繁殖方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤： (1) 外植体的准备阶段 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，从中选 取叶片硬挺、无病虫害的茎段的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置 2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用； (2) 消毒阶段 将步骤（1)中所准备的外植体在800-1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡 消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20-25min ;消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植 体表面的水吸干，备用； (3) 诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤： ① 建立外植体无菌培养体系 将步骤（2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修剪后插入诱导培养 基A中； 培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，进行无光照黑暗培养，培养周期 为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0. 3-0. 5mg/LNAA+6. 5-7. 2g/L琼脂 +2. 0-2. 5g/L 活性炭，pH 值为 5. 2-5. 6 ; ② 诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培 养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，光照强度为 1000-20001ux，光照周期为8-10h/d，培养周期为20-30天；所述诱导培养基B为：MS基本 培养基 +〇· 2-0. 3mg/L 6-BA+0. 5-0. 8mg/L NAA+8. 0-8. 5g/L 琼脂 +15-25g/L 白糖，pH 值为 5. 2~5. 6 ； (4) 增殖培养阶段 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增 殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2°C，环境湿度为40-50%，光照强度为 2000-30001ux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天； 所述增殖培养基为：MS 基本培养基 +0· 5-1. Omg/L 6-BA+0. 3-0. 5mg/L NAA+1. 0-2. 5g/ L蛋白胨+6.0-7. Og/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值调整为5.2-5.6 ; (5) 生根培养阶段 将步骤（4)增殖培养获得的带2. Ocm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培 养；培养环境温度为23±21：，环境湿度为45-55%，光照强度为3000-45001^?，光照周期为 10-12h/d，培养周期为30-40天； 所述生根培养基为：MS培养基+0· 5-1. Omg/L ΝΑΑ+0. 07-0. 09mg/L芸苔素 +40-60g/L香 蕉泥 +1. 5-2. 5mg/L 活性炭 +18-22g/L 白糖 +7. 5-8. Og/L 琼脂，pH 值为 5. 2-5. 6 ; (6) 移栽种植阶段 将步骤（5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10-20天，炼 苗的大棚环境条件要求温度为20-30°C，光照强度为4000-50001uX，湿度为45-60% ;炼苗 后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄 壤土以2. 0-2. 5 : 1-1.5 : 1的体积比例混合的混合物，之后置于生态林下或可控温湿度 的设施大棚内，栽培环境温度15-321：，湿度要求60-90%，光照强度为4000-700011?; 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4-5天开始，每10-14天浇施一次质量百分比 浓度为〇. 004-0. 006%磷酸二氢钾溶液，共浇施2次； 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20-30天开始，浇施质量百分比浓度为 0. 004-0. 006 %氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14-18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝 酸铵溶液，总共浇施2-8次，于采收前50-60天停止施肥； 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120-200天后采收。
2. 根据权利要求1所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于： 步骤（2)消毒处理阶段中，进行表面消毒时，用900mg/L二氧化氯溶液浸没外植体。
3. 根据权利要求1或2所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于： 步骤（3)诱导培养阶段在建立外植体无菌培养体系时，对外植体的修剪方法如下：对 于带茎节的茎段，沿茎节呈40-50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段， 75-85°角插入诱导培养基A中； 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈40-50°角斜切去基部的组织，切成 上短下长的带顶芽的茎段，75-85°角插入诱导培养基A中。
4. 根据权利要求3所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于： 步骤（3)诱导培养阶段的两个步骤中： ① 建立外植体无菌培养体系 所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0. 4mg/L NAA+6. 8g/L琼脂+2. 25g/L活性炭，pH 值为5. 4 ; ② 诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长 培养环境的光照强度为15001uX，光照周期为9h/d，培养周期为25天；所述诱导培养 基 B 为：MS 基本培养基 +0· 25mg/L 6-BA+O. 65mg/L NAA+8. 25g/L 琼脂 +20g/L 白糖，pH 值为 5. 4 ； 步骤（4)增殖培养阶段中，培养环境的光照强度为25001ux，培养周期为85天；所述增 殖培养基为：MS基本培养基+0· 75mg/L 6-BA+O. 4mg/L NAA+蛋白胨I. 75g/L+6. 5g/L琼脂 +20g/L白糖，pH值调整为5.4; 步骤（5)生根培养阶段中，光照强度为3750LUX，光照周期为llh/d，培养周期为35天； 所述生根培养基为：MS培养基+0· 75mg/L NAA+0. 08mg/L芸苔素 +50g/L香蕉泥 +1. 25mg/L 活性炭 +20g/L 白糖 +7. 75g/L 琼脂，pH 值为 5. 4 ; 步骤（6)移栽种植阶段中，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗的时间为15天，炼苗的 大棚环境条件要求温度为23±2°C，光照度为45001UX，湿度为45-55% ;所述栽培基质为草 炭土、沼渣和分化黄壤土以2.25 : 1.25 : 1的体积比例混合的混合物，将炼苗后的种苗置 于可控温湿度的设施大棚内栽培种植，栽培环境温度23±2°C，湿度要求45-55%，光照强 度为 5000-60001ux ; 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4天开始，每13天浇施一次质量百分比浓度为 0. 005%磷酸二氢钾溶液，共浇施2次； 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第28天开始，浇施质量百分比浓度为0. 005%氯 化铵溶液或硝酸铵溶液，每16天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施5 次，于采收前55天停止施肥； 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第160天后采收。
【专利摘要】本发明涉及一种繁殖血叶兰的方法，特别涉及一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：(1)外植体的准备阶段，(2)消毒阶段，(3)诱导培养阶段，(4)增殖培养阶段，(5)生根培养阶段，(6)移栽种植阶段。本发明所提供的方法不仅能有效缩短血叶兰培养时间，提高增殖倍数达4.67，提高有效芽数达100％，获得足量试管植株；还能提高血叶兰种苗稳定性，降低培养成本，为其规模化生产应用奠定基础。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104585033
【申请号】CN201410852653
【发明人】陈菁瑛
【申请人】福建省农业科学院农业生物资源研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日