专利名称：鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法。
背景技术：
胰蛋白酶(Trypsin)是存在于动物胰脏中的一种蛋白质水解酶，肽链内切酶。以往胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，糜蛋白酶)是从哺乳动物，如猪、牛等胰脏提取的，现在胰蛋白酶的生产主要是以猪胰脏为原料，主要工艺步骤是酸溶液萃取、分级盐析分离、透析层析纯化，存在的问题主要是原料单一，生产时间长，制造成本高。
发明内容
本发明目的是提供一种鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，推进胰蛋白酶的提取从哺乳动物、鱼类向鸟科动物的发展。本发明是以鸡屠宰后大量下脚料鸡肠消化道为原料，提供了一种获得胰蛋白酶的新资源。本发明在萃取.盐析及激活过程中缩短时间，本发明不仅生产周期短，制造成本低，而且酶得率高。
本发明是，其特征在于按以下步骤进行将鸡肠洗净.破碎并制成浆状→用酸溶液萃取→盐溶→等电点盐析→酶原激活→反抽提得到酶粗品→脱盐纯化→结晶干燥得到酶精品。上述鸡肠的破碎制成浆状过程中，温度要控制在10-15℃。上述的用酸溶液萃取过程中，选择远离胰蛋白酶PI值的PH值为2.5-6.0的酸提取液，酸提取剂可以用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸—氢氧化钠—盐酸缓冲液或乙酸酸化溶液，萃取时间为4-6小时，萃取温度为10-15℃。上述的等电点盐析过程中，用0.3-0.5sat(NH4)2SO4盐溶液使胰蛋白酶最大量溶解于溶液中，同时使酸性蛋白沉淀除去，加至0.65-0.85sat(NH4)2SO4时，沉淀析出酶原。所述的酶原激活过程中，采用的抑制剂和激活剂由CaCl2.苯甲基磺酰氟.半胱氨酸复合而成。上述的反抽提过程中，采用低浓度(NH4)2SO4盐溶液最大限度将酶溶出，同时弃除酸性杂蛋白。
本发明中酶得率高，一是由于在酸溶液萃取过程中，选择远离胰蛋白酶PI值的PH值为2.5-6.0的酸提取液；二是运用低盐浓度溶液酶溶解度最大，以0.3-0.4sat正盐饱和度最大限度将酶溶于盐溶液中，并把等电点低的酸性蛋白沉淀除去；三是运用等电点酶溶解度最小，高饱和度正盐溶液酶溶解最小原理，调饱和度正盐溶液PH值接近酶的PI值使酶沉淀完全，分离好。另外以复合酶激活剂代替单一的酶原激活剂，提高酶的活力。
具体实施例方式
下面结合实施例对其工艺步骤进行具体描述(1)将鸡肠洗净、破碎制成浆状。此过程中温度要控制在10-15℃；(2)酸溶液萃取选择远离胰蛋白酶PI值的PH值为2.5-6.0的酸提取液，酸提取剂可以用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸—氢氧化钠—盐酸缓冲液或乙酸酸化溶液，萃取时间为4-6小时，萃取温度为10-15℃。
(3)盐溶加入固体(NH4)2SO4，饱和度在0.3-0.5sat时，使蛋白酶最大限度溶于正盐溶液中，同时弃除杂蛋白；(4)等电点盐析用5mol/L的NaOH溶液调PH值，接近胰蛋白酶的PI值，继续加入固体(NH4)2SO4，当饱和度在0.65-0.85sat时，沉淀析出酶原；(5)酶原激活采用由CaCl2、苯甲基磺酰氟、半胱氨酸复合而成的抑制剂和激活剂；(6)反抽提采用低浓度(NH4)2SO4盐溶液弃除杂蛋白后调高浓度正盐溶液反复抽提沉淀出酶，得到酶粗品；(7)脱盐纯化采用透析，层析法脱盐纯化酶粗品；(8)结晶干燥得到酶精品。
权利要求
1.一种鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于是以鸡肠消化道为原料。
2.根据权利要求1所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于按以下步骤进行将鸡肠洗净、破碎制成浆状→用酸溶液萃取→盐溶→等电点盐析→酶原激活→反抽提得到酶粗品→脱盐纯化→结晶干燥得到酶精品。
3.根据权利要求2所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于破碎制成浆状过程中，温度要控制在10-20℃。
4.根据权利要求2所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于在用酸溶液萃取过程中，选择远离胰蛋白酶PI值的PH值为2.5-6.0的酸提取液，酸提取剂可以用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸—氢氧化钠—盐酸缓冲液或乙酸酸化溶液。
5.根据权利要求2、3或4所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于萃取时间为4-6小时，萃取温度为10-15℃。
6.根据权利要求2所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于盐溶过程中加入固体(NH4)2SO4，(NH4)2SO4饱和度在0.3-0.5sat时，将酶最大限度溶于盐溶液中，同时将沉淀出的酸性杂蛋白去除
7.根据权利要求6所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于等电点盐析过程中，用5mol/L的NaOH溶液调PH值，接近胰蛋白酶的PI值，继续加入(NH4)2SO4，当(NH4)2SO4盐溶液饱和度在0.65-0.85sat时，沉淀出酶原。
8.根据权利要求2所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于酶原激活过程中，抑制剂和激活剂由CaCl2、苯甲基磺酰氟、半胱氨酸复合而成。
9.根据权利要求2所述的鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法，其特征在于反抽提过程中，采用低浓度(NH4)2SO4盐溶液最大限度将酶溶出，同时弃除酸性杂蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种鸡肠消化道胰蛋白酶的提取方法。是以鸡肠消化道为原料，按以下步骤进行将鸡肠洗净、破碎制成浆状→用酸溶液萃取→盐溶→等电点盐析→酶原激活→反抽提得到酶粗品→脱盐纯化→结晶干燥得到酶精品。推进胰蛋白酶的提取从哺乳动物、鱼类向鸟科动物的发展。
文档编号C12N9/64GK1696284SQ20041015509
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月13日 优先权日2004年5月13日
发明者叶永在 申请人:福建省圣农实业有限公司, 叶永在