专利名称：人源抑肽酶基因、该基因编码的蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人源抑肽酶基因、该基因编码的蛋白质及其应用。
抑肽酶的制备目前国内外普遍采用生物脏器提取法，价格昂贵，使它的应用受到一定的限制。尽管如此，国内心胸外科、胰腺手术中仍广泛使用抑肽酶，仅阜外医院每年的进口抑肽酶用量价值约400万人民币。
抑肽酶是一个58肽的小分子物质，从理论上可以用基因工程方法制备，国外也有文献和专利报道[4]用基因重组制备抑肽酶。1995年Green报道[5]重组的牛抑肽酶用于临床，可减少手术出血和对输血的需求。
但由于动物蛋白进入人体将产生免疫原性，二次使用时，过敏反应发生的机率大大增加。当前已有多篇文献报道[6，7，8]病人使用牛抑肽酶后产生过敏现象，轻者休克，重者甚至死亡。且近年来疯牛病蔓延全世界，引起极大的恐慌，故牛已不宜作为提取抑肽酶的供体动物。另外，我们查阅分析了大量GenBank登录序列，发现抑肽酶有多种基因型，分别可衍绎出不同结构的蛋白质，已有文献报道[9]人为造成抑肽酶氨基酸的定点突变影响其蛋白的活性，据此推测每种基因型抑肽酶的生物活性各有不同。而以往采用的传统提取法不但成本高，产量少，更无法保证所产蛋白质基因型的单一性，从而必然会影响产物的纯度和其生物活性。基因工程生产药物能克服传统方法的缺点，然而人抑肽酶基因未见报道，其序列在GenBank中未见登录。
本发明的另一个目的是提供一种本发明的基因编码的蛋白质。
本发明的在一个目的是提供一种本发明的蛋白质的应用。
我们从人cDNA文库获得两个DNA片段，其同源性与牛抑肽酶(Bovine pancreatic trypsin inhibitor，aprotinin)基因高度同源，属人源抑肽酶基因。这三个DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO1，3和5所示，它们所编码氨基酸序列如SEQ ID NO2，4和6所示。其中，(1)SEQ ID NO1与已知牛的抑肽酶基因98％同源，共有3个碱基变化，带来2处氨基酸变化。(2)SEQ ID NO3与已知牛的抑肽酶基因97％同源，共有5个碱基变化，带来3处氨基酸变化。(3)SEQ ID NO5与已知牛的抑肽酶基因93％同源，共有12个碱基变化，带来8处氨基酸变化。
本发明还涉及本发明的SEQ ID NO2，4或6的抑肽酶在制备用于止血、抑制炎性反应的药物中的应用。
本发明将上述DNA片段与pET系列表达载体进行基因重组，重组子转化入大肠杆菌，经IPTG诱导获得重组人抑肽酶蛋白。菌体裂解液经处理后采用CM-Sephadex柱层析提纯，获得人抑肽酶粗制品。采用滴定法进行效价测定，该蛋白粗制品能够抑制胰蛋白酶活性，具有抑肽酶活力。
PCR循环条件如下94℃ 5分钟55℃ 2分钟 1个循环72 ℃ 2分钟94 ℃ 30秒55℃ 30秒 35个循环72℃ 45秒72℃ 7分钟4℃保温10μl PCR产物经1.0％Agarose电泳分离、鉴定，在约200bp位置存在单一条带，初步认为PCR获得成功。大量PCR扩增，取200μl PCR产物，1.0％Agarose电泳分离，切下约200bp位置单一条带后，玻璃奶方法回收。将回收片段与扩增载体pBluescript SK(+)按3∶1的比例，16℃连接16小时，转化入DH5a菌中扩增，氨苄青霉素和X-gal蓝百斑筛选，AccI酶切和以上述扩增引物1、2为引物PCR鉴定阳性克隆。选择酶切和PCR两种鉴定均呈阳性的克隆进行DNA序列测定(在六合通及基康公司测定)。测定结果显示存在上述3种新的人源抑肽酶基因。2.人源抑肽酶基因重组蛋白质我们选择上述DNA片段3、5，分别以pET28c和pET32b(+)为载体，片段3、5与载体均在NcoI、BamHI位点酶切处理后，16℃连接16小时进行基因重组，经酶切和PCR双重鉴定，获得天然型(2-pET28c、3-pET28c)和融合型(2-pET32b+)表达质粒。将其均转化入BL21(2-pET28c、3-pET28c和2-pET32b+)，用IPTG诱导获得重组表达的抑肽酶蛋白。收集150ml BL21(2-pET28c)菌液，3500rpm离心5min，菌体经超声裂解处理后，25ml菌体裂解液经CM-Sephadex柱层析纯化，以含4M尿素的0.01～0.5M NaCl梯度洗脱，获得人抑肽酶粗制品。透析后冰干浓缩，干粉溶于200μl双蒸水中。采用FIP滴定法对该粗制品的酶活性进行初步测定，胰蛋白酶对照液(1.2mg/ml)与底物BAEE(Na-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐)(16mg/ml)反应后，每分钟消耗0.01N NaOH 1.0ml；而加入100μl人抑肽酶粗制品后，等量的胰蛋白酶与底物BAEE反应，每分钟消耗0.01N NaOH 0.9ml。说明该蛋白质粗制品能够抑制胰蛋白酶活性，具有抑肽酶活力。
参考文献[1]Fritz and Wunderer，Biochemistry and applications ofaprotinin，the kallikrein inhibitor from bovine organs.Arzneimittelforschung.1983；33(4)479-94.[2]Peter DC，1999[3]徐浩大等，1992[4]Cara Berman Marks，Mark Vasser et al.Production ofNative，Correctly Folded Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor byEscherichia coli，J Biol Chem，1986，261，7115-7118，.[5]David Green，John Sanders，Mary Eiken，MSN et al.Recombinantaprotinin in coronary artery bypass graft operations，J ThoracCardiovasc Surg 1995；110963-970.[6]钟宏，傅乾昌，罗玉忠。心脏手术中抑肽酶致过敏性休克3例，河南外科学杂志，2000，6(4)463。[7]抑肽酶致体外循环中重度过敏反应1例，中华胸心血管外科杂志，2000，16(4)253。[8]Dietrich W，Spath P，et al.Anaphylactic reactions to aprotininreexposure in cardiac surgeryrelation to antiaprotininimmunoglobulin G and E antibodies.Anesthesiology.2001Jul；95(1)64-71；discussion 5A-6A.[9]Kurt D.Berndt，Jurgen Beunink，Werner Schroder et al.DesignedPeplacement of an Internal Hydration Water Molecule inBPTIStructural and Functional Implication of a Glycine-to-SeringMutation，Biochemistry 1993，324564-4570.
序列表<110>中国医学科学院阜外心血管病医院<120>人源抑肽酶基因、该基因编码的蛋白质及其应用<130>I2001263<160>8<170>PATENTIN VERSION3.1<210>1<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>1CGG CCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCA TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AAA ATG ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG GCT GGG CTC TGC CAG ACC 96LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY LEU CYS GLN THR20 25 30TTT GTA TAT GGC GGC TGC AGA GCT AAA AGA AAC AAT TTC AAG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS ARG ALA LYS ARG ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>2<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>2ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY LEU CYS GLN THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS ARG ALA LYS ARG ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>3<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>3CGG CCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCA TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AGA ATT ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG TCT GGG CTC TGC CAG ACC 96ARG ILE ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS SER GLY LEU CYS GLN THR20 25 30TTT GTA TAT GGC GGC TGC AAA GCT AAG AGC AAC AAT TTC AAG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>4<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>4ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15ARG ILE ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS SER GLY LEU CYS GLN THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>5<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>5CGG TCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCT TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG SER ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AAA ATG ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG GCT GGG TTC TGC AAG ACC 96LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY PHE CYS LYS THR20 25 30TTT GTA TAT GGT GGC TGC AAA GCT AAG AGC AAC AAT TTC AGG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE ARG SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>6<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>6ARG SER ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY PHE CYS LYS THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE ARG SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>7<211>30<212>DNA<213>ARTIFICIAL SEQUENCE<220><223>PRIMER<400>7CCCATGGCAC GGCCTGACTT CTGCCTAGAG 30<210>8<211>30<212>DNA<213>ARTIFICIAL SEQUENCE<220><223>PRIMER<400>8ACGCGTCTAC GCACCACCAC AGGTCCTCAT 30
权利要求
1.一种人源抑肽酶，它具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或者SEQID NO6所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的人源抑肽酶的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或者SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的人源抑肽酶在制备用于止血、抑制炎性反应的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种人源抑肽酶，它具有SEQ IDNO2，SEQ ID NO4或者SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种编码权利要求1所述的人源抑肽酶的基因。本发明的人源抑肽酶可用于制备用于止血、抑制炎性反应等的药物。
文档编号C12N15/52GK1410536SQ0113609
公开日2003年4月16日 申请日期2001年10月8日 优先权日2001年10月8日
发明者陈曦, 梁艳民, 丛祥凤 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院