PML－RARa基因荧光定量RT－PCR引物和探针及试剂盒的制作方法

专利名称：PML－RARa基因荧光定量RT－PCR引物和探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，特别是涉及定量逆转录PCR检测基因的mRNA表达。
背景技术：
急性早幼粒细胞白血病(APL)最主要的特征是t(15；17)(q22，q11)染色体易位，由于15号染色体上PML断裂点位置的不同，因而形成的融合蛋白也不同。断裂点在PML bcr3形成的融合基因编码短型PML-RARa蛋白，而断裂点在PML bcr1形成的融合基因可产生二种融合蛋白；长型与中间型PML-RARa。中间型PML-RARa在mRNA剪切时去除了PML的外显子5。长型与中间型常在同一病人体内共同表达，短型与长型相比，缺少158个氨基酸长度的脯氨酸、丝氨酸丰富区，而这一区域正是潜在的磷酸化位点，与胞内信号传递功能有关。尽管体外实验发现二者功能差异不是很大，但首先，由维甲酸介导的调节分化基因目前并未完全明了；其次，PML-RARa的介导分化潜能可能受不同调节机制影响，这种机制包括PML-RARa中PML的成分。不同研究小组对长型、短型患者治疗效果及预后的临床观察也不尽相同。另外还有一种罕见的PML-RARa型，发生率为5％～30％，其PML断裂点位点bcr2区，产生相应的融合蛋白称为变异型(Variable form)。从其对RA反应的临床观察结果可分为两种亚型；不敏感型与敏感型，前一种断裂点大多位于PML基因1685nt位点或其临近上游，因其产物保留相对短的6号外显子编码区，故称为E6S亚型。后一亚型断裂点在PML基因1790nt或其临近下游，其产物保留相对较长的6号外显子编码区，因此称为E6L亚型。PML1661～1663nt和167O～1672nt都编码丝氨酸，是潜在的丝氨酸磷酸化位点。目前已知蛋白的磷酸化/去磷酸化状态对胞内信号传递有影响，而V型中对维甲酸不敏感的E6S亚型，其基因断裂点正在其附近。所有PML-RARa的RARa断裂点恒定都在内含子2，故融合蛋白的异质体中RARa成分相同都保留了B-F区，而PML也都保留了富含脯氪酸的反式活化区，与DNA结合有关的环指功能区及一个与蛋白质二聚化有关的双螺旋功能区成分。这说明其仍保留着RARa部分的配体结台功能区，且实验证明融合蛋白与配体RA的亲和力仍正常。因融合蛋白丧失了A区.异常的AF-1呈显性负效应。但因其仍有完整的E区，故AF-2功能仍保留完整。临床上运用全反式维甲酸(ATRA)对APL进行诱导缓解治疗的分子基础就是超生理济量的ATRA能启动AF-2，使维甲酸介导的分化能通过异常的融合蛋白继续进行。
PML-RARa融台蛋白是t(15；17)APL的标志。其产生是两个基因在易断顺序发生非随机断裂所致。正常人体内也含有这些基因顺序而不发生断裂、重组，因此对此二基因断裂、融台的诱导因素的进一步探索将有助于深入理解APL的致病基础。PML和RARa基因断裂、重组后仍能维持基因的表达是产生不正常的融合受体、干扰正常RA信号传递、使细胞分化受阻的基础。提示是否能从干扰表达水平来遏制PML-RARa融合蛋白的产生从而开创治疗APL的新思路。同时，在急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中迅速、准确检出PML-RARa融合基因对于及时应用全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(As2O3)提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡至关重要，因此，亟待建立检测方法以满足临床APL快速、准确诊断的需要。
目前PML-RARa融合基因导致急性早幼粒细胞白血病(APL)检测常用方法有①形态学检查，由于白血病细胞的高度异质性和多态性，重复性差，易受主观因素的影响，其诊断一致率约60％～80％；②免疫学检测方法有两种细胞涂片法和FCM。细胞涂片法所需设备简单，可在显微镜下清楚地判断细胞抗原和抗体结合的部位，尤其对细胞内抗原进行检测时较易排除因细胞膜渗透处理带来的非特异性反应，但目测不易对大量细胞进行计数，故敏感度较低，一般为10-2，目前主要用于细胞内抗原的检测；而FCM可同时对同一细胞中2个以上的抗原进行检测，并对大量细胞行快速分析，准确客观、简单方便。实验证明对其流动系统进行反复和长时间清洗后，检测MRD可获得的最高敏感度是10-6，但实际操作中一般达到的是10-4。③细胞遗传学检测方法，常规应用直接法或短期培养法进行染色体RHG显带，但是白血病细胞分裂指数低，染色体形态短小，常显带不清，使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别。④荧光原位杂交(FISH)，FISH技术灵敏度高，取材方便，骨髓或外周血均可作为研究对象，不仅对分裂中期细胞，而且对间期核细胞均能检测到，对隐匿型、变异型也可同样进行检测分析，是直观、敏感、快速、特异的诊断方法。但是，常用的双色单融合探针检测PML-RARa融合基因时，由于PML和RARa基因信号空间上的随机分布或光学重叠，可造成一定的假阳性。过高的假阳性不仅影响到灵敏度与特异性，还可一定程度上影响研究者对实验结果的解释。⑤分子生物学检测，主要有两种PCR方法一种为直接原位RT-PCR，这种方案更直接且容易实施，直接原位RT-PCR检测慢粒PML-RARa mRNA具有特异性好，敏感度高，且无须提取RNA等优点，但由于引物错配和非特异性退火发生，容易产生非特异性结果。另一种是尚未报道和应用的实时荧光定量检测。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵横标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR扩增过程中加入一对引物的同时也加入一条特异的荧光探针，目前常用的为TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强度，反应结束后，便可得一条工作曲线。
由于荧光定量PCR具有重复性好，灵敏度高，定量结果准确可靠的特点，所以医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题得到了解决。例如，细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率低。免疫组织化学方法提高了血循环中肿瘤细胞染色的特异性，特别是单克隆抗体的应用使染色的特异性和敏感性有了较大的改善，可查出104-105个有核细胞中的一个肿瘤细胞。但该技术则需要特异性的抗体，生产相对复杂。同时，假阳性限制了此项技术的广泛应用。与这些技术相比，荧光定量PCR技术有着明显的优点，由于大多数基因的调节发生于转移水平，有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR应用范围较广；PCR简便易行，只要知道待测基因序列，即可设计合成引物进行逆转录及扩增；该方法具有较高的灵敏度及可重复性，也保证了医学检测结果的准确性。所以该技术的应用，将会对早期寻找肿瘤患者血循环中的肿瘤细胞，发现微小转移，对于指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。

发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR引物和探针及试剂盒，以克服现有技术对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中PML/RARa融合基因mRNA表达水平的定量检测准确性差、灵敏度低、检测速度慢，不利于根据PML/RARa融合基因的表达及时治疗的缺陷。
技术方案本发明是生物技术领域的一种通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中PML-RARA融合基因mRNA表达量的引物、探针和试剂盒。
本发明的技术方案之一是提供一组PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括如下序列PML-RARa融合基因上、下游引物bcr1、bcr2型上游引物为SEQ ID NO15’-AGG AGC CCC GTC ATAGGAAG-3’bcr3型上游引物为SEQ ID NO25’-GAC CTC AGC TCT TGC ATCAC-3’bcr1、bcr2、bcr3型下游引物为SEQ ID NO35’-GTG GTA GCC TGAGGA CTT GT-3’PML-RARa融合基因检测探针为SEQ ID NO45’-FAM-CTG AAG AGA TAG TGC CCA GCC CTC-TAMRA-3’；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
上述的一组PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测引物和探针的优选技术方案为，其序列组还包括内参基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的引物和探针
G6PDH内参基因上、下游引物上游引物SEQ ID NO55’-GGG CCA GTA CCA GTC TTA CA-3’下游引物SEQ ID NO65’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’G6PDH内参基因检测探针SEQ ID NO75’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTAGT-TAMRA-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
本发明的技术方案之二是提供一种含有上述引物和探针序列的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其组成为细胞裂解液、水、含引物序列SEQ ID NO1-3的PML-RARa RT-PCR反应液、内参G6PDH RT-PCR反应液、含探针序列SEQ ID NO4的PML-RARa基因探针、G6PDH基因探针、逆转录酶、DNA聚合酶、标准品、阴性对照、阳性对照。
所说的PML-RARa RT-PCR反应液组成为RT-PCR缓冲液、MgCl2、目的基因(PML-RARa融合基因)上、下游引物、dNTPs、无RNA酶的水。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之一为，所说的内参G6PDH RT-PCR反应液中的引物序列为SEQ IDNO5和6，且所说的G6PDH基因探针序列为SEQ ID NO7。
所说的G6PDH RT-PCR反应液组成为RT-PCR缓冲液、MgCl2、管家基因(G6PDH)上、下游引物、dNTPs、无RNA酶的水。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之二为，所说的标准品为如下DNA序列SEQ ID NO85’-CGATGGCTTC GACGAGTTCA AGGTGCGCCT GCAGGACCTCAGCTCTTGCA TCACCCAGGG GAAAGCCATT GAGACCCAGAGCAGCAGTTC TGAAGAGATA GTGCCCAGCC CTCCCTCGCCACCCCCTCTA CCCCGCATCT ACAAGCCTTG CTTTGTCTGTCAGGACAAGT CCTCAGGCTA CCACTATGGG GTCAGCGCCTGTGAGGGCTG CAAGGGCTTC TTCCGCCGCA GCATCCA-3’作为特例，标准品是含有插入PML-RARa特异性保守序列的T载体，该载体可在大肠杆菌DH5a中增殖。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之三为，所说的水为无RNA酶的水。
一般，无RNA酶的水获得方法为向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.01％6(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20分钟高压，室温放置备用；上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之四为，所说的阴性对照为无PML-RARa融合基因的正常细胞样本。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之五为，所说的阳性对照为含有PML-RARa融合基因的急性早幼粒细胞白血病细胞样本。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之六为，所说的细胞裂解液由细胞裂解液I和细胞裂解液II组成。
作为特例，细胞裂解液I组成为320mM蔗糖、5mM MgCl2、1％TritonX-100，10mM Tris-HCl[pH7.5]、水；作为特例，细胞裂解液II组成为4M硫氰酸胍、0.75M柠檬酸钠(pH7.0)和10％月桂酰基肌氨酸钠(Sarcosyl 1g/10mL)、14.3M β-巯基乙醇、2M醋酸钠(pH4.0)和水饱和酚；上述各方案中所说的逆转录酶和DNA聚合酶在试剂盒中的形式可以为混合两种酶的混合液。一般而言，DNA聚合酶选用耐热Taq DNA聚合酶。
上述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒的优选技术方案之六为，每盒中各组分的量为细胞裂解液I 1瓶24mL、细胞裂解液II 1瓶6mL、无RNA酶的水1瓶2mL、PML-RARa RT-PCR反应液1管210μL、G6PDH RT-PCR反应液1管210μL、PML-RARa基因探针1管30μL、G6PDH内参基因探针30μL、标准品1管10μL、和阴性对照品1管10μL。
本试剂盒中的细胞裂解液(即RNA总提取试剂)应于4℃保存，RT-PCR试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明所设计的引物和探针序列的在基因中的核苷酸位置、Tm值和产物长度如下PML/RARa融合基因检测引物、探针序列

内参引物、探针序列

标准品序列

PCR标准品引物序列

本发明还提供所说的试剂盒的使用方法如下首先，每次检测目的基因(PML-RARa融合基因)和管家基因(G6PDH)均应设立阳性对照和阴性对照。
样品要求1～2mL抗凝的新鲜外周血或骨髓样本。
采集静脉血或骨髓1～2mL于含有抗凝剂的无菌离心管中，或于无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(1.44mg/mL全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可以4℃保存1-2小时，但时间不宜再过长，否则将影响检测结果。全血经处理后，得到的有核细胞可在-80℃或液氮中保存数月，不会影响检测结果。
操作步骤一、总RNA提取1.将新鲜抗凝全血或骨髓1～1.5mL置于1.5mL Beckman离心管中，4℃下3000g离心10min，弃上清液。
2.在下层细胞中补满细胞裂解液I，混匀，冰浴10min其间再次混匀两次，溶液变清表明红细胞已裂解。
3.4℃下3000g离心10min沉淀有核细胞，完全弃去含有裂解细胞的上清液。
4.用细胞裂解液I重复裂解1次后(若沉淀中仍有红细胞，需重复此操作1～2次)，倾去上清，吸干管口。
5.在上述沉淀有核细胞中加入50μL无RNA酶水，用枪头抽吸打散形成清亮不粘的溶液，再加入450μL细胞裂解液II，用移液器反复吹打混匀，室温放置5分钟。
6.加200μL三氯甲烷，用手来回振荡混匀15秒，室温放置5分钟，4℃15,000rpm离心10分钟，将上清移入新的离心管。
7.加入等体积异丙醇，旋涡振荡5秒，室温沉淀10分钟，4℃15,000rpm离心5分钟，弃上清。
8.加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，上下颠倒10次，4℃10,000rpm离心5分钟，吸干上清，沉淀室温干燥10-20分钟，加入20μL无RNA酶水稀释混匀，立即使用或-70℃保存。
二、RT-PCR将装有t(15；17)RT-PCR反应液、内参G6PDH RT-PCR反应液、t(15；17)基因探针、G6PDH管家基因探针、混合酶、标准品、对照品的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，低速离心，用移液器将上述试剂分别配制目的基因(t(15；17)融合基因)和管家基因(G6PDH)RT-PCR反应液，混匀，低速离心，置于冰盒上备有。
按下列组成配制RT-PCR反应液(30μL体系)

RT-PCR反应条件37℃30分钟；95℃5分钟；(95℃10秒，60℃60秒，40个循环)。
三、标准曲线的制作将标准品贮存液(6*107copies/μL)梯度稀释为6*106，6*105，6*104，6*103，6*102copies/μL，取4μL为模板，同待测样品一同进行RT-PCR扩增，制作标准定量曲线。
结果判断1.使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行文件保存及阈值的设定。
2.选中不同浓度标准品，应用相应软件进行分析，得出标准曲线及相关信息。
3.选中样品所对应有目的基因和管家基因检测孔，应用相应的软件进行分析，得出待测样品目的基因和管家基因的起始拷贝数(即[Copy]sample和[Copy]IPC)。
4.根据检测样本目的基因和管家基因的起始拷贝数，计算基因表达率，即Expression Ratio＝[Copy]sample/[Copy]IPC。
有益效果本发明的试剂盒通过对新鲜抗凝外周血有核细胞提取总RNA，为了排除不同标本以及因提取造成在RNA的产量、质量和逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，选择中等丰度表达，在细胞标本间变异较低的G6PDH作为内参照基因进行校正和标准化，再结合实时荧光定量RT-PCR检测技术，可同时准确检测标本中PML-RARa融合基因中L型、S型以及V型的mRNA的表达水平，从而能迅速、准确检出急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中PML-RARa融合基因并及时应用全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(As2O3)提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡，为临床选择可行的治疗方案、预后判断以及疗效观察提供重要的参考依据。
本发明建立了利用TaqMan技术检测PML-RARa融合基因mRNA表达的方法，并且经过对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者标本进行检测，表明该法切实可行。由于本方法采用了荧光定量PCR，使得PML-RARa融合基因mRNA表达的检测敏感性和特异性大大的提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，从而使得本发明可以在极少量的标本中获得足够的信息。同时为了排除不同标本以及因提取时造成在RNA的产量、质量和逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通过筛选确定以中等丰度表达，在细胞标本间变异较低的G6PDH作为内参照基因(也称管家基因)进行校正和标准化。
在本检测项目中，本发明采用了目前最为先进的实时荧光定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下，尽量减少假阳性的干扰。在实量荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的高度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测出起始模板的量，但这些方法实际上都有属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果的分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着本发明实时荧光定量PCR技术的应用，可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高敏灵性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被子检测基因的特异性大大提高。
本发明的引物、探针和试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，该方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于统一标准。针对临床样品的检测显示该方法灵敏度好，重组质粒定量模板，按10倍梯度稀释，可检出10个拷贝，并由此制出标准曲线，线性范围宽(0～107拷贝)，方法的稳定性、重复性、相关性好，相关系数为0.997。荧光定量RT-PCR方法在APL诊断、疗效和预后判断及MRD的动态观察等方面有广泛的应用前景。由于几乎所有的APL患者都能查出PML-RARa融合基因，检测PML-RARa融合基因有助于APL的诊断，而且PML-RARa融合基因阴转已成为APL疗效和预后判断的重要指标。


图1为样本标准检测图。
图2为样品标准曲线图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，Trizol试剂购自上海生工公司，限制性内切酶购自上海申能博彩生物公司，MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18均购自美国Promega公司，引物和探针均由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，iCycle荧光PCR仪为BIO-RAD公司产品。
实施例1实时荧光定量RT-PCR法检测人PML-RARa融合基因mRNA的表达及应用一、引物及探针设计与合成以PML-RARa融合基因其中一种bcr3(S型)全长cDNA序列(GenBank登录号M73779)为模板，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，并根据同时考虑PML和RARa两基因组DNA序列的情况，从中选择最佳组合。
标准品PCR上游引物序列为5’-CGA TGG CTT CGA CGA GTT CA-3’；下游引物序列为5’-TGG ATG CTG CGG CGG AAG A-3’；检测用PCR上游引物序列为5’-AGG AGC CCC GTC ATA GGA AG-3’和5’-GAC CTC AGC TCT TGC ATC AC-3’；下游引物序列为5’-GTG GTAGCC TGA GGA CTT GT-3’；荧光探针序列为5’-FAM-CTG AAG AGA TAG TGC CCA GCCCTC-TAMRA-3’；二、检测标准品制备
取患者新鲜外周血，分离外周血有核细胞，经PBS洗涤后，离心收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，取1μgRNA，在25μL总反应体系中用Oligo(dT)15-18为引物对其进行逆转录后，用标准品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR扩增仪上进行PCR扩增，反应条件为95℃变性5分钟，再按95℃20秒、57℃20秒、72℃45秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸7分钟后置于4℃。
PCR扩增产物经电泳检测后送上海闪晶生物公司进行克隆(质粒由应公司提供)，并将阳性克隆经测序验证(由上海基康公司测序)。提取阳性克隆质粒，即为标准品，测定其浓度并换算成(拷贝数/体积)。
三、标本检测取7例经病理确定的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者和3例正常人外周血标本1.5mL，分离外周外有核细胞，经PBS洗涤后，离心收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，取4μL RNA提取液，在30μL总反应体系中，用检测用上、下游引物以及管家基因上、下游引物同时在iCycle荧光PCR仪上进行PCR扩增，反应条件均为37℃保温30分钟，95℃变性5分钟，再按95℃20秒、60℃60秒进行40个循环扩增，同时加入标准品检测作标准曲线，测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的PML-RARa融合基因和G6PDH管家基因的拷贝数，再根据两者的拷贝数计算PML-RARa融合基因表达率。
四、结果(一)标准品的制备经测序，上述设计的标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下5，-CGATGGCTTC GACGAGTTCA AGGTGCGCCT GCAGGACCTCAGCTCTTGCA TCACCCAGGG GAAAGCCATT GAGACCCAGAGCAGCAGTTC TGAAGAGATA GTGCCCAGCC CTCCCTCGCCACCCCCTCTA CCCCGCATCT ACAAGCCTTG CTTTGTCTGTCAGGACAAGT CCTCAGGCTA CCACTATGGG GTCAGCGCCTGTGAGGGCTGCAAGGGCTTC TTCCGCCGCA GCATCCA-3’(二)样品检测标准品检测结果见图1，标准曲线见图2。
7例白血病(APL)患者和3例正常人外周血荧光定量RT-PCR检测结果如下患者编 性 年 融合基因 G6PDH 表达率(Ratio)标本(CopyPML/ABL/号 别 龄 (copies/mL) (copies/mL)CopyG67DH)1 女 32 外周血 1.171*1033.564*1023.292 男 47 外周血 6.142*1025.894*1021.043 女 41 外周血 1.073*1032.149*1024.994 男 53 外周血 2.531*1012.846*1010.895 男 38 外周血 3.719*1024.417*1020.846 女 65 外周血 2.142*1032.782*1027.707 女 59 外周血 8.246*1021.042*1027.918 男 36 外周血 - --
9 男 29外周血---10女 61外周血---采用同样的检测PCR上、下游引物以及同样的7例样本进行原位RT-PCR检测。
实验方案如下逆转录反应反应体系20μL.含200μmol/L dNTPs.1μmoI/L下游引物，RNA酶抑制剂40U和Mo-MLV 20U，反应液经一个基因框(GeneFrame，购于Advanced Biotechnologies公司)密封在上述玻片中心附有细胞的区域，玻片在原位PCR仪(Genius，英国Techne公司)中42℃反应30min，结束后去除基因框，甩弃反应液。
原位PCR反应体系25μL，含200μmol/L dNTPs，1μmol/L上、下游引物，4.5mmol/L MgCl2，10μmol/L地高辛标记的dUTP和Taq酶5U。反应液同样密封在上述部位，反应条件为95℃变性5min后，以94℃变性，58℃退火和72℃延伸各1min，在原位PCR仪上，总共进行25循环。
扩增产物检测①洗片2×SSC洗片3次，含0.1％吐温-20的Buffer I(0.1moI/L Tris-HCI pH7.5，0.15M MgCl2)洗2次，每次5min；含5％牛血清白蛋白(BSA)和3％绵羊血清的Buffer II室温孵育30min，再用抗地高辛抗体滴片，湿盒内37℃孵育2h；②再洗片含0.1％吐温-20的Buffer I洗3次，Buffer II洗1次，Buffer III(0.1mol/L Tris-HCl pH9.5，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2)洗1次，每次5min；NBT/BCIP避光染色约30min，光镜下观察，待显色适度后水洗终止，盖上盖玻片，甘油明胶封片；③结果判断细胞浆中出现蓝紫色颗粒物质为阳性，阴性者胞浆内无蓝紫色颗粒。
7例白血病(APL)患者和3例正常人外周血原位RT-PCR检测结果如下编号 性别 年龄 标本 检测结果1女32 外周血阳性2男47 外周血阳性3女41 外周血阳性4男53 外周血阳性5男38 外周血阳性6女65 外周血阳性7女59 外周血阳性8男36 外周血阴性9男29 外周血阴性10 女61 外周血阴性虽然，原位RT-PCR检测结果与荧光定量RT-PCR检测结果一致，但其操作过程过余复杂，结果判断受主观因素的影响，而且只能作定性检测，不能迅速、准确检出急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中PML-RARa融合基因并及时应用全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(As2O3)以提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡，为临床选择可行的治疗方案、预后判断以及疗效观察提供重要的参考依据。
核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>上海复星医药(集团)股份有限公司上海复星医学科技发展有限公司<120>PML-RARa基因荧光定量RT-PCR引物和探针及试剂盒<130>060801<140>CN<141>2006-08-10<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>PML-RARa融合基因bcr1、bcr2型上游引物<222>(1)..(20)<400>1aggagccccg tcataggaag 20
<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>PML-RARa融合基因bcr3型上游引物<222>(1)..(20)<400>2gacctcagct cttgcatcac 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>PML-RARa融合基因bcr1、bcr2、bcr3型下游引物<222>(1)..(20)
<400>3gtggtagcct gaggacttgt 20<210>4<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>PML-RARa融合基因检测探针<222>(1)..(24)<223>n＝FAM，y＝TAMRA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<400>4nctgaagaga tagtgcccag ccctcy 26<210>5<211>20
<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>G6PDH内参基因上游引物<222>(1)..(20)<400>5gggccagtac cagtcttaca 20<210>6<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>G6PDH内参基因下游引物<222>(1)..(20)<400>6ccagcgaagg ttgtcaatgt 20
<210>7<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>G6PDH内参基因检测探针<222>(1)..(23)<223>n＝FAM，y＝TAMRA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<400>7nccgaccttc gcagccgtcc tagty 25<210>8<211>237<212>DNA<213>Homo sapiens
<220>
<221>PML-RARa融合基因检测标准DNA<222>(1)..(237)<400>8cgatggcttc gacgagttca aggtgcgcct gcaggacctc agctcttgca tcacccaggg 60gaaagccatt gagacccaga gcagcagttc tgaagagata gtgcccagcc ctccctcgcc 120accccctcta ccccgcatct acaagccttg ctttgtctgt caggacaagt cctcaggcta 180ccactatggg gtcagcgcct gtgagggctg caagggcttc ttccgccgca gcatcca23权利要求
1.一组PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括如下序列PML-RARa融合基因上、下游引物bcr1、bcr2型上游引物为SEQ ID NO15’-AGG AGC CCC GTC ATAGGAAG-3’bcr3型上游引物为SEQ ID NO25’-GAC CTC AGC TCT TGC ATCAC-3’bcr1、bcr2、bcr3型下游引物为SEQ ID NO35’-GTG GTA GCC TGAGGA CTT GT-3’PML-RARa融合基因检测探针为SEQ ID NO45’-FAM-CTG AAG AGA TAG TGC CCA GCC CTC-TAMRA-3’；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的一组PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测引物和探针，其序列组还包括内参基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的引物和探针G6PDH内参基因上、下游引物上游引物SEQ ID NO55’-GGG CCA GTA CCA GTC TTA CA-3’下游引物SEQ ID NO65’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’G6PDH内参基因检测探针SEQ ID NO75’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTAGT-TAMRA-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
3.一种含有权利要求1所述序列的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其组成为细胞裂解液、水、含有权利要求1所述引物序列SEQ ID NO1-3的PML-RARa RT-PCR反应液、内参G6PDH RT-PCR反应液、含有权利要求1所述探针序列SEQ ID NO4的PML-RARa基因探针、G6PDH基因探针、逆转录酶、DNA聚合酶、标准品、阴性对照、阳性对照。
4.根据权利要求2或3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的内参G6PDH RT-PCR反应液中的引物序列为SEQ ID NO5和6，且所说的G6PDH基因探针序列为SEQ ID NO7。
5.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的标准品为如下DNA序列SEQ ID NO85’-CGATGGCTTC GACGAGTTCA AGGTGCGCCT GCAGGACCTCAGCTCTTGCA TCACCCAGGG GAAAGCCATT GAGACCCAGAGCAGCAGTTC TGAAGAGATA GTGCCCAGCC CTCCCTCGCCACCCCCTCTA CCCCGCATCT ACAAGCCTTG CTTTGTCTGTCAGGACAAGT CCTCA6GCTA CCACTATGGG GTCAGCGCCTGTGAGGGCTG CAAGGGCTTC TTCCGCCGCA GCATCCA-3’。
6.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的水为无RNA酶的水。
7.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的阴性对照为无PML-RARa融合基因的正常细胞样本。
8.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有PML-RARa融合基因的白血病细胞样本。
9.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的细胞裂解液由细胞裂解液I和细胞裂解液II组成。
10.根据权利要求3所述的PML-RARa融合基因mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，每盒中各组分的量为细胞裂解液I1瓶24mL、细胞裂解液II1瓶6mL、无RNA酶的水1瓶2mL、PML-RARa RT-PCR反应液1管210μL、G6PDH RT-PCR反应液1管210μL、PML-RARa基因探针1管30μL、G6PDH内参基因探针30μL、标准品1管10μL、和阴性对照品1管10μL。
全文摘要
本发明涉及一种PML－RARa融合基因荧光定量RT－PCR引物和探针及试剂盒，PML－RARa基因引物和探针序列为SEQ ID NO1－4，内参基因引物和探针序列为SEQ ID NO5－7，试剂盒包含细胞裂解液、水、RT－PCR反应液、内参G6PDHRT－PCR反应液、基因探针、G6PDH内参基因探针、混合酶、标准品、对照品。可同时、迅速、准确地检测PML－RARa融合基因中L型、S型以及V型的mRNA的表达水平，及时应用全反式维甲酸或亚砷酸，提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡，为临床选择可行的治疗方案、预后判断以及疗效观察提供重要的参考依据。
文档编号C12Q1/68GK1995385SQ20061003029
公开日2007年7月11日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者沈维祥, 吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司, 上海复星医学科技发展有限公司