专利名称：猪精囊腺生物反应器及利用其生产重组蛋白或多肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种在转基因猪精囊腺中合成重组蛋白或多肽并分泌至公猪精液中的方 法，更具体而言，涉及一种转基因猪精囊腺生物反应器及利用该生物反应器生产重组蛋白 或多肽的方法。
背景技术：
目前许多珍贵的药用蛋白可利用DNA重组技术在细菌、真菌和酵母中表达，经大规模 的培养而进行生产。但是许多蛋白质的生物活性是经后加工后才具有的，比如进行糖基化、 羟基化和羧基化。在许多情况下，原核细菌缺乏转译后加工修饰能力，而酵母细胞对表达 蛋白的加工模式不同于人源蛋白质，表达产物可能有免疫原性或无活性。虽然动物细胞培 养基因工程制药体系可以实现这些活性加工过程，但动物细胞培养体系成本太高，产量较 低，无法满足大多药用蛋白的临床需求。利用转基因动物生物反应器生产的蛋白是在动物 体内合成和分泌的，体内系统环境具有对异源蛋白质进行翻译后修饰和加工功能，生产的 蛋白质生理活性好，与人同源性高，非常接近天然产品，而且产量高、成本低。这是其它 表达系统所无法比拟的。因此转基因动物生物反应器是当前极具发展前景的蛋白药物生产 方式。转基因动物生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器 官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白 一般是药用蛋白或营养保健蛋 白。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫(例如 家蚕)个体等。其基本原理是应用重组DNA技术，构建具有在组织特异表达的启动子和 目的基因及其它相关元件的基因表达载体，然后利用基因转移技术将该表达载体整合到动 物的基因组中，产生转基因动物，该基因表达载体则能在相应组织特异表达并分泌到相应体液中。据此原理，任何具有大量表达某种或某些蛋白的组织或器官都具有研发生物反应 器的可能。自从第一只转基因小鼠诞生以来，人们就提出了利用转基因动物生产药用蛋白的可 能。目前利用转基因动物生物反应器生产重组蛋白已经取得重要进展，特别是动物乳腺生 物反应器。目前全世界有二三十家公司致力于开发动物生物反应器重组蛋白药物，包括重组人抗凝血酶m(预防和治疗急慢性血栓血塞形成)、重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂 (抗栓药)和人ci抑制剂(治疗血管神经性水肿的药物)等，其中重组人抗凝血酶in是 第一个获准上市的动物生物反应器蛋白药物。转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器等生产 的重组蛋白已经完成或进入临床m期试验，还有io多种重组蛋白药物处于临床研究，另 有数百种重组蛋白处于研发阶段。此外还有动物血液生物反应器、膀胱生物反应器(尿液 中生产重组蛋白)等表达系统处在不同的研发阶段。然而，相比较而言，乳腺等表达系统也存在一些无法改进的不足，如出生至第一次泌乳时间间隔相当长；繁殖周期长；存在较长的泌乳间隔期；有些动物比较难以收集乳汁， 如猪、兔等；另外有些乳腺表达的外源生物活性蛋白能被动物吸收，可能对动物健康有害， 特别是在表达水平比较高时。转基因鸡生物反应器目前所不能克服的缺点是禽类的胚胎发育与哺乳类相比较有很多 不同点，对它的研究暂时落后于其它动物，使得转基因鸡的应用仍存在较多困难，致使在 哺乳动物中己经广泛应用的转基因技术，不适合在禽类中应用。而对于血液生物反应器而 言，由于人源和家畜血液中的蛋白往往比较相似，再加上血液的成份比较复杂，分离比较 困难；此外高浓度外源蛋白在血液中，可能对动物机体健康有害，这些不利因素限制了血 液表达系统的应用。尿液表达系统的主要问题是尿中能够表达的外源蛋白产量比较低。发明内容本发明的一个目的在于提供一种在转基因公猪精囊腺中生产重组蛋白或多肽的方法， 其具有产量大，分离纯化简单，无繁殖间隔期等特点。本发明另一个目的在于提供了一种在公猪精囊腺组织中特异表达和分泌外源蛋白的 基因表达载体。本发明人以小鼠为实验动物模型，经过大量基础研究工作，终于完成了本发明。
在转基因猪精囊腺组织中特异表达的基因表达载体，该表达载体所含的5'侧翼区、 启动子、信号肽、多聚腺苷酸化信号和3'侧翼区序列能指导外源基因在公猪精囊腺组织
中特异表达，并分泌重组蛋白或多肽至精液中。
所述的启动子选自猪精浆蛋白基因的启动子。选自猪精浆蛋白基因的启动子为猪精浆 中精子粘附素蛋白家簇基因的启动子。猪精浆中精子粘附素蛋白家簇基因的启动子为猪精 浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的启动子。
所述的在转基因猪精囊腺组织中特异表达的基因表达载体，还包括一段猪精桨蛋白I
基因或精浆蛋白n基因的5'侧翼序列。
所述的信号肽DNA序列为猪精浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的信号肽序列。 所述的3'侧翼序列为猪精浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的3'侧翼序列。 所述的多聚腺苷酸化信号序列为猪精浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的多聚腺苷酸化 信号序列。
本发明提供的一套全新的以转基因猪为宿主动物的生物反应器，由转基因猪精囊腺组 织组成，其中所述的转基因猪由上述本发明提供的基因表达载体制作而成。
利用这个系统，可以从转基因猪精液中获取基因重组蛋白或多肽。本发明的生物反应 器提供了一种在活体状态下在特定组织特异表达蛋白质和多肽，并进行糖基化、羟基化和 羧基化等生物活性加工方法。
从转基因猪精囊腺生产外源蛋白或多肽的方法，主要包括如下步骤(1)构建在公 猪精囊腺组织特异表达的基因表达载体；(2)釆用本领域技术人员熟知的方法，如精子 载体法或胚胎显微注射法将基因表达载体整合进动物基因组中，制作转基因动物；(3) 母猪分娩后，采集后代仔猪的血细胞或组织DNA分析和确定转基因个体；(4)培育转基 因公猪和母猪至性成熟并交配传代；(5)采集F0或Fl代性成熟转基S公猪的精液，分 析外源基因表达产物的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主或作为生物反应器种 猪；(6)从性成熟转基因公猪的精液中分离纯化所述的外源蛋白或多肽。更具体地，对本发明的进一步描述如下-
转基因动物生物反应器的关键是获得高效特异表达的基因表达载体。本发明成功装配 了一套合适的基因表达载体，携带有该表达载体的转基因公猪能在精囊腺组织中特异地高 水平表达外源基因，进行相应生物活性加工，并分泌至精液中。在一个实施方案中，本发 明的基因表达载体的启动子是源自公猪精浆蛋白的主要成员精浆蛋白II(porcine seminal proteins II， PSPII)基因的启动子，该启动子是基因高效表达的重要调控元件。猪精浆 蛋白I和II是精子黏附蛋白(Spermadhesion)家簇的主要成员，主要在精囊腺表达，精 浆蛋白工和II的含量占精浆总蛋白的50%以上，提示该基因的表达调控元件具有高效特异 表达的特性。在本发明的其它实施方案中，能在公猪精囊腺组织中表达，并在精液中含有 的精浆蛋白的基因表达调控元件(启动子、信号肽和多聚腺苷酸化信号等)均可指导外源 基因表达。
除启动子外，本发明的基因表达载体还装配了猪精浆蛋白II信号肽(SP)和多聚腺 苷酸(poly A)化信号及5'和3'侧翼区序列，这些基因表达调控元件能使表达的外源 基因的信使核糖核酸(mRNA)趋于稳定，延长其半衰期，提高其在组织的表达量。
上述基因元件预先装配在可在大肠杆菌里复制的质粒载体上，外源基因通过克隆位点 插入启动子下游，从而构建成含外源基因的表达载体。该基因表达载体可通过本领域技术 人员熟知的方法，进行重组质粒的大量制备和纯化，然后利用本领域技术人员熟知的精子 载体法或胚胎显微注射法等进行转基因动物生产。
转基因仔猪出生后，利用聚合酶链反应(PCR)和Southern印迹技术分析确定转基因 个体(F0)，传代(Fl)并培育至性成熟。收集F0和F1成年公猪精液，检测目标蛋白的 表达水平。优选表达水平高的公猪作为本发明的生物反应器宿主进行种群扩繁。
本发明方法先进简单，成本低。在公猪精囊腺中特异表达的基因表达载体，该表达载 体含启动子、信号肽和多聚腺苷酸化信号的DNA序列等调控元件，当该表达载体通过转基 因技术整合入猪基因组中后，重组蛋白或多肽能在转基因成年公猪精囊腺组织中特异表 达，并分泌至精液中。本发明的特点是所生产的重组蛋白或多肽可以从精液中直接收获。
利用转基因猪精囊腺生产外源蛋白是很有吸引力的一个全新领域。与其它动物相比，制作猪精囊腺生物反应器，利用猪精液生产外源蛋白具有独特优势(1)猪的精液量较 大， 一次射精在200-400ml左右，精液中的蛋白质含量较高，每次射精精液中的蛋白质可 达6-9克，并且其中主要蛋白精浆蛋白1和精浆蛋白11占50%以上，主要由精囊腺分泌， 其基因的调控区非常适合做基因表达载体的调控元件。(2)猪的精囊腺组织具有表达和 加工复杂蛋白的能力；(3)公猪性成熟早，6-9月龄即性成熟；成年后可持续利用，每周 可采集4-5次，精液在一年四季中可以不断采集，可利用年限长达4-6年；(4)猪精液 采集和处理技术已经相当成熟，精液成份也相对简单，容易纯化蛋白；(5)容易繁殖， 产仔数多， 一旦成功研制转基因种猪，即可迅速繁殖，扩大种群，产业化后商业成本低；(6)表达产物主要在精囊腺组织及精液中，对身体的潜在危害小。因此猪精囊腺生物反 应器具有和牛乳腺生物反应器同样的生产潜力，而在维持成本、生产周期等方面具有明显 优势。
图1示出猪精浆蛋白II基因5'调控序列的克隆，重组质粒命名为pMDI8-T-PSPII 5。 (实施例l所述)图2示出将猪精浆蛋白II基因5'调控序列亚克隆至改造的pcDNA3.0载体,命名为 pcPSPI15。(实施例1所述)图3示出猪精浆蛋白II基因3'调控序列的克隆，重组质粒命名为pMD18-T-PSPI1 3。 (实施例l所述)图4示出含有猪精浆蛋白II基因5'调控序列、多聚腺苷酸化信号和3'侧翼区序列 的特异表达载体的构建，重组载体命名为pcPSPI153。(实施例l所述)图5示出含有猪精浆蛋白II基因启动子、信号肽、多聚腺苷酸化信号和3'侧翼区序 列的pcPSPII重组质粒的构建。(实施例1所述)图6示出含有猪精浆蛋白II基因启动子、信号肽、增强型绿色荧光蛋白报告基因、多聚腺苷酸化信号和3'侧翼区序列的pcPSPII-EGFP重组质粒的构建。(实施例1所述) 图7示出进行转基因小鼠制作时所用的表达构件，含猪精浆蛋白II基因启动子、信号
肽序列、增强型绿色萤光蛋白报告基因的编码序列、猪精浆蛋白II基因多聚腺苷酸化信号
序列和3'端侧翼区。(实施例2所述)
图8示出转基因小鼠的PCR鉴定结果。(实施例3所述)
图9示出绿色荧光蛋白在转基因阳性公鼠精囊腺组织中的表达。(实施例3所述)
图IO示出转基因阳性公鼠交配后形成的阴道栓中绿色荧光蛋白的表达。(实施祸3所
述)
具体实施例方式
实施例1构建基因表达载体
为了构建能在公猪精囊腺中表达的专用表达载体，并分泌至精液中，本实施方案选择 pcDNA3.0作为载体构建的基础骨架，依次将各种基因元件插入改造后的pcDNA3.0载体。
1. pcDNA3.0的改造根据酶切图谱分析结果，用限制酶PvuII消化pcDNA3.0载体， 切除其中的neo基因及其表达调控序列，消化产物用琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶 回收试剂盒回收3.2kb片段，自体连后转化DH5a感受态大肠杆菌，从阳性转化菌种获得 不含neo基因及其表达调控序列的改造质粒。
2. 制备和克隆猪精浆蛋白II基因启动子根据Genbank己发表的猪精浆蛋白II基因 序列(AJ853849)，用DNASTAR分析PSP-II基因全序列的限制性内切酶位点，并设计一 对引物扩增PSP-II基因5'端侧翼区，长度为4087bp，上游至-4087，下游至ATG起始密 码子处，其中包括启动子。上游引物为5' —AG rCGCG^ TGA GTT GAG GGG TAT TCA CCA AAC —3'，在引物中引进了 Nru I酶切位点(下划线处)，下游引物为5' —AT GGC^CGCGrCTC AGC AGC CTG GCC CTAGC— 3，在引物中引进了 Kpn I和Mlu I 酶切位点(下划线处)。取500纳克猪基因组模板，加入上述引物，在高保真DNA聚合酶 LATaq (日本宝生物公司)作用下(反应体系参数按说明书设置)，经95'C预变性5分钟；94。C变性40秒，6rC复性90秒，72。C延伸6分钟，共30循环；然后72。C延伸10分钟， 最后扩增出长度为4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区，该片段即含有精浆蛋白II 基因的启动子。PCR扩增产物于0.7n/。琼脂糖凝胶中进行电泳，然后切胶回收纯化4087bp 长度的目标DNA片段，纯化用DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0，日本宝生物公司)，按操作说明书进行。然后按常规方法克隆入TA克隆载体 pMD18-T (日本宝生物公司)，筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，得到 含4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区的pMD18-T-PSPI15重组质粒(图1 )。然后将 pMD18-T-PSPII5重组质粒和改造过的pcDNA3质粒用Nrul和Kpnl进行酶切，电泳后切胶 回收纯化4087bp和线性化的2589bp片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，转化大 肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取转化后生长的白色菌落接种于lml含10(Vg/ml氨苄青霉素 的LB培养基中，37'C振荡培养10-12小时，然后按照常规方法提取质粒DNA,筛选阳性 克隆，进行酶切鉴定，得到含4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区的pcPSPI15重组 质粒(图2)。
3.制备和克隆猪精浆蛋白II基因3'端侧翼区根据Genbank已发表的猪精浆蛋白 II基囟序列(AJ853849)，用DNASTAR分析PSP-II基因全序列的限制性内切酶位点，并 设计一对引物扩增PSP-II基因3'端侧翼区，长度为3094bp，上游至终止密码子，下游至 终止密码子后3094bp，其中包括PSP-II基因多聚腺苷酸化信号序列。上游引物为5' CT ^e￡i￡￡TGCTGTAATCATTTTGAATAAAG3，，在引物中引进了KpnI酶切位点(下 划线处)，下游引物为5'ATCT2^GTGAACTGTTTACCATGAATTGT3'，在引物中 引进了Xho I酶切位点(下划线处)。取500纳克猪基因组模板，加入上述引物，在高保 真DNA聚合酶LATaq (日本宝生物公司)作用下(反应体系参数按说明书设置)，经95°C 预变性5分钟；94。C变性40秒，57'C复性60秒，72。C延伸4分钟，共30循环；然后72°C 延伸10分钟，最后扩增出长度为3094bp的猪精浆蛋白II基因3'端侧翼区，该片段含有 精浆蛋白II基因多聚腺苷酸(polyA)化信号序列。PCR扩增产物于0.7。/。琼脂糖凝胶中进 行电泳，然后切胶回收纯化3094bp长度的目标DNA片段，按本实施方案例子中第2条所 述方法插入pMD18-T克隆载体，并对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，得到含3094bp的猪精浆蛋白II基因3'端侧翼区的pMD18-T-PSPII3重组质粒(图3)。然后将pMD18-T-PSPII3 和pcPSPII5'用Kpnl和Xhol进行酶切，电泳后切胶回收纯化3094bp和线性化的pcPSPI15 片段，按本实施方案例子中第2条所述方法进行连接，转化，筛选阳性克隆，进行酶切鉴 定，得到含4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区和含3094bp的猪精浆蛋白1I基因3' 端侧翼区的重组质粒pcPSPI153 (图4)。
4. 合成猪精浆蛋白II基因信号肽序列和插入位点:按照猪精浆蛋白II基因的mRNA序 列(NM_213836)所示，其信号肽长为21个氨基酸，自ATG起，共由63个核苷酸编码。 根据此序列，从ATG起始密码子，人工合成此信号肽的DNA双链序列，并延伸了猪精浆 蛋白II成熟肽的两个氨基酸的密码子(GCACGG)，使信号肽易于识别。最后在5'端引 入MM酶切位点(ACGCGT，如下图所示下划线部分)，在3'端引入EcoRV HindIII Not I Kpn I酶切位点(GATATC AAGCTT GCGGCCGC GGTACC，如下图所示下划线部分)， 便于外源基因的插入。合成的信号肽编码序列和插入位点如下
MM EcoR V他d III Notl Kpnl
ACGCGTATGAAGCTGGGCACTGCCATCCCCTGGGCaTGCTGCTCAGTACAGCCACACTGGnTCAACTGCACGGGATATCAAGCnGCGGCCGCGGTACC 5' 3'
5. 装配猪精浆蛋白II基因信号肽序列和插入位点将重组质粒pcPSPI153和人工合 成的信号肽DNA双链序列片段用Kpnl和Mlul进行酶切，电泳后切胶回收纯化线性化片 段，按本实施方案例子中第2条所述方法进行连接，转化，筛选阳性克隆，进行酶切和测 序鉴定，得到含4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区、信号肽序列和3094bp的猪精 浆蛋白II基因3'端侧翼区pcPSPII重组质粒(图5)。
6. 在pcPSPII表达载体中插入绿色萤光蛋白报告基因将pcPSPII重组质粒和商业化 质粒pEGFP-Nl用HindIII和Notl进行酶切，电泳后切胶回收纯化目的片段，按本实施方 案例子中第2条所述方法进行连接，转化，筛选阳性克隆，进行酶切和PCR鉴定，将增强 型绿色萤光蛋白报告基因的编码序列插入pcPSPII，得到pcPSPII-EGFP重组质粒(图6)。
实施例2通过转基因技术将表达构件导入小鼠基因组
将pcPSPII-EGFP表达载体用Nrul和Xhol酶切，电泳后切胶回收纯化含猪精浆蛋白II基因启动子、信号肽序列、绿色萤光蛋白报告基因的编码序列、猪精浆蛋白II基因多聚 腺苷酸化信号序列和3'端侧翼区的目的片段(图7)。将30微克该片段用多聚阳离子PEI 包裹，注入到六周龄的公鼠睾丸中，共注射三次，间隔为3天，从最后一次注射算起，20 天后，将注射的公鼠与正常母鼠进行交配。待杂交小鼠出生后用PCR鉴定，筛选转基因阳 性小鼠。并继续培育转基因阳性公鼠和母鼠到性成熟(FO),并与正常小鼠交配，培育出 Fl代转基因阳性公鼠和母鼠。图8显示了F0代和F1代转基因小鼠PCR鉴定结果。图A 代表了FO代检测结果，泳道1-5为F0代个体，泳道6为阳性对照，泳道7为非转基因小 鼠阴性对照，其中泳道2， 4为转基因阳性小鼠。图B代表了F1代检测结果，泳道l-8为 转基因阳性小鼠，泳道9为非转基因小鼠阴性对照，泳道10为阳性对照。 实施例3分析转基因公鼠中外源基因的表达
将实施例2中的性成熟转基因阳性公鼠Fl代的转基因公鼠切开腹腔，分别切下一块 精囊腺组织，制作冰冻切片。同时取一只阴性公鼠，制作冰冻切片，作为对照，于荧光显 微镜下观察绿色荧光，在转基因阳性公鼠的精囊腺组织观察到绿色荧光，而在阴性对照公 鼠中观察不到绿色荧光(图9)。其中图A为转基因阳性小鼠精囊腺组织切片，图B为非 转基因小鼠精囊腺组织切片。并将转基因阳性公鼠与正常母鼠交配后收集阴道栓，用缓冲 液(TrislOmM,EDTAlmM)溶解阴道栓，于荧光显微镜下观察绿色荧光，在转基因阳性 公鼠交配后收集到的阴道栓溶解液中观察到绿色荧光，而在阴性对照公鼠交配后收集到的 阴道栓溶解液中观察不到绿色荧光(图10)。其中图A为转基因阳性公鼠与正常母鼠交 配后所收集阴道栓的溶解液，图B为非转基因阳性公鼠与正常母鼠交配后所收集阴道栓的 溶解液。
权利要求
1、一种在转基因猪精囊腺组织中特异表达的基因表达载体，其特征是所含的5’侧翼区、启动子、信号肽、多聚腺苷酸化信号和3’侧翼区序列能指导外源基因在公猪精囊腺组织中特异表达，并分泌重组蛋白或多肽至精液中。
2、 如权利要求1所述的基因表达载体，其特征是所述的启动子选自猪精浆蛋 白基因的启动子。
3、 如权利要求2所述的基因表达载体，其特征是所述的启动子为猪精浆中精 子粘附素蛋白家簇基因的启动子。
4、 如权利要求3所述的基因表达载体，其特征是所述的启动子为猪精浆蛋白 I基因或精浆蛋白II基因的启动子。
5、 如权利要求1所述的基因表达载体，其特征是还包括一段猪精浆蛋白I基 因或精浆蛋白II基因的5'侧翼序列。
6、 如权利要求1所述的基因表达载体，其特征是所述的信号肽DNA序列为猪 精浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的信号肽序列。
7、 如权利要求1所述的基因表达载体，其特征是所述的3'侧翼序列为猪精 浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的3'侧翼序列。
8、 如权利要求1所述的基因表达载体，其特征是所述的多聚腺苷酸化信号序 列为猪精浆蛋白I基因或精浆蛋白II基因的多聚腺苷酸化信号序列。
9、 一种生物反应器，其特征是由转基因猪精囊腺组织组成，其中所述的转基 因猪由权利要求1-8的基因表达载体制作而成。
10、 一种从转基因猪精囊腺生产外源蛋白或多肽的方法，其特征是包括如下 步骤(1)将编码所述的蛋白或多肽的外源基因插入到权利要求1-8的基因表达载体中；(2) 利用本领域技术人员熟知的精子载体法或胚胎显微注射法将基因表达载 体和目标基因整合进猪基因组中；(3) 母猪分娩后，采集仔猪的血细胞或组织DNA分析和确定转基因个体；(4) 培育转基因公母猪个体至性成熟并传代；(5) 采集F0或Fl代成熟转基因公猪的精液，分析外源基因表达产物的含量， 选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种用动物；(6) 从转基因公猪的精液中分离纯化所述的外源蛋白或多肽。
全文摘要
本发明公开了一种猪精囊腺生物反应器及利用其生产重组蛋白或多肽的方法，在公猪精囊腺中特异表达的基因表达载体，该表达载体含启动子、信号肽和多聚腺苷酸化信号的DNA序列等调控元件，当该表达载体通过转基因技术整合入猪基因组中后，重组蛋白或多肽能在转基因成年公猪精囊腺组织中特异表达，并分泌至精液中。本发明的特点是所生产的重组蛋白或多肽可以从精液中直接收获，方法先进简单，成本低。与其它动物相比，在维持成本、生产周期等方面具有明显优势。
文档编号C12N15/09GK101294166SQ200710134099
公开日2008年10月29日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者宋成义, 滕尚辉, 王宵燕, 王志跃, 飞 谢, 赵文明, 陈国宏, 波 高 申请人:扬州大学