专利名称：用于控制食品应用中的革兰氏阳性菌的抗菌组合物的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明公开一种通过用组合物处理而抑制或阻止食品上的细菌过生长的方法，所述组合物包含一种或多种啤酒花酸提取物或改性啤酒花酸提取物以及一种或多种来自羊毛硫抗生素、片球菌素、乳链球菌素类细菌素和/或分解酶类的安全和合适的革兰氏阳性制菌剂或杀菌制剂。更具体地说，本方法包括，将一种包含乳链菌肽和/或溶菌酶和β啤酒花酸的组合物用作组分或应用在食品表面以便减少或消除革兰氏阳性腐败菌或病原菌，特别是有害病原体单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的全部菌株。一个涉及公共卫生的重要方面是病原性利斯特氏菌菌种(特别是单核细胞增生利斯特氏菌)在商业冷藏温度(加工的食品通常在该温度下长期储存)下生长的能力。这种在配给品的标准条件下生长的能力使单核细胞增生利斯特氏菌成为与当今的原料食品和加工食品相关的最危害公共卫生的因素之一。任何新型抗微生物体系都必须在商业食品系统中有效，配方和温度条件反映实际应用。本专利的新组合物对各种食品都有效，特别是在利斯特氏菌污染危害的食品典型的冷藏温度和加工温度下。
2.技术描述1994年的CAST报告(食物传染病原体危险和后果。Task ForceReport No.122，农业科学和技术委员会(Council for AgriculturalScience and Technology)，Washington D.C.)定量地记载了美国的食物传染和食物中毒的程度，在过去数年中由于更好的报告体系和程序而广泛地说明了食物传染和食物中毒的程度(CDC.1988c.1997最后的FoodNet监督报告。U.S.Department of Health and HumanServices，1998年10月)。为了减少李斯特菌病和其它食物传染的流行，人们开展了广泛研究以开发起食品级抗菌成分的作用的组合物。该研究中公开了，单种化合物具有很小的(如果有的话)商业益处或用途，主要是由于单一的化合物通常缺乏效果或太贵而不适用于食品加工和制品中。此时，仍需要更好地控制革兰氏阳性病原体，例如，单核细胞增生利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)等，它们严重危害消费者的健康。此外，还已知其它革兰氏阳性腐败菌[例如，乳杆菌(lactobacilli)、链球菌(streptococci)、芽孢杆菌(bacilli)、肠球菌(enterococci)和微球菌(micrococci)菌种]也引起腐败(虽然通常不致病)，所以，常常是降低选定的食物储藏期限和新鲜度的主要作用剂。
病原菌和腐败菌都可能出现在原料食品中，但热加工倾向于急剧减小细菌接种量。加工后，当它们可能暴露于食品加工环境中的病原体时，大多数食品在包装、分配和最后的消费以前具有再次污染的危险。甚至在最洁净的加工设施中，选定的病原体也可能污染已加工的食物(通常以很低的水平)。至于耐寒冷的病原体(主要是各种利斯特氏菌菌种)，它们就可能在分配和储存期间在食物上未受抑制地生长直至最后消费。这样的病原体在食品中生长愈多，所述食品的消费者中感染的危险性就愈高。这对于熟肉制品和乳制品来说尤其严重，因为这样的食物被消费者消费前不再被加热或加工。在这些情况下，最可能的危害来自在冷藏时良好生长的利斯特氏菌菌种。人们认识到，任何病原体的高水平消费增大感染的危害(特别是在幼儿、老年人、孕妇中)，从而增大任何免疫妥协个体的危险性。
在1998年，估计美国有大约500人死于可能因食物引起的李斯特菌病。在大多数食物病原体中，李斯特菌病具有最高的死亡率，根据Meade等的报导超过20％(在美国食物相关的疾病和死亡，CDC 55，Sept-Oct 1999)。鉴于上述危害和大的社会费用，美国公共卫生署、食品与药物管理局(FDA)和美国农业部(USDA)都认识到急需防止利斯特氏菌生长的体系。本发明的主题是一种新型食品级(通常认为是安全的)中性香味组合物，它针对实际食品体系(尤其是加工好的熟肉制品)中的利斯特氏菌。希望这样的组合物的效果是杀死或减少食品中的利斯特氏菌水平，所述食品有受这类菌属的后加工存活或感染的危险。此外，还注意到食品中与其它革兰氏阳性菌[包括上述腐败菌类，以及不常见的棒状菌(Corynebacteria)属、双球菌(Diplococci)属、分枝杆菌(Mycobacteria)属、链球菌属和链霉菌(Streptomyces)属]相关的危害问题，可能从这样的方法或组合物受益。
在1992和1993年，美国专利Nos.5,096,718和5,260,061公开了在某些食物中应用丙酸杆菌(propionic acid bacteria)的代谢物以延长处理的食品的储藏期限。这些代谢物显示增强的抗革兰氏阴性菌的效果，但遗憾的是，不能有效抗革兰氏阳性菌。
美国专利No.5,217,950启示了乳链菌肽组合物作为杀细菌剂的应用。乳链菌肽是一种羊毛硫抗生素，更具体地说，是一种在自然界通过细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的各种菌株生产的具有抗微生物性能的多肽。乳链菌肽确实主要是抗革兰氏阳性菌；然而，常见的革兰氏阳性病原体单核细胞增生利斯特氏菌比大多数其它革兰氏阳性菌属更耐乳链菌肽。人们充分认识到增强乳链菌肽抗单核细胞增生利斯特氏菌的活性的需要，该需要也是由于乳链菌肽本身不能用作商用抗利斯特氏菌剂这一事实的缘故。所以，5,217,950专利启示了，将螯合剂[例如，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或其它乙酸盐或柠檬酸盐]与乳链菌肽组合而产生更宽范围的抗利斯特氏菌属和选定的革兰氏阴性菌的活性。
美国专利Nos.5,573,797；5,593,800和5,573,801公开了抗菌组合物，它们包含链球菌属或片球菌属(Pediococcus)产生的细菌素或者合成的等效抗菌剂与螯合剂的组合。或者通过直接涂布或者通过将组合物结合到与食品表面紧密接触的柔性薄膜肠衣上而将组合物涂到待处理的食品的表面。所述螯合剂结合革兰氏阴性细胞外膜中的自由二价阳离子，改善抗菌剂的渗透性。至于5,573,801专利，公开了将乳链菌肽单独应用到煮熟的肉表面，但是这种单组分的效果如此有限以致它还不能被商用。
美国专利5,458,876启示了，将羊毛硫抗生素(例如乳链菌肽)与溶菌酶组合作为抗菌剂。在此情况下，溶菌酶分解细胞壁并破坏靶细胞的结构规整性，于是，抗菌剂在破坏或杀伤细菌细胞中变得更有效。具体地说，证明这种组合可有效改善乳链菌肽抗单核细胞增生利斯特氏菌的抗菌效果，导致以安全的和应用的合适水平显著减少利斯特氏菌(虽然不是完全消灭)。
EP 0 466 244公开了一种具有改良的抗菌性的组合物，它包含下列每组化合物的至少一组的混合物(I)细胞壁溶解物质或其盐，(II)抗菌化合物以及(III)辅助剂，它选自用于食品或化妆品或个人卫生可接受的有机酸或者这些酸的盐，磷酸盐和缩聚磷酸盐或相应的酸，以及其它螯合剂。优选的是，(I)是溶菌酶，(II)可以是细菌素(例如，乳链菌肽或片球菌素)，而(III)则可以是乙酸、二乙酸钠、乳酸、柠檬酸、丙酸、酒石酸、正磷酸盐、六偏磷酸盐、三聚磷酸盐、其它多磷酸盐或者含取代的或未取代的氨基的螯合剂(例如EDTA)。
EP 0 453 860启示了乳链菌肽与在5.5～6.5的pH范围内有效的磷酸盐缓冲液的组合以消灭表面的革兰氏阴性菌。
WO 97/23136启示了一种细菌消毒方法，它包括，用低浓度碱金属正磷酸盐溶液与渗压震扰和/或溶菌酶溶液和/或乳链菌肽溶液组合的处理。此文献测试了低浓度正磷酸三钠与溶菌酶组合而抗莴苣叶或鸡皮肤上的某些细菌，以及低浓度正磷酸三钠与乳链菌肽组合而抗鸡皮肤上的某些细菌。
公布的澳大利亚专利申请AU-A-18604/88公开了应用含有N-乙酰胞壁质酶(例如溶菌酶)与用于保藏食料的非酶防腐剂的细菌溶解酶产品。此出版物中提及的非酶防腐剂是络合剂，例如，柠檬酸和EDTA，氨基酸，特别是氨基酸(例如，半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸)，以及核苷和核苷酸(例如肌苷5′-肌苷一磷酸)或者磷酸盐(例如，焦磷酸四钠(二磷酸盐)、三聚磷酸钠(三磷酸盐)和多磷酸盐)或者变红剂(例如碱金属硝酸盐)。
美国专利No.5,286,506公开了啤酒花的脂溶性β酸提取物的应用，即，应用它们抗食品中单核细胞增生利斯特氏菌的制菌效果(以食物重量的6～50ppm的含量)。此外，美国专利Nos.5,370,863和5,455,038启示了，某些被化学氢化的啤酒花酸衍生物可能具有抗利斯特氏菌菌种的抗菌活性。然而，这些提取物不是食品级(GRAS)的，所以，不允许用于酿造以外的食品中。
最后，Johnson等在国际食品微生物学杂志(InternationalJournal of Food Microbiology)，33(1996)，195～207中公开了，啤酒花酸和啤酒花酸衍生物在含脂肪的食品(例如，干酪、肉、调味汁和佐料)中具有有限的抗利斯特氏菌菌种的效果，可能是由于β酸迁移入或被包埋于脂肪乳液中，所以，它们不能抑制食品乳液水相中的细菌生长。啤酒花β酸在含脂肪的食品中缺乏活性的问题使它们不能被商用作为天然抗微生物剂而控制利斯特氏菌或其它革兰氏阳性病原体。
至完成本专利申请所需的程度，所有上述引用的文献都特意并入作参考。
根据上述启示，在本领域仍需要一种用杀菌组合物处理食品的方法，所述组合物在处于革兰氏阳性病原体的危险中的常规食品应用中在合理的用量水平下具有活性。更具体地说，需要可被方便地结合入这些食品的现有加工方案的有效处理。最后，需要通过应用安全、合适的和成本低的食品级抗微生物组分(例如乳链菌肽、溶菌酶和啤酒花酸)而更完全和有效的减少或者甚至消除有害的革兰氏阳性病原体。
发明简述现在很意外地发现了，一种这样的组合物，即，它具有第一种组分，该组分包括一种或多种来自下类物质的一种或多种的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素和/或乳链球菌素类细菌素，或者分解酶，以及第二种组分，该组分包括一种或多种天然啤酒花酸或啤酒花树脂或其衍生物，所述组合物通过显著胜过任何单组分的或以前公开的组合物的效果而提供优良的抗菌性能，特别是抗可能有害的利斯特氏菌属细菌。
本发明的一个实施方案包括一种抗菌组合物，它包含作为第一种组分的(a)一种或多种来自下类物质的一种或多种的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素，和/或溶菌酶(一种来自蛋白的天然酶)；以及作为第二种组分的(b)一种或多种啤酒花酸或啤酒花酸衍生物或者啤酒花树脂或啤酒花树脂衍生物。特别优选的是一种包含羊毛硫抗生素细菌素、溶菌酶和β啤酒花酸提取物的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种阻止生长、减少存活数、或者全部消灭食品中的革兰氏阳性菌(特别是单核细胞增生利斯特氏菌)的方法，它包括用有效量的一种组合物处理所述食品表面的步骤，所述组合物包含作为第一种组分的(a)一种或多种来自下类物质的一种或多种的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素，或者分解酶；以及作为第二种组分的(b)一种或多种啤酒花酸或啤酒花酸衍生物或者啤酒花树脂或啤酒花树脂衍生物。
本发明的一个目的是提供一种处理食品的方法，目的是为了保护食品以抗有害细菌，以及为了保持甚至在含脂肪的食品上或食品中的组合物的抗菌活性。
本发明的另一个目的是提供一种新型组合物，它具有比以前观察到的组合物单独的组分大得多的抗菌性能。
本领域技术人员参照对优选实施方案的详细描述将容易明白这些和其它目的。对优选实施方案的详细描述在对优选实施方案的描述中，为清楚起见而利用了一些术语。这样的术语旨在包括叙述的实施方案，以及为了达到相似结果的相似目的而以类似方式操作的技术等同方案。
本发明提供了一种新型抗菌组合物及其在减少、阻止或全部消灭食品表面(甚至含脂肪的食品中)的有害细菌的方法中的应用。
所述新型抗菌组合物包含(a)一种或多种来自下类物质的一种或多种的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素，或者分解酶；以及(b)一种或多种啤酒花酸提取物或啤酒花酸衍生物或者啤酒花树脂或啤酒花树脂衍生物。
本发明组合物的第一种组分是具有抗革兰氏阳性菌的制菌或杀菌活性的一种或多种化合物。这样的化合物优选包括但不限于来自蛋白、贝类或其它天然源的羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素和/或溶菌酶。特别期望多于一种具有抗革兰氏阳性菌的制菌或杀菌活性的化合物的组合(例如，乳链菌肽和溶菌酶)属于本发明第一种组分的更优选范围。
第一类革兰氏阳性制菌化合物包括羊毛硫抗生素。术语“羊毛硫抗生素”是Schnell等杜撰的[1988，自然(Nature)333276～278]，用于描述一组包括乳链菌肽的细菌素，它们包含氨基酸羊毛硫氨酸和其它“非蛋白质”氨基酸。Kellner等综述了这些细菌素的常见性能[1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，17753～59]，其中，他们指出“...多环多肽抗生素具有高含量的不饱和氨基酸(脱氢丙氨酸、脱氢紫矿春(dehydrobutrine))和硫醚氨基酸(内消旋羊毛硫氨酸、(2S，3S，6R)-3-甲基羊毛硫氨酸)。此外，在一些成员中见到了lysinoalanine、3-羟基天冬氨酸和S-(2-氨基乙烯基)-D-胱氨酸。”这组物质的成员包括乳链菌肽、枯草霉素、pep5、表皮素、gallidermin、肉桂霉素、Ro09-0198、耐久霉素和管张转霉素。这些核蛋白体合成的肽抗生素包含19～34个氨基酸并且是通过各种微生物生产的，它们包括葡萄球菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌和链霉菌菌种。除了它们的非蛋白质氨基酸的独特组成之外，还可以基于它们的特异性将它们与其它多肽抗生素区别开来。细菌素(尤其是羊毛硫抗生素)通常的特征在于很窄的作用谱图。所以，只有少数几个种的细菌对实际、安全和合适浓度的特定细菌素敏感。在用于食品中的正常、合法的水平(食品体系中至多12.5ppm的纯乳链菌肽)，这样的细菌素倾向于至多仅仅具有制菌(即，生长抑制)性能。这不同于其它广谱多肽抗生素(例如，多粘菌素B1)，它们甚至在很低应用水平下也有效地抗宽范围的细菌，以及Jaynes等在公开的国际专利申请WO 89/00194中讨论的“裂解肽”，它们具有抗大多数细菌、酵母和甚至哺乳动物细胞的活性。
乳链菌肽是一种核蛋白体编码的肽，它有时以二聚体(具有约7000的分子量)出现。在它的总计34个氨基酸中包含数种不常见的氨基酸，包括β-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸和羊毛硫氨酸。在肽中有5个不寻常的硫醚键，这些键有助于它在酸溶液中的稳定性。乳链菌肽是被最充分表征的细菌素之一，它享有与其它羊毛硫抗生素(例如枯草菌素和表皮素)显著的结构和作用的同源性[Buchman等，1988，生物化学杂志(J.Bio.Chem.)，263(31)16260～16266]。最近关于乳链菌肽、它的物理性能和应用的综述包括“乳酸杆菌的细菌素”，T.R.Klaenhammer，1988，生物化学(Biochimie)70337～349，“乳链菌肽”，A.Hurst，1981，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)，2785～121，以及美国专利No.4,740,593。乳链菌肽是一个描述几种密切相关的物质的集合名称，这些物质表现相似的氨基酸组成，以及一些有限的抗生活性范围。E.Lipinska在“农业中的抗生素和抗生作用(Antibiotics and Antibiosis in Agriculture)”(M.Woodbine编辑)，1988，pp.103～130中讨论了这个现象。
M.Doyle；“环境和加工条件对单核细胞增生利斯特氏菌的影响”，食品技术(Food Technology)，1988，42(4)169～171报导了乳链菌肽抗单核细胞增生利斯特氏菌的应用。该文献描述了生物生长的初始抑制(约12小时)，并且报导了，单核细胞增生利斯特氏菌可在低到5.0的pH水平生长而且抗碱性pH(能在pH9.6生长)。
乳链菌肽可从Rhodia Inc.以标准化2.5wt％的制剂商购(商标为NovasinTM)。还以下列形式提供含蛋白质的羊毛硫抗生素，即，在赛达干酪或美国干酪的某些品种中以及在发酵的脱脂乳制品(被称为MICROGARDMG300)中作为低水平发酵副产品。在实践中，基于食品中的安全和合适的应用，以约1～约100ppm(用于处理的溶液重量)活性组分(乳链菌肽)的量、优选以1～12.5ppm的含量往食品中添加羊毛硫抗生素。
作为优选的组合中应用的羊毛硫抗生素的替代物，还已知应用片球菌属细菌的代谢物(特别是片球菌素)作为代用品可产生有效的结果。虽然片球菌素尚未获准用于食品中，但将来它们可能被接受商用。此外，新一类被称为乳链球菌素的链球菌细菌素(特别是爱尔兰专利申请No.980500中描述的乳链球菌素3147)应当产生相似的抗革兰氏阳性菌的活性。与羊毛硫抗生素一样，已知片球菌素和乳链球菌素都具有主要抗有限范围的革兰氏阳性菌的制菌活性。
第二类革兰氏阳性杀菌蛋白质包括分解酶(特别是溶菌酶)，最常来自食品分级提取操作中的卵白蛋白，但也可得自北极扇贝、人乳、眼泪和其它天然源。当溶菌酶被用作抗微生物剂时，将它以约20～约500ppm(用于处理的溶液重量)、更优选约50～约200ppm的量加到食品中，主要抑制成熟干酪中的酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)。在这些含量下，溶菌酶不是抗其它革兰氏阳性菌的杀菌剂，在更高含量(大于1000ppm，通常2000ppm或更高)下应用它从宽范围的革兰氏阳性菌除去细胞壁。
溶菌酶(胞壁质酶；葡糖胺肽N-乙酰mucamoyl水解酶；1，4-β-N-乙酰己糖酰胺酶，E.C.3.2.1.17)都是从各种源分离的粘液溶解酶并且都是被良好地表征的酶。最先在1922年被W.Fleming发现的蛋白溶菌酶是最早被测序的蛋白质之一，最早应用X射线晶体学给出了它的三维结构，而且最早提出了关于它的详细作用机制。文献中良好地记载了它抗革兰氏阳性菌的抗微生物活性，例如，V.N.Procter等在CRCCrit.Reviews in Food Science and Nutrition，1988，26(4)359～395中记载的。蛋白溶菌酶的分子量约为14,300～14,600，等电点是pH10.5～10.7。它由129个通过四个二硫键相互连接的氨基酸构成。从其它源(包括例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)噬菌体T4和人眼泪这样的不同生产者)分离和表征了类似的酶。尽管存在微小的差异(例如，人溶菌酶具有130个氨基酸)，水解乙酰己糖胺聚合物的能力仍然是基本相同的。因此，对本发明来说，术语溶菌酶旨在包括具有水解乙酰己糖胺和相关聚合物的能力的那些细胞壁或肽聚糖降解酶。
已知溶菌酶杀死或抑制细菌和真菌的生长，在欧洲应用它控制各种干酪中腐败生物酪丁酸梭菌的生长。还有人提议将它用于各种其它食品防腐应用中，并且报导了用它抑制(在一些情况下杀死)单核细胞增生利斯特氏菌的生长[Hughey等，1987，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol)，532165～2170]。来自卵白蛋白、具有约20,000 Shugar单位/mg活性的溶菌酶可从Rhodia商购(商标为NovaGARDTM)。
总之，所述新型组合物的第一种组分优选是以前公开的羊毛硫抗生素和分解酶的组合，尤其更优选是乳链菌肽和蛋白溶菌酶的组合。
所述新型组合物的第二种组分是一种或多种啤酒花酸提取物或啤酒花酸衍生物或者啤酒花树脂或啤酒花树脂衍生物或者这些物质的一些或全部的组合。现已发现了，用于啤酒制造中的啤酒花的苦成分(特别是β酸)适用作食品中的杀菌剂，尤其与上述制菌组分和/或杀菌组分组合时。含于啤酒花中的苦味酸的最普遍组是α酸和β酸(分别称为葎草酮和蛇麻酮)。这二者都使啤酒呈苦味，但α酸比β酸苦得多，所以，不希望将它用于大多数食品中。啤酒花提取物的生产者在商业上通过各种色谱法分离α酸和β酸，最近开发了一种分离这两种酸级分的方法，即，应用液态二氧化碳在超临界条件下分离。该操作的一种副产品是一种这样的产品它包含约61wt％β酸，余下的基本上是啤酒花树脂。可用麦芽糖糊精或其它食品级载体将该副产品标准化，喷雾干燥，用作抗菌食品组分。一种优选的β啤酒花酸组合物可作为天然风味提取物(含1wt％β啤酒花酸)商购。
含于啤酒花中的α酸通常被称为葎草酮、辅葎草酮和加葎草酮，而含于啤酒花中的β酸则通常被称为蛇麻酮、辅蛇麻酮和加蛇麻酮。尤其希望已证实有抗菌性能的啤酒花酸或啤酒花树脂的化学改性衍生物(例如，六氢辅蛇麻酮和四氢异葎草酮，如美国专利No.5,455,038中公开的)用于本发明。还认为特别希望用于本发明的是啤酒花酸或啤酒花树脂的酸盐形式的应用。
在实际操作中，加到食品中的啤酒花酸或树脂或其衍生物的量是约0.1～约50ppm活性组分(用于处理的溶液重量)，更优选约0.40～约20ppm。
本发明组合物中可存在的其它添加剂包括但不限于下列物质其它抗菌剂(例如，脱乙酰壳多糖或其衍生物)，和/或螯合剂，天然的或合成的调味料，精油，和/或香料，染料和/或着色剂，维生素，矿物质，营养素，酶，粘合剂(例如，瓜耳胶和黄原酸胶)等。在特别优选的实施方案中，本发明组合物中存在瓜耳胶以帮助将抗微生物组分粘合到被处理的食品表面。不认为这些物质的添加对本发明的成功是至关重要的并且应当认为属于技术人员的能力范围。
可将本发明的抗微生物组合物和对微生物降解敏感的任何食品结合应用。这些食品包括但不限于水果和蔬菜(包括得自它们的产品)，谷物和得自谷物的产品，乳制品，肉类，家禽，以及海产品。在特别优选的实施方案中，将所述组合物和肉类、家禽和/或海产品结合应用，更特别与含脂肪的熟肉(例如，热狗、香肠、烤牛排、火鸡、咸牛肉和熟肉)结合应用。
为了减少食品表面细菌的量，在蒸煮前或蒸煮后将所述新型组合物简单地涂布在食品表面。在实际操作中，组合物物质在食品表面的应用可以是直接应用或间接应用。用术语“食品表面”来定义包括受处理的食品的任意和全部内表面或外表面。
本发明的组合物最容易通过将它涂到混合食品(例如，热狗或波洛尼亚香肠)或者固体食品(例如，烤牛排片)的外表面，以便将食品脂肪相中的活性损失减到最小。所述组合物也可被包含于蒸煮前或蒸煮后食品的乳液或原配料(例如，沙司或salsas)中，或者包含于固体产品(例如，火腿)的内部，通过注射或鼓转。在其它实施方案中，所述组合物可呈醋渍汁、滚面包屑、调味涂油(seasoning rub)、糖衣、着色混合物等涂布，关键准则是所述抗微生物组合物可到达受细菌降解的表面。在一个优选的实施方案中，所述组合物可间接与食品表面接触，即，通过将组合物涂到食品包装材料或薄膜包衣上，随后用包装材料包覆食品表面。表面处理策略的应用(不管是直接的还是间接的)得益于含脂肪食品脂肪相中的损失最小化。应用的制菌或杀菌最佳有效量将依赖于受处理的具体食品的组成和将组合物应用到食品表面的方法，不过，可通过简单的试验确定。
在本发明一个优选的实施方案中，抗菌组合物包含约38.5～99.8重量份的第一种组分，它包括至少一种选自下组的制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素、乳链球菌素类细菌素，以及分解酶；约61.5～0.2重量份的第二种组分，它包括至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
在本发明一个更特别优选的组合物实施方案中，其中，第一种组分包括两种化合物，优选的是，所述组合物包含作为第一种组分的约1.0～2.5重量份羊毛硫抗生素，还有约37.5～97.3重量份分解酶；以及作为第二种组分的约61.5～0.2重量份至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
如下非限制性的实施例阐述了宽范围的抗微生物组合物(它们构成本发明)。
实施例1如表1中所示，在30℃的胰胨豆胨培养液(pH6.0)中测试两种革兰氏阳性菌株48小时以证明NovasinTM乳链菌肽制剂、溶菌酶和β啤酒花酸(单独用或组合用)的抑制效果。试验阐明了NovasinTM、溶菌酶和β啤酒花酸(BHA)的意外的协同效果。表1示出了，在相同的浓度下，NovasinTM、溶菌酶和BHA的组合比每种单独的组分或两种组分的组合都具有显著更好的抑制作用。三种组分的组合表明两种菌株的5log减少，而任何单组分处理或双组分处理都只有1～3log减少。
表1CFU/ml处理L.alimentarius单核细胞增生利斯特氏菌对比物3.1×10e8 1.4×10e8Novasin(NS)50ppm 5.3×10e6 7.1×10e7溶菌酶(LY)50ppm 6.3×10e6 2.5×10e7β啤酒花酸(BHA)*5ppm 1.2×10e8 6.2×10e6NS 50ppm+LY 50ppm 2.5×10e5 4.1×10e5LY 50ppm+BHA 5ppm 5.6×10e6 6.3×10e6NS 50ppm+BHA 5ppm 3.5×10e5 5.2×10e5NS 50ppm，LY 50ppm，BHA 5ppm 2.8×10e3 3.1×10e3*在该说明中，BHA表示β啤酒花酸。
实施例2为了阐明本发明组合物的体内效果，用单核细胞增生利斯特氏菌接种热狗。将热狗浸入含有或者(1)NovasinTM、溶菌酶和BHA；或者(2)NovasinTM和BHA的悬浮液中，再用单核细胞增生利斯特氏菌接种表面。然后，用无菌袋包装热狗并在10℃下保存13天。在每个取样日，用无菌盐水漂洗热狗，将树脂铺于利斯特氏菌选择琼脂上而获得利斯特氏菌数。这样进行对热狗的富集将1ml漂洗液转移到BHI培养液并保温24hr，接着，铺于利斯特氏菌选择琼脂上。富集后在利斯特氏菌选择琼脂上具有0数量的处理被认为是阴性的并作为总处理样品的一部分报导。
表2示出了，虽然NovasinTM和BHA浸渍显著减小了热狗上单核细胞增生利斯特氏菌的初始水平，而三种组分组合则将单核细胞增生利斯特氏菌的水平减小到实际测不出的水平(通过直接铺平板，或者通过富集再生技术)。在这个三种组分组合中，没有观察到存活的单核细胞增生利斯特氏菌的生存，这通过敏感的富集技术(它被用于再生低水平的损伤细胞)后的阴性结果(3/3)证实了。这一发现(即，用新型三组分组合处理的全部样品即使在富集后也对单核细胞增生利斯特氏菌是阴性的)是本申请最意外的发现。以前以本文描述的安全而合适的用量水平应用这些抗微生物组分的任一种从未报导过这样的发现。
表2CFU/热狗处理 第0天 第2天 第13天 富集后呈阴性的对比物 5×10e41.1×10e59.2×10e6 NANovasinTM+BHA 5×10e430 25 1/3NovasinTM+BHA+溶菌酶 5×10e4＜10 ＜10 3/3实施例3如表3中所示，在30℃的胰胨豆胨培养液(pH6.0)中测试芽孢杆菌属的两种革兰氏阳性产孢菌48小时以证明Novasin、溶菌酶和β啤酒花酸(单独用或组合用)的抑制效果。试验阐明了Novasin、溶菌酶和β啤酒花酸组合抗产孢菌的意外的协同效果。表3示出了，在相同的浓度下，Novasin、溶菌酶和BHA的组合比每种单独的组分或三种组分中任何两种组分的组合都表现出显著更好的抑制作用。三种组分的组合全部杀死接种的所有孢子，而关于任何单组分处理或双组分处理都观察到显著的但不是全部消灭。所以，本文确实证实了，Novasin、溶菌酶和BHA的组合显示抗产孢菌的协同杀菌活性。
表3处理CFU/ml枯草芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌对比物 2.5×10e8 1.1×10e850ppm Novasin 3.2×10e4 6.4×10e61ppm BHA 360 5×10e3100ppm 溶菌酶 1.2×10e8 1.1×10e850ppm Novasin+1ppm BHA 40 95050ppm Novasin，1ppm BHA和50ppm 溶菌酶 ＜10＜10实施例4表4中阐明了本发明组合物对煮熟的火腿的效果。用单核细胞增生利斯特氏菌接种煮熟的火腿表面，然后，通过用NovasinTM、溶菌酶和BHA(处理A)；或者溶菌酶和BHA(处理B)的溶液喷洒表面而进行局部处理。接着，用无菌袋将火腿收缩包装和真空包装，在40F(4℃)下储存60天。在每个取样日，用无菌缓冲液漂洗火腿，将树脂铺于利斯特氏菌选择琼脂上而测定存活的利斯特氏菌数。对利斯特氏菌数低于可检测的平板数水平的样品进行富集法处理将1ml漂洗液转移到脑心浸液(BHI)培养液并保温24hr，接着，铺于利斯特氏菌选择琼脂上。富集后在利斯特氏菌选择琼脂上具有阴性(小于1/ml)数的处理被认为是阴性的并作为总处理样品的一部分报导。
表4示出了，三种组分组合则将接种的单核细胞增生利斯特氏菌减少到测不出的水平(通过直接铺平板，或者通过富集再生技术)，而对比组增大了10,000倍(4logs)。二向“溶菌酶加BHA”组合显示了抑制但不作为杀菌剂。在这个三种组分组合中，没有观察到存活的单核细胞增生利斯特氏菌的生存，这由富集(一种用于再生很低水平的存活细胞或损伤的细胞的技术)后的阴性结果证实了。因此，数据表明了，局部应用优选的三组分组合可以全部消灭高脂肪加工的食品(例如，煮熟的火腿)中的单核细胞增生利斯特氏菌。
表4利斯特氏菌数CFU/火腿包装天 对比物处理A 处理B1 250 0507 280 020015290 01603061000200456600046006020000 05500实施例5表5中阐明了本发明组合物在保护维也纳香肠以抗单核细胞增生利斯特氏菌的效果。通过在蒸煮过程中将组合物掺入盛热狗乳液的纤维素薄膜包衣而将Novasin和BHA的组合物递送到维也纳香肠表面。蒸煮后，剥去包衣，然后，用单核细胞增生利斯特氏菌接种成品维也纳香肠表面并用无菌袋真空包装。将包装的、接种的维也纳香肠在40°F(4℃)储存60天，为每个取样点开启新鲜的包装。在每次取样时，用无菌缓冲液漂洗维也纳香肠和它们的包装，然后，将缓冲液铺于利斯特氏菌选择琼脂上而测定存活的利斯特氏菌数。
表5示出了，两组分组合抑制单核细胞增生利斯特氏菌的生长达61天以上，导致保温结束时大于4log(10,000倍)利斯特氏菌减少(与对比物相比)。数据表明，包衣送递的应用优选的两组分组合物防止单核细胞增生利斯特氏菌在维也纳香肠上的过生长，所以，可成为送递组合物的商业上可行的方法，从而改善维也纳香肠和香肠的安全性。更重要的是，上述表面应用方法使组分的活性充分实现(即使在典型的热狗乳液的高脂肪环境中)。反之，当将组合物用作蒸煮前热狗乳液中的组分时，抗微生物活性急剧减小了(未示出数据)，这与以前阐明在含大量脂肪的食品中乳链菌肽活性的损失[Muriana，P.M.和Kanach，L，“乳链菌素在抑制酪乳牧场包衣中的腐败菌方面的应用”，食品保护杂志(J.Food Protection)，Vol.58，No 10，1995]和啤酒花酸活性的损失(Johnson等，1996)的作者的观察结果相符。所以，公开的表面涂布方法揭示了一种使本发明的组合物在含高脂肪含量(大于4％w/w)的食品中的效率最大化的意外方法。
表5利斯特氏菌数logCFU/包装天用对比包衣包装的维也纳香肠用处理包衣包装的维也纳香肠02.72 2.7272.51 1.827 3.66 1.9233 4.31.8440 4.34 2.2354 5.48 3.4361 6.83 2.08已参照其优选的实施方案详细描述了本发明，应懂得，可进行修饰和更改而不偏离附后权利要求书的范围。
权利要求
1.一种抗菌组合物，它包含(a)第一种组分，它包括至少一种选自下组的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素，和/或分解酶；以及(b)第二种组分，它包括至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物。
2.一种抗菌组合物，它包含(a)第一种组分，它包括至少一种选自羊毛硫抗生素和分解酶的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物；以及(b)第二种组分，它包括至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物。
3.一种抗菌组合物，它包含a)乳链菌肽；b)溶菌酶；以及c)β啤酒花酸或β啤酒花酸衍生物。
4.权利要求1的抗菌组合物，其中，所述第一种组分占约38.5～99.8重量份，而第二种组分占约61.5～0.2重量份；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
5.权利要求1的抗菌组合物，其中，所述第一种组分包含约1.0～2.5重量份羊毛硫抗生素和约37.5～97.3重量份分解酶；而第二种组分则包含约61.5～0.2重量份至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
6.一种减少食品中的革兰氏阳性菌的方法，它包括用制菌或杀菌有效量的组合物处理所述食品的食品表面这一步骤，所述组合物包含(a)第一种组分，它包括至少一种选自下组的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物羊毛硫抗生素、片球菌素、乳链球菌素类细菌素和分解酶；以及(b)第二种组分，它包括至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物。
7.一种减少食品中的革兰氏阳性菌的方法，它包括用制菌或杀菌有效量的组合物处理所述食品的食品表面这一步骤，所述组合物包含(a)第一种组分，它包括至少一种选自羊毛硫抗生素和分解酶的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物；以及(b)第二种组分，它包括至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物。
8.权利要求7的方法，其中，所述组合物包含a)乳链菌肽；b)溶菌酶；以及c)β啤酒花酸或β啤酒花酸衍生物。
9.权利要求6的方法，其中，所述第一种组分占约38.5～99.8重量份，而第二种组分占约61.5～0.2重量份；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
10.权利要求6的方法，其中，所述第一种组分包含约1.0～2.5重量份羊毛硫抗生素和约37.5～97.3重量份分解酶；而第二种组分则包含约61.5～0.2重量份至少一种选自下组的化合物啤酒花酸、啤酒花酸衍生物；全部重量份都基于所述组合物的第一种组分和第二种组分的总重量。
11.权利要求6的方法，其中，所述食品是含大于4％脂肪含量的固体食品。
12.权利要求6的方法，其中，所述食品是加工的肉。
13.权利要求6的方法，其中，所述处理步骤包括a)将组合物涂布在包衣、膜或包装材料的表面，以及b)随后，使组合物涂布的表面与所述食品紧密接触。
14.权利要求6的方法，其中，所述革兰氏阳性菌属于利斯特氏菌属。
15.权利要求14的方法，其中，所述利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌或无害利斯特氏菌(Listeria inocua)。
16.权利要求6的方法，其中，所述革兰氏阳性菌是产孢菌。
17.权利要求16的方法，其中，所述产孢菌是芽孢杆菌属菌种。
18.权利要求16的方法，其中，所述产孢菌是梭菌属菌种。
全文摘要
一种抗菌组合物,它包含:(a)第一种组分,它包括至少一种选自下组的革兰氏阳性制菌或杀菌化合物:羊毛硫抗生素、片球菌素和乳链球菌素类细菌素,和分解酶;以及(b)第二种组分,它包括至少一种选自下组的化合物:啤酒花酸、或啤酒花酸衍生物、啤酒花树脂和啤酒花树脂衍生物;以及将所述组合物应用到固体食品表面的方法。
文档编号A23L3/3472GK1370055SQ00811889
公开日2002年9月18日 申请日期2000年7月14日 优先权日1999年7月14日
发明者W·金, 明新天 申请人:罗狄亚公司