编码fasciated ear3(fea3)的核苷酸序列及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了用于调节茎端分生组织尺寸的方法和组合物。提供了用于调节fea3序列在宿主植物或植物细胞中的表达以调节诸如改变的尺寸和器官(包括植物种子)数的农学特性的方法。
【专利说明】编码FASCIATED EAR3(FEA3)的核苷酸序列及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求提交于2012年3月14日的美国临时申请61/610645和提交于2013年I月11日的美国临时申请61/751326的权益，每个申请全部内容以引用方式并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及植物基因操纵领域，尤其是植物中基因活性和发育的操纵。
【背景技术】
[0004]叶和产生分枝与花的腋生分生组织以规则型式起始于茎端分生组织(SAM)。茎端分生组织顶端的细胞用作干细胞，其分裂以连续置换子细胞至周围区域，其中它们进入分化的叶或花原基。分生组织从而能够在发育期间通过平衡细胞增殖与细胞进入新的原基来调节它们的大小。SAM提供植物体的所有地上部分。干细胞调节的中心概念通过CLAVATA/WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信号途径是已知的。在拟南芥(Arabidopsis)中的CLV1、CLV2、或CLV3活性损失引起未分化细胞在茎顶端的积聚，指示CLV基因一起促进干细胞及时转移到分化途径中，或抑制干细胞分裂，或以上两者(Fletcher等人，(1999)，Science 283:1911-1914 ;Taguchi_Sh1bara 等人，(2001), Genes and Development 15:2755-5766;Trotochaud 等人，(1999), Plant Cell 11:393-405 ;Merton 等人，(1954), Am.J.Bot.41:726-32 ；Szymkowiak 等人，(1992), Plant Cell 4:1089-100 ；Yamamoto 等人，(2000)，B1chim.B1phys.Acta.1491:333-40)。CLVl 的玉米直系同源物是 TDl (Bommert 等人，(2005) Development 132:1235-1245)。CLV2 的玉米直系同源物是 FEA2 (Taguch1-Sh1bara等人，(2001) Genes Dev.65 15:2755-2766)。期望能够控制苗和花分生组织的尺寸和外观，从而提供提高的叶、花、和果实的产量。因此，本发明的目的是为了提供用于调节分生组织发育的新型方法和组合物。
【发明内容】
[0005]在一个实施例中，本发明提供产生具有下降的内源fea3表达的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤:(a)将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含可操作地连接至启动子的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的表达降低内源fea3的表达；(b)在步骤(a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(C)选择(b)的转基因植物，其中该转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的fea3表达。
[0006]在另一个实施例中，本发明提供产生具有下降的内源fea3表达的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含:(i) SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO:1、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO: 1、2或4的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列；(iv)能够在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或(V)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO:1、2或4的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中该转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的fea3表达。
[0007]本发明的一个实施例是产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的分离的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽的片段或变体，基于Clustal W比对方法，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO:3或5进行比较时具有至少80%的序列同一性，其中片段或变体赋予在可再生的植物细胞中的显性负表型；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:穗分生组织尺寸、籽粒行数、叶数、花序数、在花序内的分枝、花数、果实数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。
[0008]本发明的另一个实施例是上述方法，其中部分(a)的多肽在具有fea3突变体基因型的植物品系中的表达能够部分或全部恢复野生型表型。
[0009]本发明的一个实施例是鉴定fea3的较弱等位基因的方法，该方法包括以下步骤:(a)对突变体玉米植物的群体进行基因筛选；(b)鉴定表现出比fea3无效植物更弱的fea3表型的一个或多个突变体玉米植物；以及(c)从具有更弱的fea3表型的突变体玉米植物中鉴定弱fea3等位基因。
[0010]本发明的一个实施例是鉴定fea3的较弱等位基因的方法，该方法包括以下步骤:(a)使用SEQ ID NO:1、2或4进行基因改组；(b)将来自步骤(a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中；(c)由步骤(b)的经转化的可再生的植物细胞的群体再生出经转化的植物的群体；(d)针对弱fea3表型，筛选来自步骤(C)的经转化的植物的群体；以及(e)从表现出弱fea3表型的经转化的植物中鉴定弱fea3等位基因。
[0011]本发明的一个实施例是其中内源fea3基因表达相对于对照植物被抑制的植物。本发明的另一个实施例是制备所述植物的方法，该方法包括以下步骤:(a)向内源fea3基因中引入突变；以及(b)检测该突变，其中该突变对于抑制内源fea3基因的表达是有效的。在一个实施例中，(a)和(b)的步骤是使用定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法来完成的。在实施例中，该突变是位点特异性突变。
[0012]本发明的一个实施例是表现出相对于野生型植物更弱的fea3表型的植物。另一个实施例是制备所述植物的方法，其中该方法包括以下步骤:(a)将转座子引入到包含内源fea3基因的种质中；(b)获取步骤(a)的种质的子代；(c)以及鉴定步骤(b)的子代植物，其中转座子已经插入到内源FEA3基因，并且观察到fea3表达的降低。步骤(a)还可包括通过转化来将转座子引入到种质的可再生的植物细胞以及由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含转座子。
[0013]在一个实施例中，提供了上述方法，其中所述方法还包括以下步骤:(a)将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含通过上述方法鉴定的弱fea3等位基因；(b)在步骤(a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(C)选择(b)的转基因植物，其中该转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出弱fea3表型。
[0014]另一个实施例是产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含:(i)SEQ ID NO: 1、2或4的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID N0:l、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID N0:l、2或4的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列；(iv)能够在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或(V)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ ID NO:1、2或4的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中转基因植物包含重组DNA构建体且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。另一个实施例是通过这种方法产生的植物。
[0015]一个实施例是在植物中表达异源多核苷酸的方法，该方法包括(a)用重组DNA构建体转化可再生的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中第二多核苷酸是FEA3启动子；(b)在步骤(a)之后，由可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植物，其中转基因植物包含重组DNA构建体，并且进一步地，其中异源多核苷酸在转基因植物中表达。另一个实施例是在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中第二多核苷酸是FEA3启动子，并且其中异源多核苷酸在植物中表达。
[0016]另一个实施例是鉴定具有至少一种农学特性的改变的第一玉米植物或第一玉米种质的方法，该方法包括在第一玉米植物或第一玉米种质中检测至少一种与所述表型相关联的标记基因座的多态性，其中标记基因座编码多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸序列:a)与SEQ ID NO:3或5具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在与对照植物进行比较时，所述多肽在植物或其植物部分中的表达引起至少一种选自下列的农学特性的改变:穗分生组织尺寸、籽粒行数、花序数、在花序内的分枝、花数、果实数、和种子数，其中对照植物包含SEQ ID N0:3或5。另一个实施例是上述方法，其中所述多肽包含如SEQ ID NO: 23、25或27所示的序列。
[0017]本发明包括包含本发明的分离的多核苷酸的重组DNA构建体，该分离的多核苷酸以有义或反义取向可操作地连接至茎端分生组织特异性的或茎端分生组织优选的启动子。
[0018]本发明包括载体，细胞、植物或种子，其包含本发明所述的任何重组DNA构建体中。
[0019]本发明涵盖通过本文所述方法产生的植物。
[0020]本发明也包括包含上文所描述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、Tl和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含至少一种所关注的重组DNA构建体。
[0021]在一个实施例中，植物选自:拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0022]在一个实施例中，包含本发明所描述的重组构建体的植物是单子叶植物。在另一个实施例中，包含本发明所描述的重组构建体的植物是玉米植物。
[0023]【专利附图】
【附图说明】和序列表
[0024]根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和 B1chemicalJournal 219 (N0.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37 C.F.R.§ 1.822所示的规定。
[0025]图1示出用于分离fea3-参考等位基因的图位克隆方法。
[0026]图2A示出显示fea2和fea3在不同组织中的表达分析的RT-PCR数据。分析的不同组织是RAM:根尖分生组织；RE:根伸长区；RAM(1):侧根RAM ；SAM ;茎端分生组织(包括叶原基)；EM:穗花序分生组织。图2B示出原位fea3表达。图2C示出来自非转基因WT和表达RFP标记的FEA3蛋白质的转基因植物膜分级样品用RFP标记的FEA3的抗RFP抗体进行的Western印迹结果。“T”是“总未分级样品”，“S，，是可溶性级份并且“M”是膜级分。
[0027]图3B-3E示出穗发育中与野生型(wt)植物(图3A)相比的fasciated fea3表型。
[0028]图4A-4C示出fea3/fea2双突变体的表型分析。图4A示出与单突变体和wt植物相比，在双突变体的雄穗之间的比较。图4B示出在双突变体、单突变体和wt植物之间的着粒密度比较。图4C示出与单突变体和wt植物相比，在双突变体穗表型之间的比较。
[0029]图5A和图5B示出在CLV3肽根分析中的wt植物、fea2和fea3植物之间的比较。图5B示出定量分析。
[0030]图6示出在CLV3样肽根分析中，在wt植物、fea2和fea3植物之间的定量分析比较。
[0031]图7A和图7B示出在FCPl和乱序肽存在下培养的wt和fea3胚。图7A示出wt和fea3胚的SAM生长，并且图7B示出它们的定量分析。
[0032]图8A-8C示出fea3/tdl双突变体的表型分析。
[0033]序列描述(表I)以及所附序列表遵循如37 C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)和 B1chemicalJ.219(2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37 C.F.R.§ 1.822所示的规定。
[0034]SEQ ID NO:1是fea3wt基因的核苷酸序列。
[0035]SEQ ID NO:2 是 wtfea3 的编码序列。
[0036]SEQ ID NO:3 是 wtfea3 的氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:4是其它拼接的较短fea3的编码序列。
[0038]SEQ ID NO: 5是其它拼接的较短fea3的氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO:6 是由对应于基因座 Atlg68780 (拟南芥菜(Arabidopsis thaliana))的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO:7是由对应于基因座Atlgl3230 (拟南芥菜)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO:8是由对应于基因座At3g25670(拟南芥菜)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO:9是对应于基因座L0C_0s05g43140.1的氨基酸序列，来自密歇根州立大学稻基因组注释计划(Michigan State University Rice Genome Annotat1n Project)Osal释放版本6 (2009年I月)的稻(日本晴)预测蛋白质。
[0043]SEQ ID NO: 10 是对应于 Sb03g008380，一种二色高粱(Sorghum bicolor)预测蛋白质的氨基酸序列，该蛋白质来自US Department of energy Joint Genome Institute的高粱JGI基因序列版本1.4。
[0044]SEQ ID NO:11是对应于Sb03g008360，一种二色高粱预测蛋白质的氨基酸序列，该蛋白质来自 US Department of energy Joint Genome Institute 的高梁 JGI 基因序列版本 1.4。
[0045]SEQ ID NO:12是对应于Glyma20g32610的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆(Glycine max)预测蛋白质。
[0046]SEQ ID NO:13是对应于Glymal0g34950的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆预测蛋白质。
[0047]SEQ ID NO:14是对应于Glyma02gll350的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆预测蛋白质。
[0048]SEQ ID NO:15是对应于Glyma01g22730的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆预测蛋白质。
[0049]SEQ ID NO:16是对应于Glyma05g07800的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆预测蛋白质。
[0050]SEQ ID NO:17是对应于Glymal7gl3210的氨基酸序列，它是来自US Departmentof energy Joint Genome Institute的大豆JGI Glymal.01基因组序列的预测的编码序列的黄豆预测蛋白质。
[0051]SEQ ID NO:18是来自叙利亚马利筋(Asclepias syriaca)的fea3同源物的核苷酸序列。
[0052]SEQ ID NO:19是由SEQ ID NO:18编码的核苷酸序列的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:20是fea3_0参考等位基因的核苷酸序列。
[0054]SEQ ID NO:21是由SEQ ID NO:20编码的fea3_0参考等位基因的蛋白质序列。
[0055]SEQ ID NO:22是EMS突变体fea3_l的核苷酸序列。
[0056]SEQ ID NO:23是由SEQ ID NO:22给定的核苷酸序列编码的EMS突变体等位基因fea3-l的蛋白质序列。
[0057]SEQ ID NO:24是EMS突变体fea3_2的核苷酸序列。
[0058]SEQ ID NO:25是由SEQ ID NO:24给定的核苷酸序列编码的EMS突变体等位基因fea3-2的蛋白质序列。
[0059]SEQ ID NO:26是EMS突变体fea3_3的核苷酸序列。
[0060]SEQ ID NO:27是由SEQ ID NO:26给定的核苷酸序列编码的EMS突变体等位基因fea3-3的蛋白质序列。
[0061]SEQ ID NO:28是FEA3启动子的核苷酸序列。
[0062]SEQ ID NO:29是编码FEA3蛋白质的信号肽的核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO:30是编码RFP-FEA3融合蛋白质的核苷酸序列。
[0064]SEQ ID NO:31 是 FEA3 3，-UTR 的核苷酸序列。
[0065]SEQ ID NO:32_38是用于如实例10所述的CLV3/CLV3样肽分析的肽序列(分别是 ZCL3、FCP1、CLV3、CLE20、CLE40、ZCL21 和 ZCL23)。
[0066]序列描述以及所附序列表遵循如37 C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
[0067]此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic AcidsRes.13:3021-3030(1985)和 B1chemical J.219(N0.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37 C.F.R.§ 1.822所示的规定。
【具体实施方式】
[0068]本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
[0069]如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵义包括多株此类植物，“细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的它们的等同物等等。
[0070]如本文所用:
[0071 ] 术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。
[0072]术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下科:十字花科(Brassicaceae)植物、豆科(Leguminosae)植物、和爺科(Solanaceae)植物。
[0073]术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。
[0074]“转基因”指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
[0075]“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
[0076]“植物”包括整个植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植物的子代。植物细胞无限制地包括来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
[0077]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0078]“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
[0079]“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或能够通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶片的蛋白质、淀粉、或油含量，或通过观察代谢或生理过程，如通过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或通过观察一个或多个基因的表达水平，或通过农学观察如渗透胁迫耐受性或产量。
[0080]“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于低温胁迫下的穗分生组织尺寸、雄穗尺寸、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根分枝、根生物量、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长耐盐性、早期幼苗活力和出苗
[0081]针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
[0082]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5'-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下:“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
[0083]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的Y羧化、羟化和ADP-核糖基化。
[0084]“信使RNA(mRNA) ”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
[0085]“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
[0086]“编码区”是指当转录、加工、和/或翻译时导致多肽序列产生的多核苷酸序列。
[0087]“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白质的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。
[0088]“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
[0089]“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
[0090]“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
[0091]“重组体”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
[0092]“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0093]术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
[0094]“调控序列”或“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5,非编码序列)、中间或下游C非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
[0095]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
[0096]“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
[0097]“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达,但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
[0098]“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0099]术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0100]“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
[0101]“过表达”是指基因产物在转基因生物中超过在来自相同实验的沉默分离(或非转基因)生物中的水平的生产。
[0102]“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
[0103]有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
[0104]“转化的细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。
[0105]在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
[0106]“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
[0107]“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而无基因稳定遗传。
[0108]术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。
[0109]“有利等位基因”为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的细胞壁消化性，或作为另外一种选择，为允许具有下降的细胞壁消化性的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除(“反选择”)。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因，或作为另外一种选择，与不利植物表型共分离，从而提供鉴定植物的有益效果。
[0110]术语“引入”指将核酸(例如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中的手段。引入包括指将核酸整合到真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合到细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。引入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
[0111]“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括减小、降低、减退、下降、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。沉默靶向编码区或非编码区，例如内含子、5’-UTR和3’-UTR、或以上二者。
[0112]抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100%相同或具有少于100%同一性的同一性(如具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性)。
[0113]抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi (RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA (短干扰RNA)构建体和miRNA (微RNA)构建体。
[0114]“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA ”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5，107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列互补。
[0115]“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义取向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA降低)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.16:651-659(1998);以及Gura，Nature 404:804-808 (2000)) ?共抑制构建体可包含来自编码区或非编码区的序列，例如内含子、5’ -UTR和3’ -UTR、或以上二者。
[0116]另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。
[0117]RNA干扰是指由短干扰性RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391:806 (1998))。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire 等人，Trends Genet.15:358(1999))。
[0118]小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。
[0119]小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或引发靶序列的RNA裂解或弓丨发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
[0120]微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码 RNA (Lagos-Quintana 等人，Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana等人，Curr.B1l.12:735-739(2002) ；Lau 等人，Science 294:858-862(2001) ；Lee 和Ambros, Science 294:862-864(2001) ；Llave 等人，Plant Cell 14:1605-1619(2002)；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-728 (2002) ；Park 等人，Curr.B1l.12:1484-1495(2002) ;Reinhart 等人，Genes.Dev.16:1616-1626 (2002))。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。
[0121]微RNA (miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径:(I)翻译抑制；(2) RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。
[0122]术语“基因座”一般是指携带一个基因或可能两个或更多个基因的基因限定的染色体区域，所述两个或更多个基因的连接如此紧密，以至于它们遗传上表现为引起某种表型的单个基因座。当本文用于Fea3时，“Fea3基因座”应是指携带Fea3基因(包括它的相关联调控序列)的染色体的限定区域。
[0123]“基因”应是指基因座内的特定基因编码区，包括它的相关联调控序列。本领域的普通技术人员应当理解，相关联的调控序列将在距Fea3编码序列约4kb的距离内，具有启动子定位的上游。
[0124]“种质”指个体(例如一个植物)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植物。
[0125]序列比对和百分比同一性可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息计算包(DNASTAR?Inc.,Madison,WI)
的MegalignK程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal W比对方法。
[0126]Clustal W 比对方法(描述于 Higgins 和 Sharp, CABI OS.5:151-153(1989)；Higgins, D.G.等人，Comput.Appl.B1sc1.8:189-191(1992))可见于 LASERGENE?生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc., Madison, ffis.)的 MegAlign? v6.1 程序。用于多重比对的默认参数对应于GAP PENALTY = 10、GAP LENGTH PENALTY = 0.2、DelayDivergent Sequences = 30%、DNA Transit1n Weight = 0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、DNA Weight Matrix = IUB。用于成对比对的默认参数是Alignment =缓慢-准确(Slow-Accurate)、Gap Penalty = 10.0、Gap Length = 0.10、Protein WeightMatrix = Gonnet 250、以及 DNA Weight Matrix = IUB。
[0127]用Clustal W程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度是以该方式计算的。
[0128]本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽:
[0129]分离的多核苷酸，其包含:(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W 比对方法在与 SEQ ID NO:3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、23、25 或 27 进行比较时具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列、其中所述全长互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100%互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多肽优选地为FEA3多肽。所述多肽优选地具有FEA3活性。
[0130]分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对方法在与SEQ ID NO:
3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、23、25或 27 进行比较时具有至少 50%,51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性。所述多肽优选地为FEA3多肽。所述多肽优选地具有FEA3活性。
[0131]分离的多核苷酸，其包含:(i)基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO:1、2、
4、18、20、22、24或 26 进行比较时具有至少 50 % ,51 % ,52 % ,53% ,54% ,55 % ,56 % ,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性的核酸序列；或(ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多肽优选地为FEA3多肽。所述多肽优选地具有FEA3活性。
[0132]分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID N0:l、2、4、18、20、22、24或26的全长互补序列的DNA分子杂交。所述多肽优选地为FEA3多肽。所述多肽优选地具有FEA3活性。
[0133]分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过至少一种选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO:1、2、4、18、20、22、24或26:缺失、替换、添加和插入。所述多肽优选地为FEA3多肽。所述多肽优选地具有FEA3活性。
[0134]分离的多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列对应于SEQ ID NO:1、2、4、
18、20、22、24或26的等位基因。
[0135]在一个实施例中，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含本发明的多核苷酸，其以有义或反义取向可操作地连接至至少一个调控序列(例如在植物中有功能的启动子)。多核苷酸可包含SEQ ID NO:
1、2、4、18、20、22、24 或 26 的 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 个连续的核苷酸。多核苷酸可编码本发明的多肽。
[0136]本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook, J., Fritsch, E.F.和 Maniatis, T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989 (下文称为 “Sambrook” )。
[0137]本领域内的技术人员应当很好地理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件而引导基因的表达。
[0138]可用于本发明的启动子包括但不限于茎端分生组织特异性的启动子和茎端分生组织优选的启动子。玉米knotted I启动子和来自已知在玉米SAM中表达的基因的启动子可用于表达本发明公开的多核苷酸。此类基因的例子包括但不限于Zm phabulosa、terminal earl、rough sheath2、rolled leafl> zybl4> narrow sheath(Ohtsu, K.等人，(2007)Plant Journal 52，391_404)。来自其它物种的这些基因的直系同源物的启动子也可用于本发明。
[0139]来自SAM优选表达的基因的拟南芥启动子的例子包括但不限于clv3、aintegumenta—like (ail5、ail6、 和 ail7)和 terminal ear likel、clavatal、wus、shootmeristemless、terminal flowerl (Yadav 等人(2009) Proc Natl Acad Sci USA.March 24)。
[0140]PCT公开WO 2004/071467和美国专利7，129，089描述通过以独特组合将单个启动子、基因和转录终止子连接在一起来合成多个启动子/基因/终止子盒组合。一般来讲，侧接合适启动子的NotI位点用于克隆期望基因。可使用PCR扩增，用经设计用于在基因5’和3’末端处引入NotI位点的寡核苷酸将NotI位点加到受关注的基因上。然后用NotI消化所得PCR产物，并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。虽然将基因克隆进表达盒常利用NotI限制性酶完成，本领域技术人员可认识到能够利用多种限制性酶获得期望的盒。另外，本领域技术人员将会知道可利用其它克隆技术，包括但不限于基于PCR的或基于重组的技术生成合适的表达盒。
[0141]此外，WO 2004/071467和美国专利7，129，089描述了为了获得所需表型表达，还将单个启动子/基因/转录终止子盒与合适的选择性标记盒以独特组合和取向连接到一起。虽然这主要使用不同的限制性酶位点来完成，但本领域的技术人员可认识到可利用多种技术来获得所需的启动子/基因/转录终止子组合或取向。这样做可获得茎端分生组织特异性的启动子/基因/转录终止子盒的任何组合和取向。本领域的技术人员还可认识到这些盒可位于单个DNA片段上或在多个片段上，该处基因共表达是多个DNA片段共转化的结果。
[0142]术语“根构造”指构成根的不同部分的布置方式。术语“根构造”、“根组织结构”、“根系”或“根系结构”在本文中可互换使用。
[0143]如本文所述，“根倒伏”、“根分枝”和“根生物量”的改变是“根构造”改变的例子。
[0144]一般来讲，植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中，初生根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中，植物的初生根发生分枝，生成须根系。
[0145]术语“改变的根构造”指与参照植物或对照植物比较，在其不同发育阶段构成根系的不同部分的改变状况。应该理解，改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变，所述根系部分包括但不限于初生根、侧根或分枝根、不定根和根毛，所有这些均在本发明的范围内。这些改变可导致根所占的区域或空间的整体改变。
[0146]本领域的普通技术人员熟悉确定植物根构造改变的规程。例如,可检测分析Wt和突变体玉米植物的根构造在幼苗期、花期或成熟期的改变。
[0147]根构造的改变可通过统计温室培育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来确定。
[0148]“根带”指成熟期植物在花盆底部的根丛宽度。植物根构造变化的其它量度包括但不限于侧根的数量、节根的平均根直径、侧根的平均根直径、根毛的数量和长度。
[0149]侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)可通过这样确定:从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZO?软件(Regent InstrumentsInc.)分析。
[0150]根倒伏是不发生根倒伏的植物的量度；倾斜与垂直轴成大约30度角或更大角度的植物将被统计为发生根倒伏。
[0151 ] 也可通过在田间测试中，在相同条件下比较植物与对照或参照植物提高产量的能力，来评价植物根倒伏、根生物量和根分枝的改变。
[0152]对提取的有关根表型的数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植物的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可以使用单因素方差分析。
[0153]也可通过在田间测试中比较植物在胁迫条件下(例如营养物质过剩或受限、水过剩或受限、存在病害)保持基本产量(例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%产量)的能力，与非胁迫条件下的对照或参照植物的产量，来评价根倒伏、根生物量和根分枝改变。野生型FEA3或“fasciated ear3”基因编码预测的富含亮氨酸重复序列受体样蛋白质(LRR-RLP)，其由506个氨基酸组成。术语“野生型FEA3基因”、“FEA3 wt基因”、“Fea3基因”和“FEA3基因”本文互换使用。拟南芥包含三种FEA3直系同源物 At3g25670、Atlg 13230、和 Atlg68780。
[0154]LRR-RLP 构成一大类包含 LRR 的蛋白质(Wang, G.等人(2010)Critical Reviewsin Plant Science, 29:285-299)。从结构上来说，可将LRR-RLP分成以下七个不同的域:信号肽、富含半胱氨酸的域、细胞外LRR(eLRR)域、可变域、酸性域、跨膜域、和短的细胞质区域(Jones 和 Jones (1997) Adv.Bot.Res.24:89-167)。包含 LRR 的 C 域由三个亚域组成，它们具有无LRR的岛状亚域(C2)，其插入eLRR亚域Cl和C3，但是不是所有的RLP含有C2岛状结构(Wang, G.等人(2008)Plant Phys1ll47:503-517)。
[0155]我们对于fea2/fea3双突变体的分析表明fea2和fea3以独立的途径发挥作用。
[0156]我们对于tdl/fea3双突变体的分析表明tdl和fea3以独立的途径发挥作用。
[0157]术语带化来自拉丁文fascis,意指束(带)，描述由增生引起的植物外形的变化。
[0158]具有fea3突变的植物，其中该突变导致FEA3功能的丧失或FEA3表达的消除，也称为“fea3植物”或“fea3无效植物”。“fea3无效植物”表现出“fea3表型”或“fea3无效表型”。fea3植物在花序和花梗发育期间发育出较大的分生组织，并且穗花序分生组织显示严重的带化，表明fea3通常用于限制这些分生组织的生长。
[0159]具有弱fea3突变的植物，其中该突变导致fea3功能的部分丧失或fea3表达的部分消除，也称为“具有弱fea3表型的fea3植物”。“弱fea3植物”表现出“弱fea3表型”。具有弱fea3等位基因的fea3植物表现出与fea3无效植物相似、但是程度更低的表型。具有弱fea3等位基因的fea3植物也可表现出部分fea3无效表型，即，可能不表现出全部fea3无效特性。本文所述的“弱fea3等位基因”是fea3变体或SEQ ID NO:1、2或4的变体，它们赋予植物弱fea3表型。
[0160]具有fea3突变的植物表现出“无效fea3表型”或“弱fea3表型”，本文将该植物称为具有“突变fea3表型”的植物。
[0161]如本文所用，术语“显性负突变”是指具有改变的基因产物的突变，该基因产物的作用拮抗野生型等位基因。这些突变通常导致改变的分子功能(常常是失活的)并且特征在于“显性负”表型。赋予“显性负表型”的基因变体、突变基因或等位基因将赋予宿主细胞“无效”或“突变”表型，甚至在野生型等位基因的存在下依然如此。
[0162]如本文所用，具有“FEA3活性”的多肽(或多核苷酸)是指当在“fea3突变系”中表达时，表现出“fea3突变体表型”的多肽(或多核苷酸)，其能够部分或完全拯救fea3突变体表型。
[0163]术语“基因改组”和“定向进化”本文互换使用。“基因改组”方法包括反复进行DNA改组，然后通过适当的筛选和/或选择以生成具有改变的生物活性的FEA3核酸变体或其部分(Castle 等人，(2004) Science 304(5674):1151-4 ;美国专利 5，811，238 和 6，395，547)。
[0164]“TILLING”或“定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Les1ns INGenomics) ”是指一种诱变技术，其用于产生和/或鉴定、并且最终分离具有调控表达和/或活性的特定核酸的诱变变体(McCallum等人，(2000), Plant Phys1logyl23:439-442 ；McCallum 等人,(2000)Nature B1technology 18:455-457 ;以及 Colbert 等人，(2001)Plant Phys1logy 126:480-484)。
[0165]TILLING组合高密度点突变，快速灵敏地检测突变。通常使用甲磺酸乙酯(EMS)诱变植物种子。EMS烷基化鸟嘌呤，这通常导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS溶液中约10至20小时；洗涤种子并随后播种。将这一代植物称为Ml。Ml植物随后自体繁殖。存在于形成生殖组织的细胞中的突变被下一代继承(M2)。通常筛选M2植物以获得期望基因和/或特定表型的突变。
[0166]TILLING也允许选择携带突变体的植物。这些突变体可表现出在强度或位置或时间上改变的表达(如果突变影响例如启动子)。这些突变体甚至可表现出比天然形式的基因表现出的FEA3活性更低的活性。TILLING组合高密度诱变与高通量筛选方法。TILLING 中的步骤通常为:(a)EMS 诱变(Redei G P 和 Koncz C(1992)In Methods inArabidopsis Research, Koncz C, Chua N H, Schell J 编辑，Singapore, World ScientificPublishing Co,第 16-82 页；Feldmann 等人，(1994) In Meyerowitz E M, Somerville C R编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,第 137-172 页；Lightner J 和 Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas 编辑，Methods on Molecular B1logy, Vol.82.Humana Press, Totowa, N.J.,第 91-104 页)；(b)DNA制备和个体集合；(c)受关注区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链核酸分子；(e)DHPLC，其中在集合中存在的异源双链核酸分子在色谱中检测为额外的峰；(f)鉴定单个突变体；以及(g)对突变PCR产物测序。TILLING方法是本领域为人们所熟知的(美国专利 US8, 071，840)。
[0167]也可使用其它突变方法以将突变引入FEA3基因。用于将基因突变引入植物基因并选择具有期望性状的植物的方法是熟知的。例如，种子或其它植物材料可根据标准技术用突变化学物质处理。此类化学物质包括但不限于如下方法:硫酸二乙酯、乙烯亚胺、和N-亚硝基-N-乙基脲。作为另外一种选择，可利用电离辐射，其来自辐射源如X-射线或Y射线。
[0168]可使用用于检测FEA3基因中的突变的其它检测方法，例如毛细管电泳(例如恒定变性毛细管电泳和单链构象多态性)。又如，可利用错配修复酶学检测异源双链核酸分子(例如来自芹菜的CELI内切核酸酶)。CELI识别错配并精确地切开错配的3'侧。错配的精确碱基位点可通过用错配修复酶切割，随后进行例如变性凝胶电泳来确定。参见例如 Oleykowski 等人，(1998) “Mutat1n detect1n using anovel plant endonuclease”Nucleic Acid Res。26:4597-4602 ；以及 Colbert 等人，(2001) “High-Throughput Screening for Induced Point Mutat1nsT3Iant Phys1logy126:480-484o
[0169]包含突变fea3基因的植物可与其它植物杂交以将突变引入另一个植物。这可使用标准育种技术完成。
[0170]同源重组允许将选择的核酸在限定的选择位点引入基因组。同源重组已经在植物中展不。参见例如 Puchta 等人，(1994)，Experientia 50:277-284 ；Swoboda 等人，(1994)，EMBO J.13:484-489 ；Offringa 等人，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:7346-7350 ；Kempin 等人，(1997) Nature 389:802-803 ；以及 Terada 等人，(2002) NatureB1technology,20 (10): 1030-1034)。
[0171]用于在植物中进行同源重组的方法已经不仅对模型植物进行了描述(Offringa等人，(1990) EMBO J.0ctober ；9(10):3077-84)，而且对作物植物例如稻进行了描述(Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, Iida S.Nat B1technol.2002 ；Iida 和Terada:Curr Opin B1technol.2004 年 4 月；15(2):1328)。靶向核酸(其可为如前文所定义的FEA3核酸或其变体)不需要分别靶向FEA3基因的基因座，但是可被引入例如高表达区。靶向核酸可为弱fea3等位基因或显性负等位基因，它们用于替换内源基因或此外可被引入内源基因。
[0172]转座元件可基于它们的转座模式归类为两大类。这些称为I类和II类；它们均具有作为诱变剂和递送载体的用途。I类转座元件通过RNA中间体转座并利用反转录酶，即，它们是逆转录因子。存在至少三种类型的I类转座元件，例如反转录转座子、反座子、SINE样元件。反转录转座子通常含有LTR、和编码病毒外壳蛋白质(gag)与逆转录酶的基因、RnaseH、整合酶和聚合酶(pol)基因。已经描述了植物物种中的多个反转录转座子。此类反转录转座子经由RNA中间体在由转座子编码的逆转录酶和RNA酶H催化的反应中移动和易位。例子分成Tyl-copia和Ty3_gypsy组以及分成SINE样和LINE样类别(Kumar和Bennetzen (1999) Annual Review of Genetics 33:479)。此外，DNA 转座兀件如 Ac、Taml和En/Spm也存在于广泛多种植物种类中，并且可在本发明中利用。转座子(和IS元件)是用于将突变弓I入植物细胞的常见工具。
[0173]茎端分生组织(SAM)在发育期间通过平衡干细胞增殖和进入原基的子细胞来调节它的尺寸。已经在玉米中鉴定了多个具有增大分生组织的“带化”突变体，并且它们可用于研究分生组织尺寸调节的遗传基础。两个玉米基因，thick tassel dwarf I (tdl ；Bommert等人，(2005) Development 132:1235-1245)和 fasciated ear2(fea2 ；Taguch1-Sh1bara等人，(2001) Genes Dev.6515:2755-2766)，分别与拟南芥富含亮氨酸重复序列(LRR)受体基因CLAVATA1 (CLVl)和CLAVATA2 (CLV2)同源。预测CLVl和CLV2形成受体复合物，其由CLV3配体激活并抑制干细胞促转录因子WUSCHEL。然而fea2/tdl双突变体的分析表明基本的CLV1-CLV2共受体模式可能是较复杂的，因为fea2/tdl双突变体显示比任一单独突变体更严重的表型。近来对拟南芥的分析揭示三种主要受体复合物(CLV1-BAM1 (BARELYANY MERISTEM1)、CLV2-CRN (CORYNE)、和 RPK2/TOAD2 (RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE2/T0ADT00L2))的单独作用是拟南芥中合适的分生组织尺寸控制所必需的。
[0174]此处我们给出了玉米突变体fea3的表型和分子表征，该突变体引起花序分生组织过度增殖，导致增大的或带化的分生组织。我们利用图位克隆方法和由部分反转录转座子插入fea3基因座的外显子产生的突变体克隆了 fea3基因。我们通过分离来源于靶向EMS诱变的三个附加fea3等位基因确认了这种同一性。FEA3基因编码预测的富含亮氨酸重复序列受体样蛋白质，其涉及fea2。原位杂交和红色荧光蛋白质标记的转基因植物示出FEA3在SAM组织中心表达并且还在根尖分生组织中表达。FEA3位于细胞质膜内。为了确定FEA3是否响应于CLV3相关(CLE)肽，我们测试它对不同肽的灵敏度。fea3突变体显示降低的肽灵敏度，但是令人感兴趣地是与FEA2相比它们响应于不同的CLE肽。fea2/fea3和tdl/fea3的双突变体在穗和雄穗中具有增加的和协同的带化表型，表明它们以会聚在相同下游目标以控制分生组织尺寸的独立途径作用。因此，FEA3作为受体蛋白质的功能处于不同于TDl和FEA2途径的新途径中。
[0175]实施例:
[0176]在一个实施例中，可用于本发明方法的fea3变体是一种或多种以下fea3核酸变体:(i)fea3核酸序列(SEQ ID NO:1、2或4)的部分；(ii)能够与fea3核酸序列(SEQ IDN0:l、2或4)杂交的核酸序列；(iii)fea3核酸序列(SEQ ID N0:l、2或4)的拼接变体；
(iv)fea3核酸序列(SEQ ID N0:l、2或4)的天然存在的等位基因变体；(V)通过基因改组获取的fea3核酸序列；(vi)通过定点诱变获取的fea3核酸序列；(vii)通过TILLING方法获取并鉴定的fea3变体。
[0177]在一个实施例中，内源FEA3的表达水平可在植物细胞中通过反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体、RNA干涉作用、人工小RNA和基因组缺失而下降。基因组缺失的例子包括但不限于转座子、tilling、同源重组诱导的缺失。
[0178]在一个实施例中，可使用经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已经经修饰以用设计用于产生指向FEA3的miRNA的序列替换miRNA编码区；前体也在主链序列中进行修饰以响应miRNA编码区中的改变。
[0179]在一个实施例中，在本发明方法中使用的FEA3核酸变体是通过基因改组获取的核酸变体。
[0180]在一个实施例中，也可利用TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术将基因修饰引入玉米FEA3基因的基因座。
[0181]在一个实施例中，可利用定点诱变生成fea3核酸的变体。可利用多种方法实现定点诱变；最常用的方法是基于PCR的方法(美国专利7956240)。
[0182]在一个实施例中，也可利用同源重组失活或降低内源FEA3基因在植物中的表达。
[0183]同源重组可通过特定靶向体内的FEA3基因用于诱导定向基因修饰。体外制备在FEA3基因序列(例如本文提供的那些)的选择部分(包括5'上游、3'下游、和基因间区)中的突变并且利用标准技术将它们引入期望的植物。在引入的突变fea3基因和目标内源FEA3基因之间的同源重组将导致转基因植物中野生型基因的定向取代，导致FEA3表达或活性的抑制。
[0184]在一个实施例中，催化RNA分子或核糖酶也可用于抑制FEA3基因的表达。设计特定地与事实上的任何目标RNA配对并在特定位置裂解磷酸双酯骨架，从而功能上失活目标RNA的核糖酶是可能的。在进行这种裂解时，核糖酶不发生自体改变，并且因此能够循环利用并裂解其它分子。在反义RNA中包括核糖酶序列赋予它们RNA裂解活性，从而提高构建体的活性。已经鉴定了多类核糖酶。例如，一类核糖酶来源于多个小的环形RNA，它们能够自体裂解并在植物中复制。该RNA能够单独复制(类病毒RNA)或用辅助病毒(卫星RNA)复制。RNA的例子包括来自鳄梨日斑病类病毒的RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿暂时性线条病毒、绒毛烟斑驳病毒、茛菪斑驳病毒和地三叶草斑驳病毒的卫星RNA。已经描述了目标RNA特异性核糖酶的设计和使用。参见例如Haseloff等人，(1988) Nature, 334:585_591。
[0185]用于失活FEA3基因的另一种方法是通过抑制表达的有义抑制。引入其中相对于启动子以有义取向配置的核酸的表达盒已经显示为一种用于阻止期望靶基因转录的有效方法。(Napoli 等人(1990)，The Plant Cell 2:279_289，和美国专利 5，034，323、5，231，020、和 5，283，184)。
[0186]在一个实施例中，FEA3基因也可通过例如基于转座子的基因失活而被失活。
[0187]在一个实施例中，失活步骤包括在FEA3基因序列中制造一个或多个突变，其中在FEA3基因序列中的一个或多个突变包括一个或多个转座子插入，从而与相应的对照植物相比失活FEA3基因。例如，该突变可包括在FEA3基因中的纯合缺失，或一个或多个突变包括在FEA3基因中的杂合缺失。
[0188]将这些可移动的遗传因子例如通过有性杂交递送至细胞，选择转座并且筛选所得插入突变体，例如用于获得所关注的表型。包含缺失fea3基因的植物可与wt植物杂交。取决于将进行杂交的物种，可使用多种标准育种技术中的任何一种。在分离或重组植物的基因组中的TN(转座子)位置可通过已知方法来确定，例如如本文所述的侧接区域测序。例如，植物的PCR反应可用于扩增序列，其随后可进行诊断测序以确认它的起源。任选地，筛选插入突变体以获得期望的表型，例如抑制fea3的表达或活性，或改变农学特性。
[0189]实M
[0190]本发明将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
[0191]实例I
[0192]克降玉米fea3某闵
[0193]使用图位克隆方法分离fea3-0参考等位基因(SEQ ID NO:20)，它对于染色体3进行初始作图(图1)。通过精细定位鉴定在编码富含亮氨酸重复序列受体样蛋白质的基因内的部分反转录转座子插入。为了确认这一插入是效应性突变，进行定向EMS筛选，其允许我们鉴定fea3的三个附加等位基因，称为fea3-l、_2和_3(分别是SEQ ID NO:22、24、和26)。
[0194]fea3使用混合分群作图进行初始定位。947个个体的作图群体用于将基因座置于BACs C0267M03和c0566I18之间，?6 BACs的区域包含?25个预测基因。测序和表达分析揭示了一个候选的LRR受体样蛋白质，其在fea3-0等位基因中具有小的插入。利用定向EMS筛选从?10，000个Ml植物中鉴定三个附加的等位基因。每个等位基因的测序揭示相对于初代的氨基酸变化，证实分离了正确的基因。
[0195]实例2
[0196]FEA2和FEA3某闵的表汰分析
[0197]在不同组织中对FEA2和FEA3完成RT-PCR。图2A示出FEA22和FEA3在不同组织中的表达。FEA2和FEA3显示在茎端分生组织中的最强表达。图2B示出FEA3的原位表达，显示在分生组织中心的表达检测。这个区域与WUS表达区域重叠。这个图案与其它已知的带化穗突变体差异很大(花序转变阶段)。
[0198]实例3
[0199]玉米突夺体fea3表型
[0200]在营养生长期间，fea3突变体植物看起来正常。然而，在转入开花期后，在花序发育早期，fea3突变体穗(图3B)示出与野生型相比变平和增大的花序分生组织(頂)(图3A)。在发育后期，IM的增大引起突变体中的带化(图3C)。在成熟期，野生型穗显示规则间距的和有组织的穗行(图3D)，而fea3突变体穗显示逐渐增大的穗顶端、附加的穗行和总体上不规则排列的行(图3E)。
[0201]实例4
[0202]fea3/fea2双突变体分析
[0203]玉米fea3/fea2双突变体的雄穗比单个突变体更粗和更短(图4A)。通过计算沿主花序轴每cm的着粒来分析着粒密度。双突变体显示着粒密度的显著提高，指示在fea3和fea3之间的附加效应(图4B)。相似地，双突变体穗表型示出增加的带化(图4C)。这些结果表明FEA2和FEA3以不同的途径作用。
[0204]实例5
[0205]Clavata3 妝根分析
[0206]在拟南芥中，CLAVATA2活性可通过根生长对CLAVATA3 (CLV3)肽的响应进行检测。为了分析是否FEA3和FEA2响应CLV3，并且确定它们是否以常见的途径作用，进行CLV3肽分析。B73和纯合fea2以及fea3突变苗萌发并在包含CLV3肽的琼脂板上生长。作为对照，苗也在包含突变变型肽和无任何肽的板上生长。在7天后测量初生根的长度。B73野生型植物显示强的根生长抑制，这是响应CLV3肽的结果，但是fea2突变体不响应CLV3肽。令人感兴趣地是，fea3突变体响应CLV3肽，即使FEA3在根中表达依然如此(图5)。
[0207]实例6
[0208]从FEA3启动子表达红色荧光蛋白质
[0209]制备重组DNA构建体以允许体内定位FEA3，其已经用红色荧光蛋白质(RFP)进行了标记。构建体以5’至3’的取向包含以下元件:1)FEA3启动子；2)FEA3信号肽编码区；3)RFP-FEA3融合蛋白质编码区；和4)FEA3 3’ UTR0产生包含这种重组DNA构建体的转基因玉米植物。转基因植物分析揭示RFP-FEA3融合蛋白质在穗和雄穗的花序分生组织中心区表达。
[0210]为了研究是否FEA3位于膜或可溶性级份中，在膜分级后进行western印迹。使用的组织是幼雄穗(约0.5?3cm的雄穗)，其来自如上所述表达RFP标记的FEA3蛋白质的转基因植物。图2C示出RFP标记的FEA3位于细胞质膜中，箭头指示约83kD的条带尺寸，其预期是RFP标记的FEA3的融合尺寸。
[0211]实例7
[0212]Clavata3样妝根分析
[0213]为了分析是否FEA3响应CLV3样肽，并且确定它们是否以常见的途径作用，进行CLV3 肽分析。使用的肽是 ZCL3 (玉蜀黍 CLE 样 3 ;SEQ ID NO:32)、FCPl (SEQ ID NO:33)、CLV3 (SEQ ID NO:34)、CLE20 (SEQ ID NO:35)、CLE40 (SEQ ID NO:36)、ZCL21 (玉蜀黍 CLE样 3 ;SEQ ID NO:37)、和 ZCL23 (玉蜀黍 CLE 样 23 ；SEQ ID NO:38)。
[0214]通过使用CLV3、CLE、和稻相关肽的同源性搜索发现ZCL肽存在于NCBI数据库中的玉米序列中(Fiers 等人 Plant Cell (2005)，17:2542-2553 ；Suzaki 等人(2008)，PlantCell,20:2049-2058)。
[0215]B73和fea3突变苗萌发并在各包含5 μ M或10 μ M肽的琼脂板上生长。作为对照，苗也在包含乱序肽的板上生长。在7天后测量初生根的长度。Β73野生型植物显示强的根生长抑制，这是响应 ZCL3(SEQ ID NO:32)、FCPl (SEQ ID NO:33)和 CLV3 (SEQ ID NO:34)肽的结果。令人感兴趣地是，fea3突变体显示对FCPl肽较低的敏感性(图6)。
[0216]实例8
[0217]在FCPl肽的存在下的胚培养物分析
[0218]Wt和fea3胚在20 μ M FCPl肽(SEQ ID NO: 33)或20 μ M乱序肽的存在下进行培养。为了测量胚SAM生长，在授粉后约10天，给胚灭菌(整株玉米进行灭菌，不是单个幼苗)并把胚切碎，并且把胚向下放到培养基上，在种植后两周完成SAM尺寸测量(胚培养)。发现WT胚SAM生长受到FCPl的强抑制，但是fea3胚显示抗性(图7A示出比较wt和fea3胚SAM生长的图像，并且图7B示出它们的定量分析)。柱状图在图7B中示出，P < 0.0001
[0219]实例9
[0220]fea3/tdl双突变体分析
[0221]玉米fea3/tdl双突变体的雄穗比单个突变体更粗和更短(图4A)。通过计算沿主花序轴每cm的着粒来分析着粒密度。双突变体显示着粒密度的显著提高，指示在fea2和fea3之间的附加效应(图4B)。相似地，双突变体穗表型示出增加的带化(图4C)。这些结果表明FEA2和FEA3以不同的途径作用。
[0222]实例 10
[0223]在其它植物物种中的fea3肓系同源物分析
[0224]也可通过进行如实例1-9对玉米FEA3所做的实验分析拟南芥、稻、高粱和大豆的直系同源物FEA3。
【权利要求】
1.一种产生具有下降的内源fea3表达的转基因植物的方法，所述方法包括: a.将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含可操作地连接至启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的表达降低内源fea3的表达； b.在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的fea3表达。
2.—种产生具有下降的内源fea3表达的转基因植物的方法，所述方法包括: a.将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 1.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； ii基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO: 1、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； ii1.SEQ ID NO:1、2或4的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列； iv.能够在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 V.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ IDNO:1、2或4的miRNA的序列替换所述miRNA编码区； b.在步骤(a)之后，使转基因植物细胞再生，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出下降的FEA3表达。
3.—种产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，所述方法包括: a.将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽的片段或变体，基于Clustal W比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO:3或5进行比较时具有至少80%的序列同一性，其中所述片段或所述变体赋予在所述可再生的植物细胞中的显性负表型； b.在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:穗分生组织尺寸、籽粒行数、叶数、花序数、在所述花序内的分枝、花数、果实数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。
4.一种鉴定fea3的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步骤: a.对突变体玉米植物的群体进行基因筛选； b.鉴定表现出比fea3无效植物更弱的fea3表型的一个或多个突变体玉米植物；以及 c.从所述具有更弱的fea3表型的突变体玉米植物中鉴定所述弱fea3等位基因。
5.一种鉴定fea3的弱等位基因的方法，所述方法包括以下步骤: a.使用编码SEQID NO:3或5、或与SEQ ID NO:3或5至少70%相同的蛋白质、或其片段的一种或多种核苷酸序列进行基因改组； b.将来自步骤(a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中； c.由步骤(b)的经转化的可再生的植物细胞的群体再生出经转化的植物的群体； d.针对弱fea3表型，筛选来自步骤(C)的经转化的植物的群体；以及 e.从所述表现出弱fea3表型的经转化的植物中鉴定所述弱fea3等位基因。
6.一种植物，其中所述内源FEA3基因的表达相对于对照植物是降低的。
7.一种植物,所述植物相对于野生型植物表现出弱fea3表型。
8.一种制备权利要求6所述的植物的方法，所述方法包括以下步骤: a.向所述内源FEA3基因中引入突变；以及 b.检测所述突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使用步骤(a)和(b)是使用定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法来完成的，并且其中所述突变对于降低所述内源FEA3基因的表达或其活性是有效的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述突变是位点特异性突变。
11.一种制备权利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤: a.将转座子引入到包含内源fea3基因的种质中； b.获取步骤(a)的种质的子代；以及 c.鉴定步骤(b)的子代植物，其中所述转座子已经插入到所述内源FEA3基因，并且观察到fea3表达的降低。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(a)还包括通过转化来将所述转座子引入到所述种质的可再生的植物细胞中以及由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述转座子。
13.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤: 1.将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含通过权利要求4或5所述的方法鉴定的弱fea3等位基因； ii在步骤(i)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 ii1.选择(ii)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出弱fea3表型。
14.根据权利要求2或3所述的方法，其中部分(a)的多肽在具有所述fea3突变体基因型的植物品系中的表达能够部分或全部恢复所述野生型表型。
15.一种产生具有改变的农学特性的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤: a.将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: 1.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； ii基于Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO: 1、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； ii1.SEQ ID NO:1、2或4的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列； iv.能够在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 V.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQ IDNO:1、2或4的miRNA的序列替换所述miRNA编码区； b.在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。
16.根据权利要求1-5或8-15中任一项所述的方法，其中所述植物选自:拟南芥、番爺、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
17.一种植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向或以上两种取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: a.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； b.基于ClustalW比对方法，在与SEQ ID NO: 1、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； c.能够在严格条件下与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或 d.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQIDNO:1、2或4的miRNA的序列替换所述miRNA编码区；并且 其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。
18.根据权利要求17所述的植物，其中所述植物选自:拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
19.权利要求17或权利要求18所述的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含以有义或反义取向可操作地连接至在植物中有功能的启动子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含: a.SEQ ID NO:1、2或4的核苷酸序列； b.基于ClustalW比对方法，在与SEQ ID NO: 1、2或4进行比较时具有至少90%的序列同一'I"生的核苷酸序列； c.SEQ ID NO:1、2或4的至少100个连续的核苷酸的核苷酸序列；或 d.经修饰的植物miRNA前体，其中所述前体已经经修饰以用设计用于产生指向SEQIDNO:1、2或4的miRNA的序列替换所述miRNA编码区；并且 其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自下列的农学特性的改变:增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、根分枝、根生物量、根倒伏、生物量和产量。
20.—种在植物中表达异源多核苷酸的方法,所述方法包括: a.用重组DNA构建体转化可再生的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3启动子； b.在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及 c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体，并且进一步地，其中所述异源多核苷酸在所述转基因植物中表达。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物选自:拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
22.—种植物，所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3启动子，并且其中所述异源多核苷酸在所述植物中表达。
23.根据权利要求22所述的植物，其中所述植物选自:拟南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
24.权利要求22或权利要求23所述的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的异源多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是FEA3启动子序列，并且其中所述异源多核苷酸在由所述种子产生的植物中表达。
25.一种鉴定具有至少一种农学特性的改变的第一玉米植物或第一玉米种质的方法，所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米种质中检测至少一种与所述表型相关联的标记基因座的多态性，其中所述标记基因座编码多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸序列:a)与SEQ ID NO:3或5具有至少90%且小于100%的序列同一性的氨基酸序列，其中在与对照植物进行比较时，所述多肽在植物或其植物部分中的表达引起至少一种选自下列的农学特性的改变:穗分生组织尺寸、籽粒行数、花序数、在所述花序内的分枝、花数、果实数和种子数，其中所述对照植物包含SEQ ID NO:3或5。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID NO:23、25或27所示的序列。
【文档编号】A01H5/10GK104168760SQ201380013957
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年3月14日
【发明者】S.M.艾伦, D.P.贾克森, B.I.杰, M.科马特苏, Y.K.李, H.萨凯 申请人:纳幕尔杜邦公司, 冷泉港实验室