一株深褐芽孢杆菌yl3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株深褐芽抱杆菌YL3及其在防治植 物病害中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着种植业结构的调整和外来有害生物的入侵，近年来农作物重大病害频繁暴 发。目前，生产上防治植物病害主要依靠化学农药，运不仅造成生态环境严重污染，而且直 接增加农产品中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了达到有效防治植物 病害、减少化学农药使用量的目的，使用生物防治技术控制植物病害的方法越来越受到各 国政府和人民的关注。生物防治技术主要是利用生物多样性，通过在自然界释放或引进有 益微生物，可持续控制植物病害。1950年W来国内外均开展了利用生防菌剂防治植物病 害的研究，已取得显著成效。如：利用枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)防治水稻纹枯 病、大豆诱病、大白菜软腐病等；利用巧光假单胞杆菌（Fluorescentpseudomonads)防治 棉花、亚麻、首猜、黄瓜等作物的枯萎病；利用酵母菌（Candidasaitoana)、下香假单胞菌 (Pseudomonassyringae)和成团泛菌（Pantoeaagglomerans)防治植物多种病害等。
[0003] 江苏省农业科学院从内蒙古海拉尔草原采集的±样中，分离纯化后获得一株新 颖的生防菌株化3。前期研究结果表明：生防菌株YL3对草替生产上多种重要病害（如炭 痘病、白粉病等）有很好的防治效果。经中国科学院微生物研究所检测鉴定，根据细胞形 态、生理生化特征、16SrRNA基因序列等实验数据综合分析，菌株YL3鉴定为深褐芽抱杆菌 度acillusatrophaeus)。同时，深褐芽抱杆菌YL3已于2015年9月14日在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中屯、登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11377。
[0004] 已有文献报道的深褐芽抱杆菌主要对小麦赤霉病（辛海峰等，2013年，《化inese Journal0巧cology》）、大丽轮枝菌（孙崇思等，2014年，《植物保护》）具有括抗作用。已 有深褐芽抱杆菌相关申请专利主要是对立枯丝核菌、早疫病菌、马铃馨褐腐病菌、辣椒疫霉 病菌、瓜果腐霉病菌、杨树炭痘病和棉铃疫病等具有显著的室内抑菌效果（专利【申请号】 CN201410461213 ；CN201410397803 ；CN201310306988 ；KR20130021972 ；CN201210028087) 〇 目前，深褐芽抱杆菌度acillusatrophaeus)对草替炭痘病、白粉病和作物枯萎病害的生防 应用国内外未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-深褐芽抱杆菌 度acillusatrophaeus)化3,该菌株已于2015年9月14日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11377。
[0006] 本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由深褐芽抱杆菌YL3组成。
[0007] 本发明所述的生防菌剂，其中深褐芽抱杆菌YL3分泌的代谢产物中包括蛋白酶、 嗜铁素和几下质酶Ξ种抗菌相关物质。
[0008] 本发明所述的生防菌剂，它是水剂。
[0009] 本发明所述的水剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：深褐芽抱杆菌 YL3 :89. 5-99. 8% ;十二烷基横酸钢：0. 1-10% ;山梨酸钟：0. 1-0. 5%;pH6. 5-7. 0。。
[0010] 本发明所述的水剂喷施植物叶面用于防治草替炭痘病和草替白粉病，灌根用于防 治作物枯萎病等多种植物真菌病害。
[0011] 本发明的优点在于：开发出一株对人畜安全、具有较好应用前景的生防菌株-深 褐芽抱杆菌化3,丰富了生防资源；该生防菌剂可W用来防治多种植物病害，减少生产中化 学药剂的使用量，同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中的残留量。
【附图说明】
[0012] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0013] 图1是深褐芽抱杆菌YL3对细菌的抑制作用
[0014] 图2是深褐芽抱杆菌YL3对病原真菌的抑制作用。
[0015] 图3是深褐芽抱杆菌YL3产生蛋白酶。
[0016] 图4是深褐芽抱杆菌YL3产生嗜铁素。
[0017] 图5是深褐芽抱杆菌YL3产生几下质酶。 阳01引图中A:深褐芽抱杆菌YL3巧：巨大芽抱杆菌；C:梨火疫病菌；D:水稻细菌性条斑 病菌；E:番茄枯萎病菌；F:水稻纹枯病菌；G:油菜菌核病菌；Η:草替炭痘病菌；1 :甘蓝黑 斑病菌。
【具体实施方式】：
[0019] 实施例1、
[0020] 深褐芽抱杆菌YL3对细菌的抑制作用
[0021] Α、供试病原细菌
[0022] 供试细菌包括巨大芽抱杆菌、梨火疫病菌和水稻细菌性条斑病菌，由江苏省农业 科学院植物保护研究所提供。用LB培养液（蛋白腺lO.Og，酵母粉5.0g，化C1lOg，蒸馈水 1000血)28°C、150巧m振荡培养2d，用无菌水稀释至108c化/mL，备用。
[0023] B、试验方法：
[0024] 将江苏省农业科学院筛选获得的深褐芽抱杆菌YL3在LB培养基上进行活化，然后 移入50血LB培养液中，于28°C、15化pm振荡培养2d，用无菌水稀释至108c化/血，备用。
[0025] 吸取深褐芽抱杆菌YL3菌液5μL点接在LB平板中央，28°C培养4化后用病原细 菌稀释液喷雾，28°C培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设清水对照。 阳0%] C、试验结果：
[0027] 试验结果见图1。深褐芽抱杆菌YL3菌液对对供试的3种细菌均有一定的抑制作 用，对巨大芽抱杆菌的抑菌圈直径为20. 5mm;对梨火疫病菌的抑菌圈直径为36. 5mm;对水 稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径为60. 5mm。
[0028] 如图1所示。
[0029] 实施例2
[0030] 深褐芽抱杆菌YL3对5种植物病原真菌的抑制作用
[0031] A、供试病原真菌：
[0032] 病原真菌包括番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、草替炭痘病菌和甘蓝 黑斑病菌，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用PDA培养基（200g马铃馨、20g 葡萄糖、20g琼脂和1000血蒸馈水，pH6. 5-7. 0)28°C培养5d，备用。
[0033] B、试验方法：
[0034] 深褐芽抱杆菌YL3菌液制备同实施例1。
[0035] 将病原真菌菌饼（直径为6mm)置于空白PDA平板一侧，距平板边缘30mm。平板另 一侧，距平板边缘30mm，点接深褐芽抱杆菌YL3菌液5μL。28°C恒溫培养，设清水对照，待 对照平板病原菌菌落长满时调查各处理病原菌生长直径，计算抑制率。每处理重复3次，取 平均值。
[0036] 病原真菌抑制率=[(对照病原菌生长直径-处理病原菌生长直径）/对照病原菌 生长直径]X100%。
[0037] C、试验结果：
[0038] 试验结果见表1和图2。结果表明：深褐芽抱杆菌YL3菌液对供试的5种病原真 菌均有抑制作用。其中对番茄枯萎病菌、油菜菌核病菌、草替炭痘病菌和甘蓝黑斑病菌菌丝 生长的抑制率在40%左右，对水稻纹枯病菌的抑制率只有26. 78%。
[0039] 表1深褐芽抱杆菌YL3对供试病原真菌的抑制作用
[0040]
阳OW 如图2所示。 柳42] 实施例3
[0043] 深褐芽抱杆菌YL3代谢分泌物-抗菌相关物质的产生 W44] 供试材料：蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉lOOg，琼脂20g，定容至lOOOmL。嗜铁素检 测培养基：CAS60. 5mg，lOmLS价铁溶液（Immol.L中eCls.6&0)，皿TMA72. 9mg，琼脂 20邑， 定容至1000血，pH7. 0。几下质酶检测培养基：几下质15g，Μ拆〇4· 7&0 0. 5g，FeS〇4· 7&0 0.Olg，K2HPO40. 7g，KH2PO40. 3g，琼脂 20g，定容至 1000血，pH7. 0-7. 2。纤维素酶检测培 养基：蛋白腺lOg，酵母粉lOg，簇甲基纤维素钢lOg，化C1 5g，KH2PO4Ig，琼脂20g，定容至 1000血，pH7. 0〇
[0045] 深褐芽抱杆菌YL3菌液制备同实施例1。在各检测培养基平板中央点接深褐芽抱 杆菌YL3菌液5μ以每处理重复3次。28°C恒溫培养3-7d，观察。
[0046] 蛋白酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该括抗菌可分泌蛋白酶。
[0047] 嗜铁素检测：28°C恒溫培养7-lOd后观察有无黄色晕圈产生。若产生黄色晕圈，说 明该括抗菌可分泌嗜铁素。
[0048] 几下质酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该括抗菌可分泌几下质 酶，降解几下质。
[0049] 纤维素酶检测：观察菌落周围有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该括抗菌可分 泌纤维素酶。
[0050] 试验结果表明：深褐芽抱杆菌YL3不能分泌纤维素酶；能分泌蛋白酶，利用检测平 板中的蛋白质，在菌落周围形成透明圈（图3);能分泌嗜铁素，与检测平板中的Fe3+结合， 在菌落周围形成枯黄色晕圈（图4);能分泌几下质酶，利用检测平板中的几下质，在菌落周 围形成透明圈（图5)。 阳05U 如图3、图4和图5所示。 阳0巧 实施例4
[0053] 深褐芽抱杆菌YL3水剂的获得
[0054] A、菌种准备及活化。
[0055] LB培养基（同实施例1)按常规方法加琼脂后灭菌，做成斜面。接种深褐芽抱杆菌 化3, 28°C培养2d。
[0056] B、液体发酵。
[0057] 一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入300mLLB培养液 (同实施例1)。在28°C、150巧m振荡培养2d，备用。
[0058]二级发酵：培养基配方：豆饼粉1 %，大豆粉0. 5%，酵母膏0. 15%，玉米粉1 %，玉 米浆0.5%，薦糖0.5%，化C1 0.05%，CaC〇3 0.18%。灭菌前抑7.0。2吨发酵罐中投料 1吨。12rC灭菌30分钟。冷却至30°C左右时接种上述一级发酵菌种液300mL。液体发酵 溫度32°C，揽拌转速30化pm。通气量1 : 1.5。发酵周期为18小时。
[0059] Ξ级发酵：培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。12rc灭菌30分钟。 冷却至30°C左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵溫度32°C，揽拌转速30化pm。 通气量1 : 1.5。发酵周期为24小时左右，放罐。
[0060] C、水剂配置。
[0061] 发酵液放入储罐中，加入十二烷基横酸钢0. 1-10%、山梨酸钟0. 1-0.