗在WPM培养基中培养，至长出不定根；三、将步骤二长出不定根的幼苗放入含O~5 μ M组蛋白去乙酰化酶抑制剂的水溶液，继续培养，至不定芽诱导再生，即完成组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生。
2.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤一中所述的诱导腋芽萌发的诱导条件为:在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下进行诱导至长出幼苗的苗高为2~3cm。
3.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤二中所述的培养条件为:在温度为23~25°C、光照时间为16小时/天的条件下培养至长出不定根长度为0.5~1.5cm。
4.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤三中所述的不定芽诱导再生的条件为:在温度为20~25°C，光照时间为16小时/天的条件下诱导出不定芽。
5.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为I~5 μ M。
6.根据权利要求1 所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为2~5 μ Μ。
7.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为3~5 μ Μ。
8.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于步骤三中所述的WPM培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂水溶液，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为4~5 μ Μ。
9.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导毛果杨不定芽再生的方法，其特征在于所述的WPM培养基均含有质量百分含量为2%的蔗糖、浓度为0.lmg/L的IBA和质量百分含量为0.6%的琼脂；所述的WPM培养基pH=5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103461123SQ201310416635
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】马旭俊, 李淑娟, 杨传平 申请人:东北林业大学