专利名称：花生四烯酸发酵制配方法
技术领域：
本发明涉及发酵工程领域，更具体涉及一种花生四烯酸发酵制配方法。
自八十年代以来围绕多不饱和脂肪酸(PuFAs)发酵的研究工作取得了长足进展。目前，美国Starge公司、日本出光石油化学公司等已将发酵生产的γ-亚麻酸(GLA)产品投放市场，发酵生产的GLA油脂与月见草油相比，不仅具有GLA含量高、产量稳定、工业化生产不受自然条件限制等优点，而且其油脂成分更接近母乳。除GLA以外，其它PuFAs发酵尚处在实验阶段，是发酵工业及医药、食品工业的研究热点。目前国内还主要停留在GLA微生物发酵工艺研究方面，而国外则将重点转移到花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)的产业化研究上，但到目前为止，国外尚无GLA以外的PuFAs微生物发酵产品投放市场的报道，但这方面的实验研究已有较大的进展，尤其以日本和加拿大走在最前面，美国油脂化学协会亦十分关注PuFAs的生产和应用的研究进展。国际上开展PuFAs的微生物研究主要集中在以下几个方面1、产PuFAs的菌种分离与选育；2、培养条件及发酵工艺的优化；3、培养方式的研究(包括批式、补料、连续培养工艺等)；4、PuFAs的分离纯化及结构鉴定。目前人们仅发现接合菌纲是唯一有前途的一个纲，而且普遍看好被孢霉，认为它是生产花生四烯酸、EPA,DHA的最佳菌种。国内方面，研究GLA并取得一定进展的有中科院上海植物生理研究所、南开大学、福建师范大学生物工程学院以及山东大学生命科学学院，但现在GLA的主要来源仍是从月见草等植物中提取的，利用微生物工业化生产GLA尚未见报道。华南理工大学报道了花生四烯酸的发酵研究。其种子培养基是葡萄糖30g/1000mL、酵母膏2g/1000mL、蛋白胨3g/1000mL、K2HPO40.5g/1000mL、CaCl2.2H2O 0.2g/1000mL、MgSO4.7H2O 0.3g/1000mL、pH6.0。其发酵培养基为葡萄糖80g/1000ml,、酵母膏0.5g/1000mL、KNO340g/1000mL、K2HPO43.0g/1000mL、CaCl2.2H2O 0.1g/1000ml,MgSO4.7H2O 0.5g/1000mL、FeCl2·6H2O 0.015g/1000mL、ZnSO4·7H2O 0.0075g/1000mL、CuSO4·5H2O 0.0005g/1000mL、pH6.0。其种子液制备如下采用5ml无菌水将斜面菌种洗入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃、180rpm下摇瓶培养4天。其摇瓶发酵培养方法如下取2ml种子液于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，25℃，180rpm下摇瓶培养7天。目前国内研究仍处在摇瓶实验阶段，尚未进行花生四烯酸的发酵罐放大培养，且花生四烯酸摇瓶发酵制配的最高得率为0.827g/1000mL。
本发明的目的在于提供了一种花生四烯酸发酵制配方法，工艺简便，制配方便，成本低，解决了花生四烯酸的发酵生产效率和产量低的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，在对培养基配方及花生四烯酸发酵条件进行反复实验的基础上，找到了花生四烯酸大量合成的培养基及发酵条件，其培养基成本低廉，取材容易，操作过程简单易行，其发酵制配方法如下1、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽400-600g，加水800-1200mL煮沸0.5-1.0小时，取出豆芽汁，备用。
(2)种子培养基配方采用豆芽汁800-1200mL，葡萄糖40-60g/1000mL，K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH 6.0-6.5。
(3)种子培养条件培养温度10-20℃，摇床转速为110-150rpm，培养3-5天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种、经斜面活化后、加8-10ml无菌水、洗下孢子、制成孢子悬液。按100ml种子培养基加8-10ml孢子悬液，再按(3)中的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液制备玉米粉180-220g加水800-1200mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶4-6g及糖化酶1-3g,40-60℃，保温10-14小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液800-1200mL，酵母粉12-18g/1000mL，牛肉膏3-6g/1000mL,NaNO31-5g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH 6.0-6.5。
(3)发酵罐发酵培养条件发酵温度10-18℃，搅拌转速150-250rpm，通气量120-180VVM，培养10-20天。或摇瓶发酵培养条件发酵温度为10-18℃，摇床转速为110-150rpm，培养10-20天。
(4)发酵罐培养按每100mL罐体积中装入65-75ml发酵培养基，采用上述制备好的种子液按100ml发酵培养基接入15-25ml种子液，再按发酵温度为10-18℃，搅拌转速为150-250rpm，通气量120-180VVM，进行培养，培养时间10-20天。或摇瓶发酵培养按100ml摇瓶装入20ml发酵培养基，然后按100ml发酵培养基加15-25ml上述制备好的种子液再按发酵温度10-18℃，摇床转速110-150rpm，培养10-20天。
发酵结束后，抽滤，收集菌体40-60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果原料易购，价格低廉，花生四烯酸合成稳定，产量在1.35-1.55g/1000ml，发酵过程简单易行，操作简便，适合工业化生产。
实施例11、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽500g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。
(2)种子培养基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖50g/1000mL，K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)种子培养条件培养温度为18℃摇瓶转速为120rpm，培养3天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用10ml无菌水洗下孢子，按每100ml种子培养基加入10ml孢子悬液接入摇瓶中，并按(3)中的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液的制备玉米粉200g加去离子水1000mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶5g及糖化酶2g，60℃，保温12小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉15g/1000mL，牛肉膏5g/1000mL,NaNO33g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)发酵培养条件发酵温度为15℃，摇瓶转速为120rpm，培养15天。
(4)花生四烯酸发酵培养按2000ml摇瓶装400ml发酵培养基，然后采用将种子扩大培养制配的大量被孢霉种子液按每100ml发酵培养基加入20ml种子液加入到发酵培养基中，再按上述(3)中的发酵培养条件进行花生四烯酸的发酵培养。发酵结束后，抽滤，收集菌体40-60℃烘干至恒重、粉碎，采用石油醚溶剂提取油脂；气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例21、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽400g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。
(2)种子培养基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖60g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)种子培养条件培养温度为20℃，摇瓶转速为120rpm，培养3天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加8ml无菌水、洗下孢子，制成孢子悬液。按每100ml种子培养基加8ml孢子悬液，再按(3)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液的制备玉米粉180g加去离子水1000mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶4g及糖化酶2g,60℃，保温12小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉12g/1000mL，牛肉膏4.5g/1000mL,NaNO33g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)发酵培养条件发酵温度为12℃，摇瓶转速为150rpm，培养15天。
(4)花生四烯酸发酵培养按2000ml摇瓶装400ml发酵培养基，然后将种子扩大培养制配的大量被孢霉种子液按每100ml发酵培养基加入18ml种子液加入到发酵培养基中，再按上述(3)中的发酵培养条件进行花生四烯酸的发酵培养。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至55℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例31、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽600g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。
(2)种子培养基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖40g/1000mL,K2HPO40.5g/1000mL,pH6.2。
(3)种子培养条件培养温度为20℃，摇瓶转速为140rpm，培养4天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加10ml无菌水、洗下孢子，制成孢子悬液。按每100ml种子培养基加10ml孢子悬液，再按(3)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液的制备玉米粉190g加去离子水1000mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶5.5g及糖化酶1.5g,60℃，保温14小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉10g/1000mL，牛肉膏5.5g/1000mL,NaNO32g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.4。
(3)发酵培养条件发酵温度为17℃，摇瓶转速为130rpm，培养14天。
(4)花生四烯酸发酵培养按2000ml摇瓶装400ml发酵培养基，然后将种子扩大培养制配的大量被孢霉种子液按每100ml发酵培养基加入20ml种子液加入到发酵培养基中，再按上述(3)中的发酵培养条件进行花生四烯酸的发酵培养。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至50℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例41、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽450g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。
(2)种子培养基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖45g/1000mL,K2HPO40.8g/1000mL,pH6.5。
(3)种子培养条件培养温度为16℃，摇瓶转速为130rpm，培养3天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加10ml无菌水。洗下孢子，制成孢子悬液。按每100ml种子培养基加8ml孢子悬液。再按(3)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液的制备玉米粉210g加去离子水1100mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶4.5g及糖化酶2.5g,50℃，保温14小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉16g/1000mL，牛肉膏5g/1000mL,NaNO34g/1000mL,K2HPO40.6g/1000mL,pH6.0。
(3)发酵培养条件发酵温度为14℃，搅拌转速为200rpm，通气量为140VVM，培养16天。
(4)15升发酵罐中花生四烯酸发酵培养按15000ml机械搅拌式发酵罐装10500ml发酵培养基，然后采用将种子扩大培养制配的大量被孢霉种子液按每100ml发酵培养基加入25ml种子液加入到发酵培养基中，再按上述(3)中的发酵培养条件进行花生四烯酸的发酵培养。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例51、种子扩大培养(1)豆芽汁的制备新鲜黄豆芽550g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。
(2)种子培养基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖55g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.5。
(3)种子培养条件培养温度为17℃，摇瓶转速为130rpm，培养4天。
(4)种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加10ml无菌水、洗下孢子，制成孢子悬液。按每100ml种子培养基加10ml孢子悬液，再按(3)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子培养物。
2、发酵培养(1)玉米粉糖化液的制备玉米粉200g加去离子水1000mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶6g及糖化酶2g,55℃，保温14小时，过滤，滤液备用。
(2)发酵培养基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉18g/1000mL，牛肉膏3.5g/1000mL,NaNO32g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.4。
(3)发酵培养条件发酵温度为12℃，搅拌转速为250rpm，通气量为150VVM，培养14天。
(4)15升发酵罐中花生四烯酸发酵培养按15000ml机械搅拌式发酵罐装入11250ml发酵培养基，然后将种子扩大培养制配的大量被孢霉种子液按每100ml发酵培养基加入18ml种子液加入到发酵培养基中，再按上述(3)中的发酵培养条件进行花生四烯酸的发酵培养。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至55℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
权利要求
1.一种花生四烯酸发酵制配方法，其制配步骤如下A、种子扩大培养a、豆芽汁的制备，新鲜黄豆芽400-600g，加水800-1200ml煮沸0.5-1.0小时，取出豆芽汁，备用；b、种子培养基配方，豆芽汁800-1200mL，葡萄糖40-60g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH6.0-6.5；c、种子培养条件，培养温度为10-20℃，摇瓶转速为110-150rpm，培养3-5天；d、种子扩大培养按500ml摇瓶装100ml种子培养基，采用普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种，经斜面活化后，用8-10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液，按每100ml种子培养基，加入8-10ml孢子悬液，并按(c)中的种子培养条件进行种子扩大培养；B、发酵培养a、玉米粉糖化液的制备玉米粉180-220g加水800-1200mL，煮沸膨胀，加α-淀粉酶4-6g及糖化酶1-3g,40-60℃，保温10-14小时，过滤，滤液备用；b、发酵培养基玉米粉糖化液800-1200mL，酵母粉12-18g/1000mL，牛肉膏3-6g/1000mL,NaNO31-5g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH6.0-6.5；c、发酵罐发酵培养条件发酵温度为10-18℃，搅拌转速为150-250rpm,通气量120-180VVM，培养10-20天，或摇瓶发酵培养条件发酵温度10-18℃，摇瓶转速110-150rpm，培养10-20天；d、发酵罐培养按每100ml罐体积装入65-75ml发酵培养基，按每100ml发酵培养基接入15-25m1种子液，发酵温度为10-18℃，搅拌转速为150-250rpm，通气量120-180VVM，培养时间10-20天，或摇瓶发酵培养按100ml摇瓶装入20ml发酵培养基，按100ml发酵培养基加入15-25ml种子液，发酵温度为10-18℃，摇瓶转速为110-150rpm，培养10-20天。
全文摘要
本发明公开了一种花生四烯酸发酵制配方法,其步骤是:A、种子扩大培养,首先是豆芽汁的制备;其次是种子培养基配方;第三是种子培养条件;第四是种子扩大培养。B、发酵培养,一是玉米粉糖化液的制备;二是发酵培养基;三是发酵培养条件;四是摇瓶或发酵罐发酵培养,发酵结束后,抽滤,收集菌体,烘干,粉碎,石油醚萃取。本发明工艺简便,成本低,花生四烯酸合成稳定,产量高,适合工业化生产。
文档编号C12P7/40GK1323904SQ0011456
公开日2001年11月28日 申请日期2000年5月12日 优先权日2000年5月12日
发明者余龙江, 周蓬蓬, 朱敏, 李为 申请人:华中科技大学