优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法
【专利摘要】优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，即以当年生东北红豆杉的茎段为外植体在发明人配制的诱导培养基上进行培养，最终得到疏松、淡绿色或白色的东北红豆杉茎段愈伤组织。具有诱导率高、诱导状态好、诱导出愈所需时间短、愈伤可持续生长等特点，本发明不仅可以简便快捷的得到东北红豆杉茎段愈伤组织，从根本上解决了运用植物细胞培养技术对东北红豆杉愈伤组织进行大规模诱导的问题。
【专利说明】优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法。
【背景技术】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世纪六七十年代从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus L.)植物树皮中分离出来的ー种天然的四环二萜类生物碱，因其在肿瘤治疗中的独特效果而广受人们关注，是目前世界公认的最好的广谱、强活性天然抗癌药。由于红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量较低，仅占树皮干质量的0.01%-0.02%，枝叶干质量的十万分之一左右。因此随着全球对野生红豆杉资源保护措施的不断加强，利用野生资源生产紫杉醇已无可能，而现阶段人工种植的红豆杉资源量还远远不能满足紫杉醇生产的需求量。
[0003]因此紫杉醇其他途径的开发就显得极为重要，其中利用红豆杉细胞培养技术就是一条重要的途径，一方面可以加强对红豆杉野生种质资源及其生态环境的保护，另一方面可以满足供需间的差距，并且细胞培养繁殖率高，培养条件易于优化和控制，产物较易分离，从长远来看是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。
【发明内容】
[0004]为了解决运用植物细胞培养技术对东北红豆杉愈伤组织进行大規模培养困难的问题，发明人提供了优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法。
[0005]本发明采用的技术方案是:
[0006]优质东北红豆杉茎`段愈伤组织一步诱导方法，即以当年生东北红豆杉的茎段为外植体在发明人配制的诱导培养基上进行培养，最終得到疏松、淡緑色或白色的东北红豆杉茎段愈伤组织。
[0007]所述的优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，具体包括以下步骤:
[0008](I)外植体的消毒
[0009]取当年生东北红豆杉的茎段，进行无菌化处理，获得无菌的东北红豆杉茎段外植体备用；
[0010](2)愈伤组织诱导培养
[0011]将步骤(1)所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为18-22°C条件下暗培养，15天后得到诱导培养后的愈伤组织；
[0012]所述的诱导培养基的配方，按照每升计算具体为:
[0013]3792mg KN03、15mg MnSO4 ? H20、225mg CaCl2 ? 2H20、56mgNa2EDTA ? 2H20、0.37mg CoCl2.6H20、0.39mg CuSO4 ? 5H20、201mg (NH4) 2S04、3mgZnS04 ? 7H20、3.0mg NAA,41.8mg FeSO4 ? 7H20、15mg VBI >0.38mg NaMoO4.2H20、3.5mg IAA、4.5mg H3BO3> 1.5mg 烟酸、220mgNaH2P04.H2OU.5mgK1、300mg Vc、370mg MgSO4 ? 7H20、1.5mg VB6,268.56mg 肌醇、0.5-lmg2, 4-D、2-3mg IBA、0.3-0.5mg6-BA、20_30g 蔗糖、7_9g 琼脂、2_3g 活性炭和余量的水组成。
[0014]所述的无菌化处理可以采用已知的任何无菌化处理方式，但优选以下无菌化处理方式:将当年生东北红豆杉的茎段经流水冲洗过夜，然后依次用酒精、氯化汞消毒，蒸馏水洗浄。更优化的具体方式，是取当年生东北红豆杉茎段，流水冲洗10小时，然后依次用70-75%的酒精消毒80-120s、0.1 %氯化汞消毒10_15min，无菌水冲洗数次，使用无菌滤纸将水分吸干。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]本发明以红豆杉茎段为外植体，实验证明，采用本发明所特有的诱导培养基，一歩诱导即可达到愈伤组织诱导率100%，生长速率1.0g/L.d，15d便可长出状态良好的淡緑色或白色愈伤组织并且可以不断生长的效果；并且，采用本发明所述方法能最大程度的抑制外植
[0017]体褐化，在操作无失误的情况下，能100%的避免褐化的发生。解决了本领域技术人员亟待解决的问题。具有诱导率高、诱导状态好、诱导所需时间短、步骤少，愈伤可持续生长等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]本发明共有附图4幅，其中:
[0019]图1是红豆杉茎段图；
[0020]图2是按照本发明所提供的方法得到的茎段愈伤组织图1 ;
[0021]图3是按照本发明所提供的方法得到的茎段愈伤组织图1I ；
[0022]图4是本领域常用的常规方法得到的红豆杉褐化组织。
[0023]从附图中可以看出:采用本发明ー步诱导即可达到愈伤组织诱导率100%，生长速率1.0g/L.d，15d便可长出状态良好的淡緑色或白色愈伤组织并且可以不断生长的效果；能100%的避免褐化的发生。
【具体实施方式】
[0024]下面通过具体的实施例对本发明进ー步阐述，但并不限制本发明。
[0025]实施例1
[0026]优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，具体包括如下步骤:
[0027](I)外植体的消毒
[0028]采摘当年生东北红豆杉茎段，流水冲洗10小时，然后依次用70%的酒精消毒120s、0.1 %氯化萊消毒IOmin,无菌水冲洗数次,使用无菌滤纸将水分吸干。
[0029](2)愈伤组织诱导培养
[0030]将步骤(1)所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为18°C条件下暗培养，15天后得到诱导培养后的愈伤组织；
[0031]所述的诱导培养基的配方，按照每升计算具体为:
[0032]3792mg KN03、15mg MnSO4 ? H20、225mg CaCl2 ? 2H20、56mgNa2EDTA ? 2H20、0.37mg CoCl2.6H20、0.39mg CuSO4 ? 5H20、201mg (NH4) 2S04、3mgZnS04 ? 7H20、3.0mg NAA,41.8mg FeSO4 ? 7H20、15mg VBI >0.38mg NaMoO4.2H20、3.5mg IAA、4.5mg H3BO3> 1.5mg 烟酸、220mgNaH2P04.H2OU.5mgK1、300mg Vc、370mg MgSO4 ? 7H20、1.5mg VB6,268.56mg 肌醇、0.5mg2, 4-D、3mg IBA、0.3mg6_BA、30g鹿糖、7g琼脂、3g活性炭和余量的水组成。
[0033]实施例2
[0034]优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，具体包括如下步骤:
[0035](1)外植体的消毒
[0036]采摘当年生东北红豆杉茎段，流水冲洗10小时，然后依次用75%的酒精消毒80s、0.1 %氯化汞消毒15min，无菌水冲洗数次，使用无菌滤纸将水分吸干。
[0037](2)愈伤组织诱导培养
[0038]将步骤(1)所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为18-22°C条件下暗培养，15天后得到诱导培养后的愈伤组织；
[0039]所述的诱导培养基的配方，按照每升计算具体为:
[0040]3792mg KN03、15mg MnSO4 ? H20、225mg CaCl2 ? 2H20、56mgNa2EDTA ? 2H20、
0.37mg CoCl2.6H20、0.39mg CuSO4 ? 5H20、201mg (NH4) 2S04、3mgZnS04 ? 7H20、3.0mg NAA,41.8mg FeSO4 ? 7H20、15mg VBI >0.38mg NaMoO4.2H20、3.5mg IAA、4.5mg H3BO3> 1.5mg 烟酸、220mgNaH2P04.H2OU.5mgK1、300mg Vc、370mg MgSO4 ? 7H20、1.5mg VB6,268.56mg 肌醇、lmg2, 4-D、2mg IBA、0.5mg6_BA、20g鹿糖、9g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。
[0041]实施例3
[0042]优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，具体包括如下步骤:
[0043](I)外植体的消毒
[0044]采摘当年生东北红豆杉茎段，流水冲洗10小时，然后依次用65%的酒精消毒90s、
0.1 %氯化汞消毒12min，无菌水冲洗数次，使用无菌滤纸将水分吸干。
[0045](2)愈伤组织诱导培养
[0046]将步骤(1)所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为18_22°C条件下暗培养，15天后得到诱导培养后的愈伤组织；
[0047]所述的诱导培养基的配方，按照每升计算具体为:
[0048]3792mg KN03、15mg MnSO4 ? H20、225mg CaCl2 ? 2H20、56mgNa2EDTA ? 2H20、
0.37mg CoCl2.6H20、0.39mg CuSO4 ? 5H20、201mg (NH4) 2S04、3mgZnS04 ? 7H20、3.0mg NAA,41.8mg FeSO4 ? 7H20、15mg VBI >0.38mg NaMoO4.2H20、3.5mg IAA、4.5mg H3BO3> 1.5mg 烟酸、220mgNaH2P04.H2OU.5mgK1、300mg Vc、370mg MgSO4 ? 7H20、1.5mg VB6,268.56mg 肌醇、
0.8mg2, 4-D、2.5mg IBA、0.4mg6_BA、25g 鹿糖、7.5g 琼脂、2.6g 活性炭和余量的水组成。
【权利要求】
1.优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，即以当年生东北红豆杉的茎段为外植体在诱导培养基上进行培养，最終得到疏松、淡緑色或白色的东北红豆杉茎段愈伤组织； 所述的优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，具体包括以下步骤: (1)外植体的消毒 取当年生东北红豆杉的茎段，进行无菌化处理，获得无菌的东北红豆杉茎段外植体备用； (2)愈伤组织诱导培养 将步骤(1)所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为18-22°C条件下暗培养，15天后得到诱导培养后的愈伤组织； 所述的诱导培养基的配方，按照每升计算具体为:
3792mg KN03、15mg MnSO4 ? H20、225mg CaCl2 ? 2H20、56mgNa2EDTA ? 2H20、0.37mgCoCl2.6H20、0.39mg CuSO4 ? 5H20、201mg (NH4) 2S04、3mgZnS04 ? 7H20、3.0mg NAA、41.8mgFeSO4 ? 7H20、15mg VBl、0.38mg NaMoO4.2H20、3.5mg IAA、4.5mg H3B03、1.5mg 烟酸、220mgNaH2P04.H2OU.5mgK1、300mg Vc、370mg MgSO4 ? 7H20、1.5mg VB6,268.56mg 肌醇、0.5-lmg2, 4-D、2-3mg IBA、0.3-0.5mg6-BA、20_30g 蔗糖、7_9g 琼脂、2_3g 活性炭和余量的水组成。
2.根据权利要求1所述的优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法，其特征在于:步骤(1)中所述的无菌化处理具体是取当年生东北红豆杉茎段，流水冲洗10小时，然后依次用70-75%的酒精消毒80-120s、0.1 %氯化汞消毒10_15min，无菌水冲洗数次，使用无菌滤纸将水分吸干。
【文档编号】A01H4/00GK103598096SQ201310566846
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】李春斌, 岳玉莲, 王剑锋, 马洪丰, 王德萍, 于鹤 申请人:大连民族学院, 大连市金贵缘科技开发有限公司