血叶兰组织培养快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种繁殖血叶兰的方法，特别涉及一种血叶兰组织培养快速繁殖方 法，属于植物组织培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 血叶兰是兰科血叶兰属植物。全属4种，我国仅1种，即血叶兰。生于海拔900-1300 米山坡或沟谷常绿阔叶林下阴湿处。血叶兰兼备观赏和药用。根茎匍匐状，形似蚕，茎节生 根，叶呈紫黑色，上有细小的绒毛，有金红色或银白色脉纹，似丝绒状，十分美丽，具有较高 的观赏价值。它又是民间传统的中草药，全草入药，有滋阴润肺、清热凉血之功效，治疗肺结 核咯血、神经衰弱、食欲不振等症的疗效甚佳。由于人类过度挖掘利用，野生资源越来越稀 少，现已濒临灭绝的危险，属珍稀的物种之一。
[0003] 由于血叶兰为兰科植物，其种子微小胚发育不成熟，自然条件下种子发芽率低下， 随着人们的过度采挖及其生态资源环境的破坏，野生血叶兰资源非常稀少，濒临灭绝。
[0004] 目前，血叶兰种苗的繁殖方法有分株繁殖和扦插繁殖，繁殖系数低，难以满足规模 化种植需求；血叶兰的组织培养快繁已有报道，一种是采用人工授粉获得蒴果，进行种子无 菌播种繁殖，但未见详细报道；茎段和顶芽组织培养快繁主要是通过"诱导产生类原球茎、 类原球茎增殖、类原球茎分化及壮苗和生根培养"的途径来生产，直接导致后代产生变异， 且培养时间长、程序繁琐、成本高，因此，如何缩短培养时间、提高种苗遗传稳定性、降低培 养成本已成为血叶兰规模化、商品化生产急需解决的问题，同时还利于保护与合理利用血 叶兰资源。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，以解决现有技术中 存在的上述问题，本发明所提供的方法不仅能有效缩短血叶兰培养时间，提高增殖倍数达 4. 67,提高有效芽数达100%，获得足量试管植株；还能提高血叶兰种苗稳定性，降低培养 成本，为其规模化生产应用奠定基础。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速 繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0008] (1)外植体的准备阶段
[0009] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，从中 选取叶片硬挺、无病虫害的茎段的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放 置2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0010] 先在网室内用河沙种植短暂的时间，是为了减少野外杂菌和使野生植株恢复生 长，提高外植体消毒灭菌效率。
[0011] ⑵消毒阶段
[0012] 将步骤（1)中所准备的外植体在800-1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒， 浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20-25min;消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将 外植体表面的水吸干，备用；
[0013] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0014] ①建立外植体无菌培养体系
[0015] 将步骤（2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修剪后插入诱导 培养基A中；
[0016] 培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，进行无光照黑暗培养，培养周期 为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0. 3-0. 5mg/LNAA+6. 5-7. 2g/L琼脂 +2. 0-2. 5g/L活性炭，pH值为 5. 2-5. 6 ;
[0017]②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
[0018] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导 培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，光照强度为 1000-20001ux，光照周期为8-10h/d，培养周期为20-30天；所述诱导培养基B为：MS基本 培养基 +〇? 2-0. 3mg/L6-BA+0. 5-0. 8mg/LNAA+8. 0-8. 5g/L琼脂 +15-25g/L白糖，pH值为 5. 2~5. 6 ；
[0019] 经诱导培养后，顶芽伸长带2-5个茎节，茎段腋芽萌发伸长具2-4个茎节；
[0020] (4)增殖培养阶段
[0021] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增 殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，光照强度为 2000-30001ux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天；
[0022] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+0? 5-1.Omg/L6-BA+0. 3-0. 5mg/L NAA+1. 0-2. 5g/L蛋白胨 +6. 0-7.Og/L琼脂 +15-25g/L白糖，pH值调整为 5. 2-5. 6 ;
[0023] 经增殖培养后，茎节腋芽萌发伸长、叶片伸展、芽健壮，可用于继续切割茎节增殖 培养，增殖倍数达3. 87-5. 46倍，可继代增殖8-12次；
[0024] (5)生根培养阶段
[0025] 将步骤（4)增殖培养获得的带2.Ocm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生 根培养；培养环境温度为23±21：，环境湿度为45-55%，光照强度为3000-45001^?，光照周 期为10-12h/d，培养周期为30-40天；
[0026] 所述生根培养基为：MS培养基+0? 5-1.Omg/LNAA+0. 07-0. 09mg/L芸苔素 +40-60g/L香蕉泥 +1. 5-2. 5mg/L活性炭 +18-22g/L白糖 +7. 5-8.Og/L琼脂，pH值为 5. 2-5. 6 ;低浓度芸苔素能促根壮苗、叶片展开、增加叶绿素含量提高光合效率以及提高植 株抗逆性，试管苗移栽时能较快恢复生长，提高移栽成活率。
[0027] 经生根培养后，小苗生根率可达100%;
[0028] (6)移栽种植阶段
[0029] 将步骤（5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10-20 天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30°C，光照强度为4000-50001uX，湿度为45-60% ; 炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分 化黄壤土以2. 0-2. 5 : 1-1.5 : 1的体积比例混合的混合物；之后置于生态林下或可控温 湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-321：，湿度要求60-90%，光照强度为4000-700011? ;
[0030] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4-5天开始，每10-14天浇施一次质量百 分比浓度为0. 004-0. 006%磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0031] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20-30天开始，浇施质量百分比浓度为 0. 004-0. 006 %氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14-18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝 酸铵溶液，总共浇施2-8次，于采收前50-60天停止施肥；
[0032] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120-200天后采收。
[0033] 在65_70°C下恒温干燥加工后所获得的血叶兰干品有效成分含量如下：
[0034] 总多糖（以葡萄糖计）可达2. 4%，总黄酮（以芦丁计）可达0.7%。
[0035] 在上述培养基中，各物质的浓度均指其在最终配制获得的营养液中所占浓度，香 蕉泥、活性炭、蛋白胨、白糖和琼脂的浓度均指质量百分比浓度。
[0036]NAA是a-萘乙酸；6-BA是6-苄氨基腺嘌呤；MS培养基基本组成如下表所述：
[0037]
【主权项】
1. 一种血叶兰组织培养快速