产生多不饱和脂肪酸的方法

专利名称：：产生多不饱和脂肪酸的方法产生多不饱和脂肪酸的方法本发明涉及在转基因植物中产生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法，该方法包括在所述植物中提供至少一种核^f列，其编码具有A6-去饱和酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A6-延伸酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽；和至少一种核酸序列，其编码具有A5-延伸酶活性的多肽，其中编码具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列与该序列的来源生物中的核酸序列相比较受到修饰，因为它适应于一种或更多种植物种中的密码子选择。在优选的实施方案中，还提供了其它的核酸序列，其编码在植物中具有co3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶活性的多肽。在进一步优选的实施方案中，提供了其它核酸序列，其在植物中编码酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶(acetylenase)、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶(alleneoxidesynthases)、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。本发明此外涉及重组核酸分子，所述重组核酸分子包含至少一种核酸序列，其编码具有A6-去饱和酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A6-延伸酶活性的多肽；和至少一种核酸序列，其编码具有A5-延伸酶活性的多肽，并且其与该序列来源的生物中的核酸序列相比较受到j务饰，因为它适应于一种或更多种植物种中的密码子选择。本发明的另一部分涉及已经通过本发明的方法产生的油、脂类和/或脂肪酸及它们的用途。最后，本发明也涉及转基因植物，其已经通过本发明的方法产生或其包含本发明的重组核酸分子，并涉及其作为食品或饲料的用途。脂类合成可以分成两部分脂肪酸的合成和它们与sn-甘油-3-磷酸的结合，和极性首基的加入或者修饰。用于膜的有用的脂类包括磷脂、糖脂、鞘脂和磷酸甘油酯。脂肪酸合成以乙酰辅酶羧化酶A催化的乙酰辅酶基-ACP的转化开始。缩合反应后，这两种产物分子一起形成乙酰乙酰基-ACP，其通过一系列缩合、还原和脱水反应转化，从而得到具有所需要的链长的饱和的脂肪酸分子。特定去饱和酶通过分子氧有氧或者无氧地催化从这些分子产生不饱和脂肪酸(关于微生物中脂肪酸合成，见F.C.Neidhardt等人(1996)E.coliandSalmonella.ASMPress:Washington,D.C.，p.612-636和其中引用的参考文献；Lengder等人(Ed.)(1999)BiologyofProcaryotes.Thieme:Stuttgart,NewYork,和其中引用的参考文献，和Magnuson，K.，等人(1993)MicrobiologicalReviews57:522-542和其中引用的参考文献)。为了经历进一步延长步骤，所得磷脂结合的脂肪酸必须返回到脂肪酸CoA酯库。这通过酰基辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶变成可能。而且，这些酶能够将延长的脂肪酸从辅酶A酯转移回到磷脂。如果合适，该反应顺序可以重复进行。此外，脂肪酸必须随后转运到多种修饰位点并掺入三酰甘油贮藏脂类。脂类合成中另一重要的步骤是例如，通过甘油脂肪酸酰基转移酶将脂肪酸转移到极性首基(见Frentzen，1998，Lipid,100(4-5):161-166)。植物中脂肪酸的生物合成、去饱和、脂类代谢和脂类化合物的膜转运、P氧化、脂肪酸和辅因子的修饰和三酰甘油的贮藏和装配的综述，包括其参考文献，由如下给出Kinney，1997,GeneticEngineering,Ed.:JKSetlow，19:149-166;Ohlrogge和Browse,1995，PlantCell7:957-970;Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Vodker，1996，GeneticEngineering,Ed.:JKSetlow，18:111-13'，Gerhardt，1992，Prog.LipidR.31:397-417;Giihnemann-Sch3fer&Kindl,1995,Biochim.BiophysActa1256:181-186;Kunau等人，1995，Prog.LipidRes.34:267-342;Stymne等人，1993，in:BiochemistryandMolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants,Eds.:MurataandSomerville，Rockville，AmericanSocietyofPlantPhysiologists,150-158，Murphy&Ross1998，PlantJournal.13(1):1-16。根据去饱和作用的类型，可以将多不饱和脂肪酸的两大类，co6和co3脂肪酸区别开，所述co6和co3脂肪酸在它们的代谢和它们的功能上不同。在下面的文本中，将多不饱和脂肪酸称作PUFA、PUFAs、LCPUFA或者LCPUFAs(多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids)，PUFA，长链多不饱和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacids)，LCPUFA)。脂肪酸亚油酸(18:2A9，12)充当co6代谢途径的原料，而co3途径通过亚麻酸(18:3A9，12，15)进行。亚麻酸由亚油酸通过co3-去饱和酶活性形成(Tocher等人(1998)Prog.LipidRes.37:73-117;Domergue等人(2002)Eur.J.Biochem.269:4105-4113)。哺乳动物，从而人，没有对应的去饱和酶活性012-和o3-去饱和酶)用于形成所述原料并且必须通过食物摄入这些脂肪酸(必需脂肪酸)。以这些前体开始，生理上重要的多不饱和的脂肪酸花生四烯酸(-ARA，20:4A5，8，"，")、一种co6-脂肪酸和两种co3-脂肪酸二十碳五烯酸(=EPA，20:5A5'8，n，"，")和二十二碳六烯酸(DHA，22#4，7，1()，13，17，19)通过去饱和酶和延伸酶反应顺序合成。通过延伸酶脂肪酸延伸2个或4个碳原子分别对C加-和C22-PUFAs的产生起至关重要的作用。该方法通过4个步骤来进行。第一步是丙二酰单酰辅酶A通过酮脂酰辅酶A合酶(KCS，下文中称作延伸酶)缩合到脂肪酸酰基辅酶A上。接着是还原步骤(酮脂酰辅酶A还原酶，KCR)、脱水步骤(脱水酶)和最后的还原步骤(烯酰辅酶A还原酶)。已经假定延伸酶活性影响整个过程的特异性和速率(Millar和Kunst(l卯7)PlantJournal12:121-131)。脂肪酸和三酰甘油酯在食品工业、动物营养、化妆品和药物领域具有大量的应用。根据它们是游离的饱和或不饱和脂肪酸还是其它具有升高含量饱和或不饱和脂肪酸的三酰甘油酯，它们适合于非常不同的应用。因此，例如，人类营养中优选具有不饱和脂肪酸，尤其具有多不饱和脂肪酸的脂类。多不饱和co3-脂肪酸应该对血液中的胆固醇水平具有积极作用，并因此对心脏病的预防有积极作用。通过向食物中加入这些w3-脂肪酸可以显著降低心脏病、中风或高血压的风险(Shimikawa(2001)WorldRev.Nutr.Diet.88:100-108)。co3-脂肪酸对与免疫学疾病有关的炎症过程，特别对慢性炎症过程，如对类风湿性关节炎具有积极作用(Calder2002，Proc.Nutr.Soc.61，345-358;CIelandandJames2000，J.Rheumatol.27，2305-2307)。因此将它们加入食品，特别加入々欠食食品，或者用于药物中。c)6-脂肪酸，如花生四烯酸倾向于对这些风湿性疾病有消极作用。co3-和co6-脂肪酸是称作类二十烷酸的组织激素(如前列腺素)的前体，所述组织激素衍生自二高-，亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，co3-和to6-脂肪酸也是血栓烷和白三烯的前体，血栓烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。从co6-脂肪酸形成的类二十烷酸(称作PG2系列)通常促进炎症反应，而来自co3-脂肪酸的类二十烷酸(称作PG3系列)有很小或者没有促炎效果。多不饱和的长链0>3-脂肪酸如二十碳五烯酸(=EPA，C20:5A5，s，"，"，")或者二十二碳六烯酸(=DHA，〔22:6"，7，1()，13，16，19)由于它们在健康方面的多种作用而是人类营养的重要组分，所述作用包括儿童脑的发育、眼的功能性、激素和其他信号物质的合成，和心血管疾病、癌症和糖尿病的预防(Poulos，A(1995)Lipids30:1-14;Horrocks，LA和YeoYK(1999)PharmacolRes40:211-225)。由于当前人类食物的组成，向食物中加入多不饱和co3脂肪酸是尤其重要的，所述多不饱和(o3脂肪酸优先在鱼油中发现。从而，例如，将多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(-DHA，C22:6A4，7，1。，13，16，19)或者二十碳五烯酸(=EPA，C20:5AS，s，"，"，")加入嬰儿配方中以提高营养价值。因此，需要生产多不饱和的长链脂肪酸。多种脂肪酸和甘油三酯主要从微生物如被孢霉属(Mortierella)或者Schizochytrium或者从产油植物,如大豆、油菜(oilseedrape)、藻类,如隐甲藻属(Crypthecodinium)或褐指藻属(Phaeodactylum)和其它生物中获得，通常以它们的三酰甘油酯(=甘油三酯=三甘油)的形式得到。然而，它们还可以从动物，例如从鱼得到。有利地通过水解甘油三酯制备游离脂肪酸。然而，极长链多不饱和脂肪酸如DHA、EPA、花生四烯酸(ARA，C2o:4A5，8，"，")、二高个亚麻酸(DHGL，C20:3A8，"，")或者二十二碳五烯酸(DPA，C22:5A，"，"，")不在油料作物如油菜、大豆、向日葵和红花中合成。这些脂肪酸的常规天然来源为鱼，如绅鱼、鲑鱼、沙丁鱼、雄鲑、鳗鲡、鲤鱼、鳟鱼、大比目鱼、鲭鱼、梭妒或金枪鱼或藻类。由于它们的积极特征，过去已经尝试利用涉及这些脂肪酸或者甘油三酯的合成的基因在多种生物中产生改变含量的不饱和脂肪酸。从而，WO91/13972和其美国同族专利描述了A9-去饱和酶。WO93/11245要求保护A15去饱和酶，WO94/11516要求保护A12去饱和酶。其他去饱和酶在例如EP—A—0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、衡95/18222、EP-A—0794250、Stukey等人(19卯)J.Biol.Chem"265:20144—20149、Wada等人(1990)Nature347:200—203或Huang等人(1999)Lipids34:649-659中描述。然而，多种去饱和酶的生物化学表征迄今还不充分，因为这些酶是膜结合的蛋白质，对它们的分离和表征造成了巨大困难(McKeon等人(1981)MethodsinEnzymol.71:12141-12147，Wang等人(1988)PlantPhysiol.Biochem.，26:777—792)。通常，通过导入合适的生物并随后通过分析起始材料和产物而分析酶活性来表征膜结合的去饱和酶。A"去饱和酶在WO93/06712、US5,614,393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111中描述。该酶在转基因生物中生产脂肪酸的应用描述于WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。多种去饱和酶的表达和多不饱和脂肪酸的形成也在WO99/64616或者WO98/46776中描述和要求保护。关于去饱和酶的表达效力和它对多不饱和脂肪酸形成的影响，必须注意到迄今描述的一种去饱和酶的表达仅仅导致低含量的不饱和脂肪^/脂类，如，亚麻酸和十八碳四烯酸。在过去已经进行了许多尝试以期得到延伸酶基因。Millar和Kunst，1997(PlantJournal12:121-131)和Millar等人，1999(PlantCell11:825-838)描述了植物延伸酶的表征，所述延伸酶用于在植物中合成单不饱和的长链脂肪酸(C22:l)和合成极长链脂肪酸以形成蜡(<:28-<:32)。花生四烯酸和EPA的合成描述于例如WO01/59128、WO00/12720、WO02/077213和WO02/08401中。多不饱和C24-脂肪酸的合成描述于例如Tvrdik等人2000，J.CellBiol.149:707-718或WO02/44320中。用于产生PUFA的特别适宜的是^t藻，如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、Porphiridium某些种、破囊壶菌属(Thraustochytri腿)某些种、Schizochytrium种或隐甲藻属某些种、纤毛虫例如棘尾虫属(Stylonychia)或豆形虫属(Colpidium)、真菌如被孢霉、虫霉菌属(Entomophthora)或毛霉属(Mucor)和/或藓类如剑叶藓属(Physcomitrella)、角齿藓属(Ceratodon)和地钱属(Marchantia)(R.Vazhappilly和F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani和K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M.Akimoto等，(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。菌抹选择已经导致开发了所述微生物的许多突变林，它们产生一系列所希望的化合物，包括PUFA。然而，改良产生特定分子如多不饱和脂肪酸的林系的突变和选择是费时且困难的方法。此外，借助上述微生物，仅可以产生有限量的所希望的多不饱和脂肪酸，如DPA、EPA或者ARA;而且，它们通常作为脂肪酸混合物得到。这是为什么一旦可能就优选重组方法的原因。高等植物包含多不饱和脂肪酸如亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。ARA、EPA和DHA在高等植物的种子油中根本没有发现或者以仅仅以极小量存在(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryoftheVegetableOilsj。然而，在高等植物，优选在油料作物如油菜(oilseedrape)、亚麻子、向日葵和大豆中产生LCPUFA将是有利的，因为食品工业、动物营养和制药目的所需的较大量的高质量LCPUFA可以经济地得到。为此，有利地是通过重组方法向油料种子中导入编码LCPUFA生物合成的酶的基因并在其中表达它们。这些基因编码例如，A6去饱和酶、A6延伸酶、A5去饱和酶、或A4去饱和酶。这些基因可以有利地从产生LCPUFA并将它们掺入膜或者三酰甘油酯的微生物和低等植物分离。从而，因此已有可能从藓类植物展叶剑叶藓(Physcomitrdlapatens)中分离A6去饱和酶基因并且从展叶剑叶藓和秀丽线虫(C.elegans)中分离A6延伸酶基因。例如在DE-A-10219203(在植物中产生多不饱和脂肪酸的方法)中已描述了转基因植物，其包含并表达编码LCPUFA生物合成酶的基因并且因而产生LCPUFAs。然而，这些植物以需要进一步优化的量产生LCPUFAs，所述优化用于处理植物中存在的油。因此，在每种情况下基于植物的总脂类含量，DE-A-10219203中描述的植物中的ARA含量仅有0.4至2%,并且EPA含量仅有0.5至1%。为了使利用多不饱和长链脂肪酸强化食物和饲料变成可能，因此非常需要简单廉价的方法用于尤其是在植物系统中产生多不饱和长链脂肪酸。本发明的一个目标因此是提供方法，利用所述方法可以在转基因植物中大量并廉价地产生长链多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。现在已惊奇地发现可以通过在转基因植物中表达优化的A5-延伸酶序列来增加长链多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的产量。由本发明方法产生的PUFAs包含高等动物不能合成因此必须消耗的或者高等动物不能够产生足够量并因此必须消耗其额外量的一组分子，虽然它们可以通过其它生物如细菌轻易地合成。因此，通过本发明方法在转基因植物中产生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸来实现本发明目标，包含在植物中提供至少一种核酸序列，其编码具有A6-去饱和酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A6-延伸酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽；和至少一种核酸序列，其编码具有A5-延伸酶活性的多肽，中的核酸序列相比较受到修饰，因为它适应于一种或更多植物种中的密码子选择。为了产生DHA，额外需要提供至少一种核酸序列，其在植物中编码具有A4-去饱和酶活性的多肽。"植物中提供"在本发明上下文中指采取措施使得编码具有A6-去饱和酶活性的多肽、具有A6-延伸酶活性的多肽、具有A5-去饱和酶活性的多肽和具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列共同存在于一个植物中。"植物中提供"因此包含通过用包含所述核酸序列的一种或更多重组核酸分子进行植物转化和通过包含一种或更多所述核酸序列的合适的亲本植株杂交将核^列引入植物中。根据本发明，编码具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列与所述序列来源的生物中的核^列相比较受到修饰，因为它适应于一种或更多植物种中的密码子选择。这表示为了本发明目的，已经将所述核酸序列进行了特异优化，但是不由此改变该核酸序列编码的氨基酸序列。遗传密码是冗余的，因为它使用61种密码子来定义20种氨基酸。因此，大部分的20种蛋白质生成氨基酸因此由多个三联体(密码子)编码。然而在特定生物中不以相同频率使用定义单个氨基酸的同义密码子；相反地是经常使用的优选密码子，和很少使用的密码子。密码子选择上的这些不同归因于选择性进化压力和尤其是翻译效率。很少出现的密码子的翻译效率较低的一个原因可能是相应的氨酰tRNA库耗尽了并因此不再可被用于蛋白质合成。此外，不同的生物优选不同的密码子。为此，例如，来自哺乳动物细胞的重组DNA的表达经常在大肠杆菌(E.coli)细胞中次优地进行。因此在某些情况下用经常使用的密码子代替很少使用的密码子来提高表达是可能的。不希望被一种理论束繂，假设密码子优化的DNA序列使更有效的翻译变成可能，并且由此形成的mRNAs可能在细胞中具有更长的半衰期并因此可以更经常地用于翻译。由上面已经叙述的，可以得到只有当生物(其中将表达核酸序列)不同于该核酸序列最初来源的生物时，密码子优化才是必需的。对于相对大量基因的DNA序列已知的许多生物，可以从表中获得各生物中特定密码子的使用频率。在这些表的帮助下以相对高的准确度将蛋白质序列回译成DNA序列是可能的，所述DNA序列包含在各生物中对于蛋白质的多种氨基酸优选的密码子。尤其在以下互联网地址中可以找到密码子选择表http:〃www.kazusa.or.ip/Kodon/E.html。此外，多个公司提供了用于基因优化的软件，例如，Entelechon(SoftwareLeto)或Geneart(SoftwareGeneOptimizer)。特定生物中序列对密码子选择的适应可以在多种标准的帮助下进行。一方面，对特定氨基酸使用所选生物中最经常出现的密码子是可能的，但是另一方面，也考虑多种密码子的固有频率，使得将特定氨基酸的所有密码子根据它们的固有频率掺入到优化序列中。使用特定碱基三联体的位置的选择在这种情况下可以随机进行。根据本发明，考虑各个密码子的固有频率来调整DNA序列，使用在所选生物中最经常出现的密码子也是合适的。来自Ostreococcustauri的核酸序列(其编码具有A5-延伸酶活性的多肽，例如在SEQIDNo.110中描述的多肽)，特别优选至少适应油菜、大豆和/或亚麻中的密码子选择。最初来自Ostreococcustauri的核酸序列优选是在SEQIDNo.109中描述的序列。编码A5-延伸酶的DNA序列在至少20%的位置，优选至少30%的位置，特别优选至少40%的位置并最优选至少50%的位置被调整来适应油菜、大豆和/或亚麻中的密码子选择。使用的核酸序列最优选是在SEQIDNo.64中描述的序列。将理解本发明也包含那些密码子优化的DNA序列，其编码具有A5-延伸酶活性的多肽并且通过与野生型序列比较，它们的氨基酸序列在一个或更多位置上被修饰，但是其仍然具有与野生型蛋白质基本上相同的活性。编码具有A6-去饱和酶活性的多肽的核酸序列优选选自a)核,列，其具有SEQIDNo.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中描述的序列，优选具有SEQIDNo.1中描述的序列，b)核^^列，其编码SEQIDNo.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42中，优选SEQIDNo.2中指出的氨基#列，c)核酸序列，其与上面a)或b)指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.1中指出的核酸序列的互#卜链在严格条件下杂交，d)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其与SEQIDNo.1中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，优选至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或卯％，特别优选至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其编码氨基酸序列并且该氨基酸序列具有SEQIDNo.43、44、45、46、47、48、49或50中指出的至少一种，例如2、3、4、5、6、7或8种，优选所有的氨基酸模式。氨基酸模式是指短氨基酸序列，其优选包含少于50个，特别优选少于40个并尤其是10至40个，并甚至更优选10至30个氨基酸。对于本发明，同一性是优选在本发明核苷酸或氨基酸序列全长上确定的，例如对于SEQIDNO:64中指出的核酸序列，是在903个核苷酸全长上确定的。编码具有A6-延伸酶活性的多肽的核酸序列优选选自a)具有SEQIDNo.171、173、175、177、179、181或183中描述的序列，尤其具有SEQIDNo.171中描述的序列的核酸序列，b)核絲列，其编码SEQIDNo.172、174、176、178、180、182或184中指出的氨基*列，尤其编码SEQIDNo.172中指出的氨基断列，c)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.1中指出的核酸序列的互#卜链在严格条件下杂交，d)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其与SEQIDNo.171中指出的序列有至少60%、65%、70°/。、75%或80%，优选至少81%、82%、83%、84°/。、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特别优选至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97°/。、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其编码氨基酸序列并且该氨基酸序列具有SEQIDNo.185、186、187、188、189、l卯、191或192中指出的至少一种，例如2、3、4、5、6、7或8种，优选所有的氨基酸模式。编码具有A6-延伸酶活性的多肽的核酸序列尤其也是本发明密码子优化的序列，优选在SEQIDNO:122中描述的核酸序列中。编码具有A5-去饱和酶活性的多肽的核酸序列优选选自a)核酸序列，其具有在SEQIDNo.51、53或55中描述的序列，优选具有在SEQIDNo.51中描述的序列，b)核酸序列，其编码SEQIDNo,52、54或56中指出的氨基酸序列，优选编码SEQIDNo.52中指出的氨基*列，c)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.51中指出的核列的互补链在严格条件下杂交，d)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其与SEQIDNo.51中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，优选至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特别优选至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96°/。、97。/。、980/。或99%的同一性，和e)核酸序列，其编码氨基酸序列并且该氨基酸序列具有SEQIDNo.57、58、59、60、61、62或63中指出的至少一种，例如2、3、4、5、6或7种，优选所有的氨基酸模式。http:Vwww.ncbi.iilm.nih.gov中发现。在本方法进一步优选的实施方案中，此外将编码具有co-3-去饱和酶活性和/或A4-去饱和酶活性的多肽的一种或更多核^列引入植物中。编码具有o-3-去饱和酶活性的多肽的核酸序列优选选自a)具有SEQIDNo.193或195中描述的序列，优选SEQIDNo.193中描述的序列的核酸序列，b)核^列，其编码SEQIDNo.194中指出的氨基#列，c)核酸序列，其与SEQIDNo.193或195中描述的核酸序列的互补链在严格条件下杂交，和d)核酸序列，其与SEQIDNo.193或195中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，优选至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特别优选至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性。有利地用于本发明方法中的co-3-去饱和酶使co-6生物合成途径偏移到(0-3生物合成途径变为可能，导致Cis:2向C化3脂肪酸的偏移。C0-3-去饱和酶转化宽范围的磷脂，如磷脂酰胆碱(-PC)、磷脂酰肌醇(=PIS)或磷脂酰乙醇胺(=PE)是更有益的。最后，也可以在中性脂类(=NL)，即甘油三酯中发现去饱和作用产物。编码具有A4-去饱和酶活性的多肽的核酸序列优选选自a)具有SEQIDNo.77、79、81、83、85、87、89、91或93中描述的序列，优选具有SEQIDNo.77中描述的序列的核酸序列，b)核^列，其编码SEQIDNo.78、80、82、84、86、88、卯、92或94中指出的氨基^列，优选编码SEQIDNo.78中指出的氨基絲列，c)核酸序列，其与上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.77中指出的核酸序列的互补链在严格条件下杂交，d)核酸序列，其与SEQIDNo.77中指出的序列有至少60。/。、65%、70%、75%或80%,优选至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特别优选至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其编码氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQIDNo.95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或108中指出的至少一种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种，优选所有的氨基酸模式。有利地用于本发明方法中的A4-去饱和酶催化双键引入脂肪酸二十二碳五烯酸中，导致二十二碳六烯酸的形成。除了编码具有A6-去饱和酶活性、A6-延伸酶活性、A5-去饱和酶活性和A5-延伸酶活性的多肽的核,列，和适当时引入的并编码具有co-3-去饱和酶活性和/或A4-去饱和酶活性的多肽的核酸序列之外，本发明描述的方法额外地将编码脂肪酸或脂类代谢酶的其它核酸引入植物中是有益的。原则上使用脂肪酸或脂类代谢的所有基因与本发明方法中使用的核酸序列的组合是可能的；优选使用选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶的脂肪酸或脂类代谢的基因与A-6-延伸酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶和A-5-延伸酶，并且适当时与oj-3-去饱和酶和/或A-4-去饱和酶组合，使用单个基因或多种基因的组合是可能的。本发明方法中使用的核酸在营养组织(体细胞组织)中有利地表达。营养组织在本发明上下文中指通过有丝分裂繁殖的组织。该类型的组织也通过无性生殖(无融合生殖)和繁殖产生。繁殖是当个体数目以连续世代增长时使用的术语。通过无性繁殖产生的这些个体与它们的亲本基本上相同。此类组织的实例是叶、花、根、茎、地面上或下的纤旬枝(侧枝、匍匐茎)、根茎、芽、块茎如块根或块茎、鳞茎、繁殖体、繁殖芽、鳞茎或具鳞根出条。此类组织也可以通过假胎萌、真胎萌或由人类引起的胎萌产生。然而，通过无配子种子生殖产生的种子(如典型的紫菀科(Asteraceae)、禾本科(Poaceae)或蔷薇科(Rosaceae))也包括在有利地发生表达的营养组织中。本发明方法中使用的核酸在生殖组织(种系组织)中很小程度地表达或根本不表达。此类组织的实例是通过有性生殖，即减数细胞分裂产生的组织，例如通过有性过程产生的种子。很小程度指，与营养组织相比，RNA和/或蛋白质水平上测定的表达低于5%,有利地低于3%,特别有利地低于2%，最优选地低于l、0.5、0.25或0.125%。核酸序列特别优选地在转基因植物的叶中表达。这具有根据本发明产生的LCPUFAs可以被动物或人直接通过消化叶来吸收，并且不需要植物材料的前期加工的优势。实现。"组成型启动子"是使得可能在植物发育的基本阶段，优选整个植物发育过程中在多种组织，优选所有组织中表达的启动子。优选使用来自植物或来自植物病毒的启动子。CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录物的启动子(Franck等人(1980)Cell21:285-294)、19SCaMV启动子(US5,352,605)、来自稻的肌动蛋白启动子(McElroy等人(1990)PlantCell2:163-171)、豆球蛋白B启动子(GenBankAcc，No.X03677)、农杆菌胭脂碱合酶启动子、TR二元启动子、农杆菌章鱼碱合酶启动子、泛蛋白启动子(Holtorf等人(1995)PlantMol.Biol.29:637-649)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US5,683,439)、液泡ATP酶亚基的启动子、pEMU启动子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS启动子(Vdten等人(1984)EMBOJ.3(12):2723-2730)、来自玉米的组蛋白H3启动子(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285)、来自拟南芥的腈水解酶l基因启动子(GenBankAcc.No.U38846,核苷酸3862-5325)和来自小麦的富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO91/13991)，及介导组成型基因表达的其它启动子。特别优选CaMV35S转录物的启动子。成型启动子用于新方法是可能的。然而，额外或单独使用合成的启动子也是可能的。"叶特异性启动子"是在叶中显示高活性并在其它组织中没有活性或仅有低活性的启动子。"低活性"在本发明上下文中指在其它组织中活性低于在叶中活性的20%，优选低于IO%，特别优选低于5%且最优选j氐于3、2或1%。合适的叶特异性启动子的实例是核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基的启动子(Timko等人(1985)Nature318:579-582)和叶绿素a/b结合蛋白的启动子(Simpson等人(1985)EMBOJ.4:2723-2729)。技术人员知道其它的叶特异性启动子，或者他可以用已知的方法分离其它合适的启动子。因此，在分子生物学常规方法，例如杂交实验或DNA-蛋白质结合研究的帮助下，技术人员能够鉴定叶特异性调节核酸元件。这需要例如第一步从想要的生物(将从所述生物中分离调节序列)的叶组织中分离总的多聚(厶)+RNA，并建立cDNA文库。第二步，使用来自非叶组织的基于多聚(A广RNA分子的cDNA克隆，通过杂交来鉴定来自第一个文库的那些克隆，所述克隆对应的多聚(A户RNA分子只在叶组织中积累。随后，以该方式鉴定的这些cDNA用于分离具有叶特异性调节元件的启动子。技术人员此外可使用分离合适的叶特异性启动子的其它基于PCR的方法。当然，通过使用在胚和/或胚乳中有活性的种子特异性启动子，在转基因植物的种子中表达本发明的核列也是可能的。原则上种子特异性启动子可以从双子叶和单子叶植物中分离。优选的启动子在下文中列出USP(未知种子蛋白)和豌豆球蛋白(豌豆((Viciafaba)(Baumleinetal.(1991)Mol.GenGenet.225(3):459-467)、油菜籽蛋白(油菜)[US5,608,152、conlinin(亚麻子)[WO02/102970]、酰基载体蛋白(油菜)(US5，315，001和WO92/18634)、油质蛋白(拟南芥)[WO98/45461和WO93/20216、菜豆蛋白(菜豆)[US5,504,200、Bce4[WO91/13980、豆球蛋白B4(LegB4启动子)[Ba腿lein等，Plant丄，2，2，1992,Lpt2和lptl(大麦)[WO95/15389和W095/23230]、来自稻、玉米和小麦的种子特异性启动子[WO99/168901、Amy32b、Amy6-6和aleurain[US5，677，474j、Bce4(油菜)[US5,530,1491、大豆球蛋白(大豆)[EP571741、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870、ADR12-2(大豆)[WO98/08962、异柠檬酸裂合酶(油茱)[US5，689，040或a淀粉酶(大麦)EP781849。在本发明特别优选的实施方案中，所用的核酸序列，尤其是编码A5-延伸酶并通过适合于一种或更多植物种中的密码子选择与其序列来源的生物中的核酸序列比较受到修饰的核酸序列，优选在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖组织，尤其在种子中表达。种子中的特异性表达通过使用一种上面提及的种子特异性启动子，尤其是使用油菜籽蛋白启动子有利地进行。在该特别优选的实施方案中，产生的LCPUFAs的含量，尤其是C22脂肪酸的含量在种子油中以重量计占种子油含量的至少5。/。，有利地以重量计占至少6、7、8、9或10%，优选以重量计至少ll、12、13、14或15%，特别优选地以重量计至少16、17、18、19或20%，十分特别优选地以重量计至少25、30、35或40%。在有SEQIDNO:63中描述的核酸序列的进一步特别优选的实施方案中，种子油中C22脂肪酸的含量以重量计占种子油含量的至少8%。在本发明进一步特别优选的实施方案中，使用的核酸序列，尤其是编码A5-延伸酶并通过适应一种或更多植物种中的密码子选择与其序列来源的生物中的核酸序列比较受到修饰的核酸序列，优选在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖组织，尤其在种子中表达。种子中特异性表达通过使用一种上面提及的种子特异性启动子，尤其是使用油菜籽蛋白启动子有利地进行。在该特别优选的实施方案中，种子油中的二十二碳六烯酸的含量以重量计占种子油含量的至少1%，优选以重量计至少l.l、1.2、1.3、1.4或1.5%,特别优选以重量计至少1.6、1.7、1.8或1.9%,尤其以重量计至少2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9%，进一步优选以重量计至少3、3.5或4%。在有SEQIDNO:63描述的核酸序列的进一步特别优选的实施方案中，种子油中二十二碳六烯酸含量以重量计占种子油含量的至少1.9%。在这方面技术人员已知的是为了产生二十二碳六烯酸，需要额外一种或更多核酸序列，其編码具有A4-去饱和酶活性的多肽。编码具有A4-去饱和酶活性的多肽的核酸序列有利地选自具有SEQIDNo,77、79、81、83、85、87、89、91或93中描述的序列，优选具有SEQIDNo.77中描述的序列的核^列。在本发明进一步特别优选的实施方案中，使用的核酸序列，尤其是编码A5-延伸酶并通过适合于一种或更多植物种中的密码子选择，与其序列来源的生物中的核酸序列比较受到修饰的核酸序列，优选在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖组织，尤其在种子中表达。在种子中的特异性表达通过使用一种上面提及的种子特异性启动子，尤其是使用油菜籽蛋白启动子有利地进行。在该特别优选的实施方案中，种子油中的二十二碳六烯酸的含量以重量计是种子油含量的至少1%,优选以重量计至少l.l、1.2、1.3、1.4或1.5%，特别优选以重量计至少1.6、1.7、1.8或1.9%，尤其以重量计至少2、2.1、2.2、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9%，进一步优选以重量计至少3、3.5或4%。在该情况下，产生的LCPUFAs，尤其是C22脂肪酸的含量在种子油中以重量计是种子油含量的至少5%，以重量计有利地至少6、7、8、9或10%，以重量计优选至少ll、12、13、14或15%，以重量计特别优选地至少16、17、18、19或20%，以重量计十分特别优选地至少25、30、35或40%。在具有SEQIDNO:63中描述的核酸序列的进一步特别优选的实施方案中，种子油中二十二碳六烯酸的含量以重量计是种子油含量的至少1.9%，种子油中C22脂肪酸的含量以重量计是种子油含量的至少8。/。。植物基因表达也可以通过化学诱导型启动子来实现(见Gatz(1997)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Bio1.，48:89-108中的综述)。当期望基因表达以时间特异的方式发生的时候，化学诱导型启动子特别合适。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇诱导型启动子。响应生物或非生物胁迫条件的启动子也是合适的，例如，病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导型番茄hsp80启动子(US5,187,267)、冷诱导型马铃薯a-淀粉酶启动子(WO96/12814)或创伤诱导型pinll启动子(EP-A-0375091)。也特别合适的其它启动子是那些引起质粒特异性表达的启动子，因为质粒构成了区室，在其中合成脂类生物合成的前体和一些终产物。合适的启动子，如病毒RNA聚合酶启动子在WO95/16783和WO97/06250中有所描述，并且拟南芥clpP启动子在WO99/46394中有描述。将理解根据本发明产生的多不饱和脂肪酸不仅可以在完整转基因植物中产生，也可以在植物细胞培养物或在愈伤组织培养物(callouscultures)中产生。在本方法中产生的多不饱和脂肪酸有利地结合在磷脂和/或三酰甘油酯中，但是在生物中也可以作为游离脂肪酸出现或还可以结合成其它脂肪酸酯的形式。它们在该方面可以作为"纯产物，，存在，或还可以有利地以多种脂肪酸混合物的形式或不同磷脂如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰丝氨酸和/或三酰甘油酯、单酰基甘油酯和/或二酰基甘油酯的混合物的形式存在。本方法中产生的LCPUFAs、EPA、DPA和DHA有利地存在于磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺和/或三酰甘油酯中。三酰甘油酯此外也可以包含其它脂肪酸，如具有4到6个C原子的短链脂肪酸、具有8到12个C原子的中链脂肪酸或具有14到24个C原子的长链脂肪酸。它们优选包含长链脂肪酸，特别优选C2Q或Qt2脂肪酸。术语"甘油酯"可以理解为指用一个、两个或三个羧基基团酯化的甘油(甘油单、二或三酯)。"甘油酯"也可以理解为指多种甘油酯的混合物。甘油酯优选为甘油三酯。甘油酯或甘油酯混合物可以包含其它添加物，例如游离脂肪酸、抗氧化剂、蛋白质、碳水化合物、维生素和/或其它物质。对于根据本发明方法的目的，"甘油酯"因此理解为指来自甘油的衍生物。除了上面描述的脂肪酸甘油酯，还包括甘油磷脂和甘油糖脂。此处可以提及的优选实例是甘油磷脂，如卵磷脂(磷脂酰胆碱)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和烷基酰基甘油磷脂。对于本发明目的，磷脂将理解为指磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇。具有多不饱和dr、c2。-和/或<:22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以以油或脂类的形式分离，例如以化合物，如鞘脂、磷酸甘油酯、脂类、糖脂如糖鞘脂、磷脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯如乙酰辅酶A酯(其包含具有至少两个、三个或四个，优选四个、五个或六个双键的多不饱和脂肪酸)的形式分离从用于制备脂肪酸酯的植物分离；有利地是，它们以它们的二酰基甘油酯、三酰甘油酯的形式和/或以磷脂酰酯的形式，尤其优选地以三酰甘油酯、磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺的形式分离。除了这些酯，多不饱和脂肪酸也作为游离脂肪酸或结合在其它化合物中的形式存在于植物中。通常，多种上述化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)存在于生物中，其大概分布为以甘油三酯重量计为80到90%，以甘油二酯重量计为2到5%，以甘油一酯重量计为5到10%，以游离脂肪酸重量计为1到5%,以磷脂重量计为2到8%，总的多种化合物以重量计总计100%。在本发明方法中产生的LCPUFAs的含量基于转基因植物中总的脂肪酸以重量计至少4%,以重量计有利地至少5、6、7、8、9或10%，以重量计优选至少11、12、13、14或15%，以重量计特别优选至少16、17、18、19或20%,以重量计十分特别优选至少25、30、35或40%。本发明的方法中产生的脂肪酸EPA、DPA和/或DHA基于转基因植物中总的脂肪酸的含量在每一种情况下以重量计至少5%，每一种情况下以重量计优选至少6、7、8或9%，每一种情况下以重量计特别优选至少10、11或12%,每一种情况下以重量计最优选至少13、14、15、16、17、18、19或20%。脂肪酸有利地以结合形式产生。在本发明方法所用核酸的帮助下，将这些不饱和脂肪酸置于有利产生的三酰甘油酯的snl、sn2和/或sn3位置上是可能的。有利地是，至少11%的三酰甘油酯是被双取代的(指在snl和sn2或sn2和sn3位置上)。三取代的三酰甘油酯也是能检测到的。因为大量的反应步骤是从初始化合物亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)发生的，所述方法的终产物例如，花生四烯酸(ARA)或二十碳五烯酸(EPA)不以完全纯的产物产生；痕量或较大量的前体也总是存在于终产物中。例如，如果亚油酸和亚麻酸都存在于初始植物中，终产物如ARA或EPA和/或DPA和/或DHA也作为混合物存在。前体基于各自终产物的量，以重量计应有利地总计不高于20%，以重量计优选不高于15%，以重量计特别优选不如10%，以重量计十分特别优选不高于5%。有利地是，只有ARA或EPA和/或DPA和/或DHA以结合的或游离酸的形式在本发明方法中产生，作为转基因植物中的终产物。通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物在每种情况下基于100%并基于生物的总脂肪酸含量，有利地包含6到15%的棕榈酸，l到6%的硬脂酸，7-85%的油酸，0.5到8%的11-十八碳烯酸，0.1到1%的花生酸，7到25%的饱和脂肪酸，8到85%的单不饱和脂肪酸和60到85%的多不饱和脂肪酸。总脂肪酸含量中优选至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1%的花生四烯酸作为有益的多不饱和脂肪酸存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物中。通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物进一步有利地包含脂肪酸，所述脂肪酸选自脂肪酸芥酸(13-二十二碳烯酸)、苹婆酸(9，10-亚甲基十八碳-9-烯酸)、锦葵酸(8，9-亚甲基十七碳-8-烯酸)、大风子油酸(环戊蟑十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-环氧十八碳-9,ll-二烯酸)、斑鳩菊酸(9，10-环氧十八碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbicacid(反ll-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七締-8-炔酸)、cr印enyninicacid(9-十八烯-12-炔酸)、13，14-二氩oropheicacid、十八碳-13-烯-9，ll-二炔酸、伞形花子油酸(顺-6-十八烯酸)、9顺，12反-十八碳二烯酸、金盏花素酸(calendulicacid)(8反10反12顺-十八碳三烯酸)、梓戒酸(catalpicacid)(9反11反13顺-十八碳三烯酸)、桐酸(9顺11反13反-十八碳三烯酸)、jacaricacid(8顺10反12顺-十八碳三蹄酸)、石榴酸(9顺11反13顺-十八碳三烯酸)、麦饼树酸(9顺11反13反15顺-十八碳四烯酸)、皮诺敛酸(pinolenicacid)(全-顺-5，9，12-十八碳三烯酸)、laballenicacid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羟油酸)和/或革盖菌素酸(coriolicacid)(13-羟-9顺，11反-十八碳二烯酸)的脂肪酸。通常，上述脂肪酸只以痕量有利存在于通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物中，意思是基于总脂肪酸含量，它们的出现低于30%，优选低于25%、24°/。、23%、22%或21%，特别优选低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，十分特别优选低于4%、3%、2%或1%。在本发明进一步优选的形式中，基于总脂肪酸含量，这些上述脂肪酸的出现低于0.9%、0.8%、0.7%、0.6%或0.5%,特别优选低于0.4%、0.3%、0.2%、0.1%。基于总脂肪酸，由本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含低于0.1%和/或没有丁酸、胆固醇和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，18，21)。通过本发明方法中所用的核*列实现与非转基因植物相比，转基因植物中LCPUFAs产量增加至少50%，有利地至少80%，特别有利地至少100%，十分特别有利地至少150%是可能的。也可以通过上面描述的方法合成化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物。为此，以已知方式例如通过萃取、蒸馏、结晶、色谱或这些方法的组合来分离脂肪酸或脂肪酸组合物。这些化学纯的脂肪酸或脂肪酸组合物对于食品工业部门、化妆品部门和尤其是药理学工业部门中的应用是有益的。原则上，所有双子叶或单子叶的有用植物对本发明方法是合适的。有用植物指可为人和动物产生食物，产生其它消耗品、纤维和药物的植物，如谷类，例如玉米、水稻、小麦、大麦、小米、燕麦、黑麦、荞麦；如块茎，例如马铃薯、木薯、甘薯、薯蓣等等；如含糖植物，例如甘蔗或甜菜;如豆类，例如菜豆、豌豆、蚕豆等等；如油脂作物，例如大豆、油菜、向曰葵、红花、亚麻、camolina等等。有利的植物选自如下的植物科槭树科(Aceraceae)、称猴桃科(Actinidiaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、槟榔科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、美人蕉、科(Cannaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫,科(Cucurbitaceae)、薯蕷科(Dioscoreaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(E叩horbiaceae)、豆科(Fabaceae)、山毛榉科(Fagaceae)、醋栗科(Grossulariaceae)、胡杉匕科(Juglandaceae)、掉科(Lauraceae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、桑科(Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、木犀科(Oleaceae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、禾本科(Poaceae)、蓼科(Polygonaceae)、石榴科(Punicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、芸香科(Rutaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、痴科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)和败酱科(Valerianaceae)。可以提及的实例是下面的植物，其选自漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如阿月混子(Pistaciavera(阿月混子实))、芒果(Mangiferindica(芒果))或腰果(Anacardiumoccidentale(腰果))的属和种、菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如金盏花(Calendulaofficinalis(普通金盏花))、红花(Carthamustinctorius(红花))、矢车菊(Centaureacyanus(矢车菊))、菊苣(Cichoriumintybus(菊苣))、洋蓟(Cynarascolymus(朝鲜蓟))、向日葵(Helianthusannus(向曰葵))、莴苣(Lactucasativa)、铍叶莴苣(Lactucacrispa)、芋(Lactucaesculenta)、毒莴苣的某些种(LactucascariolaL.ssp.Sativa)、LactusscariolaL.var.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、莴苣romana亚种(Lactucasativasubsp.Romana)、Locustacommunis、莴苣缬草(Valerianalocusta(沙拉蔬菜))、香叶万寿菊(TagetesIucida)、万寿菊(Tageteserecta)或细叶万寿菊(Tagetestenuifolia)(法国金盏花)的属和种、伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如胡萝卜(Daucuscarota(胡萝卜))的属和种、桦木科如榛属(Corylus)例如欧洲榛(Corylusavellana)或榛子(Coryluscolurna(榛子))的属和种、紫草科如Borago，例如，如下的属和种Boragoofficinalis(琉璃苣)，十字花科如芸苔属(Brassica)、亚麻齐属(Camelina)、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)例:ft口欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青属某些种(Brassicarapassp.(油菜))、野生欧白芥(Sinapisarvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、Brassicajunceavar.juncea、铍叶芥菜(Brassicajunceavar.crispifolia)、大叶芥菜(Brassicajunceavar.foliosa)、黑齐(Brassicanigra)、Brassicasinapioides、亚麻齐(Camelinasativa)、芥菜(Melanosinapiscommunis(芥菜))、甘蓝(Brassicaoleracea(饲用甜菜))或拟南芥(Arabidopsisthaliana)的属和种、凤梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia(菠萝)例如菠萝(Ananacomosus)、Aimimsananas或Bromdiacomosa(菠萝)的属和种、番木瓜科如番木瓜属(Carica)例如番木瓜(Caricapapaya(番木瓜))的属和种、大麻科如大麻属(Cannabis)例如大麻(Cannabissativa(大麻))的属和种、旋花科i口番薯属(Ipomea)、^走花属(Convolvulus)例ft口甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoeapandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoeatiliacea、三裂叶薯(Ipomoeatriloba)或Convolvuluspanduratus(甜薯、番薯)的属和种、藜科如甜菜属(Betavulgaris)例如甜菜(Betavulgaris)、Betavulgarisvar*altissima、甜菜普通变种(Betavulgarisvar.vulgaris)、Betamaritima、甜菜宿根变种Betavulgarisvar.perennis、Betavulgarisvar.Conditiva或Betavulgarisvar.esculenta(甜菜)的属和种、葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如畀瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbitamixta)、西葫芦(Cucurbitapepo)或南瓜(Cucurbitamoschata(西葫芦))的属和种、胡颓子科如胡颓子属(Elaeagnus)例如油橄榄(Oleaeuropaea(橄榄))的属和种、杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如阔叶山月桂(Kalmialatifolia)、狭叶山月才圭(Kalmiaangustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽山月才圭(Kalmiapolifolia)、西洋山月才圭(Kalmiaoccidentalis)、Cistuschamaerhodendros或山月桂(Kahnialucida(山月才圭))的属和种、大戟科3口木薯属(Manihot)、Janipha、麻风树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如木薯(Manihotutilissima)、Janiphamanihot、Jatrophamanihot、Manihotaipil、甜木薯(Manihotdulcis)、Manihotmanihot、Manihotmelanobasis、木薯(Manihotesculenta(木薯))或荒麻(Ricimiscommunis(蓖麻))的属和种、豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属Phaseolus、大豆属(Soybean)例如豌豆(Pisumsativum)、饲料豌豆(Pisumarvense)、Pisumhumile(豌豆)、Albiziaberteriana、合欢(Albiziajulibrissin)、阔荚合欢(Albizialebbeck)、Acaciaberteriana、Acacialittoralis、Albiziaberteriana、Albizziaberteriana、Cathormionberteriana、Feuilleaberteriana、Ingafragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobiumberterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acaciajulibrissin、Acacianemu、Albizianemu、Feuilleeajulibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosaspedosa、Sericanrdajulibrissin、阔荚金合3欠(Acacialebbeck)、Acaciamacrophylla、大叶合欢(Albizialebbeck)、Feuilleealebbeck、大叶含羞草(Mimosalebbeck)、Mimosaspeciosa(金合欢)、紫苜精(Medicagosativa)、野苜蓿(Medicagofalcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)(紫花苜蓿)、大豆(Glycinemax)、镰扁豆(Dolichossoja)、宽叶蔓豆(Glycinegracilis),大豆(Glycinehispida)、大菜豆(Phaseolusmax)、Sojahispida或Sojamax(大豆)的属和种、栊牛儿苗科(Geraniaceae)如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如椰子(Cocosnucifera)、茶麋子天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)或椰子油(Oleumcocois(4耶子))的属和种、禾本科如甘蔗属(Saccharum)例如甘蔗(Saccharumofficinarum)的属和种、胡桃科如胡桃属(Juglans)、Wallia例如胡桃(Juglansregia)、Juglansailanthifolia、山核(Juglanssieboldiana)、灰核杉匕(Juglanscinerea)、Walliacinerea、Juglansbixbyi、力口州黑、核*匕(Juglanscalifornica)、印度黑核桃(Juglanshindsii)、Juglansintermedia,Juglansjamaicensis、大氺亥*匕(Juglansmajor)、Juglansmicrocarpa、黑核书^(Juglansnigra)或胡桃(Wallianigra)(胡桃)的属和种、樟科如lf梨属(Persea)、月才圭属(Laurus)例i口月才圭(Laurusnobilis(bay))、垮梨(Perseaamericana)、鲟梨油(Perseagratissima)或Perseapersea(avocado)的属和种、豆科如落花生属(Arachis)例如落花生(Arachishypogaea(花生))的属和种、亚麻牙牛如亚麻属(Linum)、AdenoUnum属例如亚麻(Lmumusitatissimum)、Linumhumile、奥地利亚麻(Linumaustriacum)、Linumbienne、窄叶亚麻(Linumangustifolium)、泻亚麻(Linumcatharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linumgrandiflorum)、Adenolin腿grandiflorum、刘易斯亚麻(Linumlewisii)、那旁亚麻(Linumnarbonense)、宿才艮亚麻(Linumperenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linumperennevar.lewisii)、Linumpratense或亚麻子(Linumtrigynum(亚麻子))的属和种、Lythrarieae吵口石才留属(Punica)例i口石榴(Punicagranatum(pomegranate))的属和种、锦葵科(Malvaceae)如棉属(Gossypium)例如陆地棉(Gossypiumhirsutum)、树棉(Gossypiumarboreum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、草冲帛(Gossypiumherbaceum)或瑟伯冲帛(Gossypiumthurberi(棉))的属和种、芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如香蕉(Musanana)、小果野蕉(Musaacuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉属的某些种(Musaspp.(banana))的属和种、柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia属、月见草属(Oenothera)例如月见草(Oenotherabieimis)或夜来香(Camissoniabrevipes(月见草))的属和种、棕榈科(Palmae)如油棕属(Elaeis)，例如以下的属和种油棕(Elaeisguineensis(油棕榈))、罂栗科(Papaveraceae)如罌粟属(Papaver)，例如以下的属和种东方罌粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、长荚罂栗(Papaverdubium(罂粟))、胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属(Sesamum)例如胡麻(Sesamumindicum(sesame))的属和种、胡#1科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如树胡椒(Piperaduneum)、Piperamalago、狭叶胡椒(Piperangustifolium)、大胡椒(Piperauritum)、萎叶(Piperbetel)、荜澄痴(Pipercubeba)、荜获(Piperlongum)、胡椒(Pipernigrum)、假荜拔(Piperretrofractum)、Artantheadunca、Artantheelongata、长胡椒(Peperomiaelongata)、Piperelongatum、Steffensiaelongata(cayennepepper)的属和种、禾本科(Poaceae)如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高梁属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea(maize))、小麦属(Triticum)例如大麦(Hordeumvulgare)、芒颖大麦草(Hordeumjubatum)、鼠大麦草(Hordeummurinum)、短芒大麦草(Hordeumsecalinum)、栽培二棱大麦(Hordeumdistichon)、Hordeumaegiceras、六歹U大麦(Hordeumhexastichon)、六棱大麦(Hordeumhexastich腿)、不规贝'J大麦(Hordeumirregulare)、大麦(Hordeumsativum)、#豆芒大麦草(Hordeumsecalinum)(大麦)、黑麦(Secalecereale(黑麦))、燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avenafatua)、地中海红燕麦(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida(燕麦))、二色高梁(Sorghumbicolor)、石茅高梁(Sorghumhalepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、高梁(Sorghumvulgare)、Andropogondrummondii、二色绒毛草(HoIcusbicolor)、Holcussorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghumarundinaceum、Sorgh腿caffromm、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、工艺高梁(Sorghumdochna)、Sorghumdrummondii、硬高粱草(Sorghumdurra)、Sorghumguineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草(Sorghumnervosum)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、Sorghumsubglabrescens、垂叶高梁草(Sorghumverticilliflorum)、高梁(Sorghumvulgare)、石茅高梁(Holcushalepensis)、Sorghummiliaceum、黍粟(Panicummilitaceum(millet))、稻(Oryzasativa)、Oryzalatifolia(稻)、玉米(Zeamays(maize))、小麦(Triticumaestiv腿)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticumhybermim、马卡小麦(Triticummacha)、普通小麦(Triticumsativum或Triticumvulgare)(小麦)、紫球藻科(Porphyridiaceae)如Chroothece属、Flintiella属、Petrovanella属、紫球藻属(Porphyridium)、Rhodella、Rhodosorus、Vanhoeffenia例3口紫5求藻(Porphyridiumcruentum)的属和种、山龙目艮科(Proteaceae)如澳洲坚果属(Macadamia)例如全缘叶澳洲坚果(Macadamiaintergrifolia(macadamia))的属和种，萏草科(Rubiaceae)如咖啡属(Coffea)例如咖啡属(Coffea)某些种、小果咖啡(Coffeaarabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffealiberica(coffee))、玄参科(Scrophulariaceae)如毛蕊花属(Verbascum)例如以下的属和种毛瓣毛蕊花(Verbascumblattaria)、东方毛遂花(Verbascumchaixii)、密叶毛,露花(Verbascumdensiflorum)、Verbascumlagurus、长叶毛,露花(Verbascumlongifolium)、Verbascumlychnitis、Verbascumnigrum、奥林匹克毛蔬花(Verbascumolympicum)、Verbascumphlomoides、紫毛，露花(Verbascumphoenicum)、Verbascumpulverulentum或毛，统花(Verbascumthapsus(mullein))、痴科(Solanaceae)如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如以下的属和种辣椒(Capsicumaimuum)、Capsicumaimuumvar.glabriusculum、五色椒(Capsicumfrutescens(pepper))、红椒(Capsicumannuum(paprika))、烟草(Nicotianatabacum)、花烟草(Nicotianaalata)、长头烟草(Nicotianaattenuata)、光烟草(Nicotianaglauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotianaobtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、Nicotianarepanda、黄花烟草(Nicotianarustica)、Nicotianasylvestris(烟草)、马铃薯(Solanumtuberosum(番痴))、痴(Solanummelongena(eggplant))、番痴(Lycopersiconesculentum)、Lycopersiconlycopersicum、梨形番痴(Lycopersiconpyriforme)、红痴(Solanumintegrifolium)或番茄(Solan腿lycopersicum)(番茄)、梧桐科(Sterculiaceae)力口可可树属(Theobroma)例i口可可树(Theobromacacao(可可))的属和种或山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如大叶茶(Camelliasinensis(茶))的属和种。在该方面的有利的实施方案中，使用的有用的植物是包含大量脂类化合物的油料植物，如花生、油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花(Carthamustinctoria)、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花、石榴、月见草、毛蕊花、大蓟、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲坚果、歸梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、阿月混子、琉璃苣、树(油棕榈树、椰子树或胡桃树)或作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉、木薯(cassava)、胡椒、万寿菊、茄科植物例如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属的种、豌豆、紫花苜蓿或灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属的种和多年生牧草及饲料作物。有利的植物根据本发明是油料植物如花生、油菜、芸苜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、金盏花、石榴、月见草、西葫,/南瓜、亚麻子、大豆、琉璃苣、树(油棕榈树、可可树)。尤其优选富含C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫芦/南瓜、罂栗、月见草、胡桃、亚麻子、大麻或大蓟。非常尤其优选红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃、亚麻子或大麻。在饲料或食品植物中表达本发明的核酸序列并因此增加叶子中二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的含量也是有利的。优选的饲料植物是，例如，三叶草种如红三叶草(Trifoliumpratense)、白三叶草(Trifolium)、瑞士三叶草(Trifoliumhybridum)、驴食草(Onobrychisviccifolia)、埃及三叶草(Trifolhimalexandrinium)和波斯三叶草(Trifoliumresupinatum)。优选的食用植物是例如莴苣种，如莴苣(Lactucasativa)、铍叶萬苣(Lactucacrispa)、芋(Lactucaesculenta)、毒莴苣的某些种(LactucascariolaLssp.Sativa)、LactucascariolaLvar.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、莴苣romana亚种、Locustacommunis和莴苣缬草(Valerianalocusta)。通过核酸序列的酶活性在本发明方法中产生多种多不饱和脂肪酸是可能的，所述核酸序列为本发明方法所用并编码具有A-6-延伸酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶和/或A-5-延伸酶活性的多肽的核酸序列，有利地与编码具有co-3-去饱和酶和/或A-4-去饱和酶活性的多肽的核酸序列，及编码脂肪酸或脂类代谢的多肽(如具有A-5-、A-6-、A-8-、A-12-去饱和酶或A-5-、A-6-或A-9-延伸酶活性的其它多肽)的其它核酸序列组合。根据所选用于本发明方法的有用植物，多种多不饱和脂肪酸的混合物或单个多不饱和脂肪酸如EPA、DPA或DHA可以以游离或结合形式产生。根据初始植物中的优势脂肪酸组成(C18:2或C18:3脂肪酸)，得到的脂肪酸来自C18:2月旨肪酸，如GLA、DGLA或ARA或来自C18:3脂肪酸，如EPA、DPA或DHA。如果存在于植物中用于本方法的唯一不饱和脂肪酸是亚油酸(LA，C18:2A9，12)，那么所述方法的唯一可能产物是GLA、DGLA和ARA，其可以以游离脂肪酸或结合脂肪酸存在。如果本方法中使用的植物中存在的唯一不饱和脂肪酸是a-亚麻酸(ALA,C18:3A9，12，1S)(例如在亚麻中)，那么所述方法的唯一可能产物是SDA、ETA、EPA、DPA和/或DHA,其可以如上述以游离脂肪酸或结合脂肪酸存在。通过改变本方法中所用的并参与A-6-延伸酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶和/或A-6-延伸酶合成的酶的活性，有利地与脂类或脂肪酸代谢的其它基因的组合来以定向方式在植物中产生唯一个别产物是可能的。有利地是，只合成EPA、DPA或DHA或其混合物。因为脂肪酸在生物合成链中合成，各自的终产物不作为纯的物质存在于生物中。少量的前体化合物总是也存在于终产物中。这些少量基于终产物EPA、DPA或DHA或其混合物，以重量计低于20%，以重量计有利地低于15%,以重量计特别有利地低于100/。，以重量计十分特别有利地低于5、4、3、2或1%。为了增加本发明方法中产生具有多不饱和脂肪酸(其含量有利地增加了)的油和/或甘油三酯的产量，增加用于合成脂肪酸的初始产物的量是有益的。这例如可以通过将编码具有A12-去饱和酶的多肽的核酸引入生物中来实现。这在有用的植物中特别有益，如产油植物如十字花科(Brassicaceae)的植物，如芸苔属(Brassica),例如油菜；胡颓子科如胡颓子属，例如油橄榄的属和种或豆科如大豆属，例如具有高的油酸的大豆的属和种。因为这些生物具有仅有的低亚油酸含量(Mikoklajczak等人(1961)JournaloftheAmericanOilChemicalSociety38:678画681)，使用所述A1L去饱和酶从油酸产生原料亚麻酸是有益的。此外从外界提供初始脂肪酸也是可能的，但是因为费用的原因较不优选该方法。藓类和藻类是已知产生大量多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的唯一的植物系统。藓类在膜脂中包含PUFAs，然而藻类，与藻类相关的生物和一些真菌在三酰基甘油部分中也积累大量的PUFAs。从也在三酰基甘油部分中积累PUFAs的菌林中分离的核酸分子因此对本发明方法特别有益，并因此对改变植物中的脂类和PUFA产生体系特别有益，所述植物如有用的植物如油料作物植物，例如油菜、卡诺拉油菜、亚麻、大麻、大豆、向日葵、琉璃苣。它们因此可以有利地用于本发明方法。本发明方法中所用的核酸有利地来自植物如藻类，例如草绿藻科的藻类i口异毛藻属(Heteromastix)、Mammella、Mantoniella、孩i单藻属(Micromonas)、肾藻属、Ostreococcus、绿枝藻属(Prasinocladus)、Prasinococcus、Pseudoscourfielda、Pycnococcus、塔胞藻属(Pyramimonas)、Scherffelia、扁藻属例如Heteromastixlongiflllis、Mamiellagilva、Mantoniellasquamata、Micromonaspusilla、绿肾藻(Nephroselmisolivacea)、Nephroselmispyriformis、圆形肾藻(Nephroselmisrotunda)、Ostreococcustauri、Ostreococcussp,、Prasinocladusascus、Prasinocladuslubricus、Pycnococcusprovasolii、Pyramimonasamylifera、Pyramimonasdisomata、Pyramimonasobovata、Pyramimonasorientalis、Pyramimonasparkeae、Pyramimonasspinifera、Pyramimonassp.、Tetraselmisapiculata、Tetraselmiscarteriaformis、周氏扁藻(Tetraselmischui)、铍叶扁藻(Tetraselmisconvolutae)、Tetraselmisdesikacharyi、纤细扁藻(Tetraselmisgracilis)、Tetraselmishazeni、Tetraselmisimpellucida、Tetraselmisinconspicua、Tetraselmislevis、有斑扁藻(Tetraselmismaculata)、Tetraselmismarina、Tetraselmisstriata、Tetraselmissubcordiformis、Tetraselmissuecica、Tetraselmistetrabrachia、Tetraselmistetrathele、Tetraselmisverrucosa、Tetraselmisverrucosafo.Rubens或Tetraselmissp.的属和种或选自棵藻科的藻类如嚢胞藻属(Ascogkna)、变胞藻属(Astasia)、胶柄藻属、Cyclidiopsis、棵藻属、拟棵藻属(Euglenopsis)、Hyalophacus、克氏藻属(Khawkinea)、鳞孔藻属、扁棵藻属、陀螺藻属(Strombomonas)或囊棵藻属例如梭形棵藻(Euglenaacus)、膝曲棵藻(Euglenageniculata)、细小棵藻、Euglenamixocylindracea、味状棵藻(Euglenarostrifera)、绿色棵藻(Euglenaviridis)、Colaciumstentorium、圆柱嚢棵藻(Trachelomonascylindrica)或旋转嚢棵藻(Trachelomonasvolvocina)的属和种。其他有利的植物是藻类如等鞭金藻属(Isochrysis)或隐曱藻属、藻类/硅藻如海链藻属或褐指藻属、藓类如剑叶藓属或角齿藓属、或者高等植物如报春花科(Primulaceae)例如AIeuritia、Calendulastdlata、刺状骨籽菊(Osteospermumspinescens)或Osteospermumhyoseroides、微生物如真菌例如曲霉属(Aspergillus)、破嚢壶菌属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或被孢霉属，细菌如希瓦氏菌，酵母或动物如线虫例如隐杆线虫、昆虫、蛙、海参或鱼。本发明经分离的核酸序列有利地源自脊推动物目的动物。所述核酸序列优选地源自下面的纲脊推动物纲；Euteleostomi,辐鳍鱼纲(Actinopterygii);新鳍鱼亚纲(Neopterygii);硬骨鱼类(Teleostei);Euteleostei、原鳍鱼总目(Protacanthopterygii)、鲑形目(Salmoniformes);鲑科(Salmonidae)或大马p合鱼属(Oncorhynchus)或脊推动物(Vertebrata)、两栖纲(Amphibia)、无尾两栖目(Anura)、负子蟾科(Pipidae)、非洲爪蟾属或无脊推动物(Evertebrata)例如原索动物门(Protochordata)、被嚢亚门(Tunicata)、海参纟冈(Holothuroidea)、海l^科(Cionidae)侈寸3口Amarouciumconstellatum、Botryllusschlosseri、玻璃海革肖、Molgulacitrina、Molgulamanhattensis、Perophoraviridis或Styelapartita。戶斤述核酸尤其有禾'J地源自真菌、动物、或源自植物如藻类或藓类，优选地源自鲑形目如鲑科，如鲑属，例如来自虹鳟、Truttatrutta或亚东鲑(Salmotruttafario)的属和种，源自藻类如Mantoniella或Ostreococcus，或源自珪藻如海链藻属或褐指藻属或者源自藻类如隐曱藻属。在优选实施方案中，该方法还包括得到细胞或者全植物的步骤，所述细胞或者全植物包含用于所述方法中的核酸序列，其编码A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和/或A-5-延伸酶的核酸序列，和适当时编码①-3-去饱和酶和/或A-4-去饱和酶的核酸序列，其中所述细胞和/或有用的植物还可以包含脂类或者脂肪酸代谢的其他核酸序列。优选用于该方法的这些核酸序列有利地单独或者与编码脂肪酸或者脂类代谢蛋白质的其他核酸序列组合掺入到至少一种基因构建体和/或载体中用于表达，并且最后转化到细胞或者植物中。在另一优选实施方案中，所述方法还包括从有用的植物得到油、脂类或者游离脂肪酸的步骤。以这种方式产生的细胞或者以这种方式产生的有用植物有利地是产油植物、蔬菜植物、莴苣植物或观赏植物的细胞，或者植物自身，如上文解释。生长指植物细胞、组织或器官在培养基上或在培养基中的培养，或者整株植物在基质中或在基质上，例如在培养液、花盆土中或在耕地上的培养。对于本发明目的，"转基因的，，或"重组的"指关于例如含有本发明方法中使用的核酸序列的核酸序列、表达盒(=基因构建体)或载体，或用本发明方法中使用的核酸序列、表达盒或载体转化的植物，所有那些构建通过重组方法产生，其中a)所述核酸序列，或b)与所述核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或c)(a)和(b)中的任何一个都不定位在它们自然遗传环境中或已通过重组方法被改变，改变可能是例如一个或更多核苷酸残基的替代、添加、缺失、倒位或插入。自然遗传环境指基源生物中的天然基因组或染色体位点或基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，优选至少部分保持核酸序列的自然遗传环境。所述环境至少在一面侧翼包围核酸序列并具有至少50bp,优选至少500bp，特别优选至少1000bp，十分特别优选至少5000bp的序列长度。当如下表达盒通过非天然、合成("人工的，，)方法，例如诱变处理被改变时，天然存在的表达盒-例如本发明方法中使用的核酸序列的天然启动子与编码蛋白质(所述蛋白质具有相应的A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和A5-延伸酶活性)的核酸序列的天然存在的组合，有利地与编码具有w3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶活性的蛋白质的核酸序列组合，成为转基因表达盒。例如在US5,565,350或WO00/15815中描述了合适的方法。如上述，用于本发明目的的转基因植物意指方法中所用的核酸不处于它们在所述植物的基因组中的天然位点处，对这类核酸而言可同源或异源性地表达。然而如上述，转基因也意指即便本发明的核酸处于植物基因组中它们的天然位置上，这种序列相对于天然序列已经过了修饰，和/或天然序列的调节序列已经过了修饰。转基因优选指本发明方法中使用的核酸在基因组内非天然位点处的表达，即发生了这种核酸的同源表达，或优选地异源表达。优选的转基因生物是有用的植物，如产油植物、蔬菜植物、生菜植物或观赏植物，它们都有利地选自植物科，其选自下面的科槭树科(Aceraceae)、称猴杉匕科(Actinidiaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、槟榔科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、槟榔科、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、美人蕉科(Cannaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫，科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、山毛榉科(Fagaceae)、醋栗科(Grossulariaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、桑科(Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、木犀科(Oleaceae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、禾本科(Poaceae)、蓼科(Polygonaceae)、石榴科(Punicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、芸香科(Rutaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、痴科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)和败普科(Valerianaceae)。用于本发明方法的核酸、表达盒或者载体的合适的宿主植物原则上并且有利地是能够合成脂肪酸、特别是不饱和脂肪酸，或者适于表达重组基因的任何有用的植物。可以提到的实例是植物如拟南芥属、菊科，如金盏花属，或者有用的植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉、亚麻、油籽油菜、椰子、油椰、红花或可可豆。其他有利的植物在本申请的别处列出。^t生物通常用作产生转基因有用植物的中间宿主。此类可利用的中间宿主在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(19卯)中有详细叙述。可以有利地用于该目的的表达菌林是例如那些具有较低蛋白酶活性的菌林。例如在Gottesman,S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)119-128中描述了它们。包含本发明方法合成的多不饱和、长链脂肪酸的转基因植物可以有利地直接出售，不需要分离合成的油、脂类或脂肪酸。该形式的出售特别有利。对于本发明目的，"植物"是完整的植物和所有植物部分、植物器官或植物部分如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获的材料、植物组织、生殖组织和来自实际转基因植物和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。在该上下文中，所述种子包含种子的所有部分，如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚组织。然而，本发明方法中产生的化合物也可以以它们油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸的形式从植物中分离。可以通过从它们生长的培养物或田地中收获植物或植物细胞来获得本发明方法产生的多不饱和脂肪酸。这可以通过压榨或提取植物部分，优选植物种子来进行。在该文中通过所谓的冷拔或冷压在无热输入的情况下获得油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸是可能的。为了使打开植物部分，尤其是种子更容易些，先将它们压碎、蒸汽处理或烘烤。然后可以用溶剂如加热的己烷来压榨或提取以该方式预处理的种子。然后再次除去所述溶剂。以该方式分离高于96%的本发明方法产生的化合物是可能的。然后进一步处理以该方式获得的产物，即精炼。这使得一开始就除去例如植物黏液和悬浮物。所谓的脱泥可以经酶促发生或例如，通过加入酸如磷酸化学/物理地发生。然后通过用碱，例如氬氧化钠溶液处理除去游离脂肪酸。用水彻底清洗得到的产物来去除残留在产物中的碱，并将其千燥。为了去除仍然存在于产物中的着色物质，可以用例如漂白土或活性炭来漂白产物。最后，也例如用蒸汽将产物除臭。通过该方法产生的PUFAs或LCPUFAs优选为C加和/或<:22脂肪酸分子，所述分子在脂肪酸分子中具有至少4个双键，优选5或6个双键。这些C2o和/或C22脂肪酸分子可以以油、脂类或游离脂肪酸的形式从植物中分离。合适的转基因植物例如为上面提及的那些。在每种情况下基于100%和植物总脂肪酸含量，本发明的这些油、脂类或脂肪酸有利地包含如上述，6到15%的棕榈酸，1到6%的硬脂酸；7到85%的油酸；0.5到8o/。的11-十八碳烯酸，0.1到1%的花生酸，7到25%的饱和脂肪酸，8到85%的单不饱和脂肪酸和60到85%的多不饱和脂肪酸。存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物如磷脂酰脂肪酸酯或三酰甘油酯中的有益多不饱和长链脂肪酸基于总脂肪酸含量优选为按重量计至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20%二十碳五烯酸，和/或基于总脂肪酸含量，以重量计至少1、2、3、4、5或6%的二十二碳五烯酸，和/或基于总脂肪酸含量，以重量计至少l、2、3;优选至少4、5、6;特别优选至少7或8并最优选至少9或10%的二十二碳六烯酸。已通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物还包含脂肪酸，所述脂肪酸选自芥酸(二十二碳烯-13酸)、苹婆酸(9，10-亚甲基十八碳-9-烯酸)、锦葵酸(8，9-亚曱基十七碳-8-烯酸)、大风子油酸(环戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-环氧十八碳-9，ll-二烯酸)、斑鳩菊酸(9，10-环氧十/\碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbicacid(反ll-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七烯-8-炔酸)、crepenyninicacid(9画十八締-12-炔酸)、13，14-二氬oropheicacid、十八碳-13-烯-9，11-二炔酸、伞形花子油酸(顺-6-十八烯酸)、9顺，12反-十八碳二烯酸、金盏花素酸(8反10反12顺-十八碳三烯酸)、梓戒酸(9反11反13顺-十八碳三烯酸)、石榴酸(9顺11反13顺-十八碳三烯酸)、jacaricacid(8顺10反12顺-十八碳三烯酸)、石榴酸(9顺11反13顺-十八碳三烯酸)、麦饼树酸(9顺11反13反15顺-十八碳四烯酸)、皮诺敛酸(全-顺-5,9，12-十八碳三烯酸)、laballenicacid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羟油酸)和/或革盖菌素酸(13-羟-9顺，ll反-十八碳二烯酸)。通常，上述脂肪酸只以痕量有利地存在于本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物中，意思是，基于总脂肪酸含量，它们的存在低于30%，优选低于25%、24%、23%、22%或21%，特别优选低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，十分特别优选低于4%、3%、2%或1%。在本发明进一步优选的形式中，这些上述脂肪酸的存在基于总脂肪酸低于0.9%、0.8%0.7%、0.6%或0.5%,特别优选寸氐于0.4%、0.3%、0.2%、0.1%。基于总脂肪酸，本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含低于0.1%和/或无丁酸、胆固醇和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，18，21)。本发明的其它实施方案是本发明方法产生的油、脂类、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在饲料、食品、化妆品或药物中的用途。在本发明方法中获得的油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物可以用于与动物来源的其它油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物例如鱼油以技术人员熟悉的方式混合。以该方式产生并由植物和动物组分组成的这些油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物也可以用于铜料、食品、化妆品或药物的制备。将术语"油"、"脂类"或"脂肪"理解为指包含不饱和和/或饱和，优选酯化脂肪酸的脂肪酸混合物。优选地，所述油、脂肪或脂类在多不饱和游离或有利地酯化脂肪酸中，特别在亚油酸、，亚麻酸、二高-，亚麻酸、花生四烯酸、a-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸中含量很高。优选地，不饱和酯化脂肪酸的量为约30%，尤其优选具有50%的量，并最优选具有60%、70%、80%或更高的量。可以在脂肪酸通过转酯作用转化为甲酯后通过气相色镨来测定脂肪酸的量。油、脂类或脂肪可以包含多种其它饱和或不饱和脂肪酸，例如金盏花素酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸等。特别是，多种脂肪酸的量才艮据初始植物可以变化。如上描述，有利地具有3、4、5或6个，特别有利地具有5或6个双键并已在本方法中制备的多不饱和脂肪酸酯有利地采取脂肪酸酯的形式，例如，鞘脂类、磷酸甘油酯、脂类酯、糖脂、磷脂酯、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯，优选磷脂酯和/或三酰甘油酯。从多不饱和脂肪酸酯开始(所述多不饱和脂肪酸酯在本发明方法中产生并有利地具有至少3、4、5或6个双键)，所存在的多不饱和脂肪酸经碱例如KOH或NaOH水溶液处理，或者有利地于存在醇例如曱醇或乙醇时经酸水解，或者经酶切割释放并且通过例如相分离及随后例如H2S04的酸化作用而分离。这类脂肪酸也可无需以上描述的处理步骤直接释放。本方法中所用核酸序列(所述核酸序列编码具有A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和/或A5-延伸酶活性的多肽)，和任选地编码具有co3-去饱和酶和/或A4-去饱和酶活性的多肽的核酸序列，和/或所用的其它核酸序列(如编码脂肪酸或脂类代谢的多肽的核酸序列)的底物是C16-、C『或C20-脂肪酸，所述脂肪酸或脂类代谢的多肽选自酰基-辅酶A脱氢酶、酰基ACP—酰基载体蛋白去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。。优选地，本方法中转化的脂肪酸作为底物以它们酰基辅酶A酯的形式和/或以它们的磷脂酯的形式被转化。为了产生本发明的长链PUFAs，根据底物，首先必须将饱和、单不饱和C『脂肪酸和/或多不饱和dr脂肪酸通过去饱和酶和/或延伸酶的酶促活性去饱和和/或延伸，或仅去饱和并随后通过延伸酶延伸至少2个碳原子。一个延伸循环后，该酶活性导致从dr脂肪酸开始至ds-脂肪酸或从C18-脂肪酸开始至C2(T脂肪酸，并且在两个延伸循环后从<:16-脂肪酸开始导致(:20-脂肪酸。本发明方法中使用的去饱和酶或延伸酶的活性优选地导致<:20-和/或Qj2-脂肪酸，在脂肪酸分子中有利地具有至少2个或3个双键，优选具有4、5或6个双键，尤其优选地导致脂肪酸分子中具有至少5个双键的<:22-脂肪酸。本发明方法的特别优选产物是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。脂肪酸中具有至少2个双键的ds-脂肪酸可以通过本发明的酶促活性以游离脂肪酸的形式或以酯，如磷脂、糖脂、鞘脂、磷酸甘油酯、单酰基甘油、二酰基甘油或者三酰甘油的形式来延伸。脂肪酸、油、脂类或脂肪在有利使用的植物中优选的生物合成部位例如通常是种子或种子的细胞层，因此对方法中所用的核酸进行种子特异性表达是有意义的。然而，显然脂肪酸、油或脂类的生物合成不必限定于种子组织，而是也可在植物的所有其它部分例如在表皮细胞或在块茎中以组织特异性方式进行。有利地，通过本发明方法的合成在营养(体细胞)组织中发生。由于本发明的方法，产生的多不饱和脂肪酸原则上可以在本方法所用的植物中以两种方式增加。有利地，可以增加通过本方法产生的游离多不饱和脂肪酸的库和/或酯化多不饱和脂肪酸的量。有利地，通过本发明的方法有利地以磷脂酰酯和/或三酰基酯的形式来增加转基因植物中酯化多不饱和脂肪酸的库。将本发明方法中所用的序列单独地克隆到表达构建体中或将其提供到连接的重组核酸分子上并用于引入和在生物中表达。这些表达构建体使最佳地合成本发明方法中产生的多不饱和脂肪酸变成可能。本方法中所用的核酸在引入植物或植物细胞后，可以定位在单独的质粒上或有利地整合到宿主细胞的基因组中。在整合到基因组中的情况下，整合可以是随机的或通过重组来发生，使得天然基因被引入的拷贝代替，因此通过细胞调节想要的化合物的产生，或通过反向基因的使用，使得所述基因在功能上连接到功能表达单位上，所述功能表达单位包含保证基因表达的至少一种序列和保证功能转录基因多腺苷酸化的至少一种序列。通过多表达盒或构建体将核酸序列有利地引入到植物中用于多平行表达，即核酸序列存在于连接的表达单位中。核酸序列构建体可以包含多于一种核酸序列，其编码具有A-12-去饱和酶、A-4-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-6-延伸酶和/或(o-3-去饱和酶酶促活性的多肽。存在多个拷贝的核酸序列也是可能的，所述核酸序列编码具有A-12-去饱和酶、A-4-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-6-延伸酶和/或co-3-去饱和酶酶促活性的多肽。对于引入，以已知的方式有利地扩增并连接本方法中所用的核酸。优选地，接着是遵循PfuDNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶混合物方案的方法。根据待扩增的序列来选择引物。引物应该方便地以这样的方式来选择扩增子包含从起始密码子到终止密码子的整个编码序列。扩增后，方便地分析所述扩增子。例如，可以通过凝胶电泳分离来进行质量和数量的分析。此后，可以才艮据标准方案(例如Qiagen)来纯化扩增子。纯化的扩增子的等分试样然后可用于随后的克隆步骤。适宜的克隆载体通常是技术人员已知的。这些具体包括能够在微生物系统中复制的载体，也就是说主要是确保在酵母或者真菌中有效克隆并且使得可能稳定转化植物的载体。必须提及的载体是适于T-DNA-介导的转化的多种双元的和共整合的载体系统。此类载体系统通常的特征在于它们至少包含农杆菌介导的转化所需的vir基因和T-DNA-定界序列(T-DNA边界)。这类载体系统还有利地包含其它顺式调节区域，如启动子和终止子序列和/或选择标记，通过这些顺式调节区域，已合适转化的生物通过选择标记可以鉴定。在共整合载体系统的情况下，vir基因和T-DNA序列在相同载体中排列，而双元系统至少以两种载体为^S^出，其中一种载体携带了vir基因但没有T-DNA，同时第二种载体携带了T-DNA而无vir基因。因此所提及的后一种载体相对较小，容易操作和在大肠杆菌(E.coli)中和农杆菌中复制。这类双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA优选使用。双元载体和它们的用途的综述可在Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446-451中找到。为了制备载体，载体首先以限制性核酸内切酶线性化并且然后按照合适的方式进行酶修饰。此后纯化载体并且将一份纯化的载体用于克隆步骤。在克隆步骤中，使用连接酶将已经酶切割并且根据需要已纯化的扩增物与已按类似方式制备的载体片段克隆。在本上下文中，具体的核酸构建体、或载体或质粒构建体可具有一个或超过一个的编码性基因片段。将编码性基因片段在这些构建体中优选地与调节性序列有效连接。调节性序列尤其包括植物序列，如启动子和终止子。这类构建体可在微生物，特别在大肠杆菌和根癌农杆菌中于选择性条件下稳定增殖并且有可能向植物或微生物中转移异源DNA。可以有利地使用克隆载体将本发明方法中使用的核酸序列和核酸构建体引入微生物中然后引入植物中，并因此用于植物转化，如在PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),章6/7，页71-119(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;inTransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,编辑Kung和R.Wu，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等人TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,编辑Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，A國.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.(1991)42:205-225中公布并在其中引用的那些。因此，本方法中使用的核酸、核酸构建体和/或载体可以用于广泛类型植物的重组修饰，使得后者变得更好和/或变成更有效的LCPUFA产生者。因为将A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和A5-延伸酶基因单独或与其它基因组合引入到植物中，不仅可能增加向终产物的生物合成流量，也可能增加或从头(denovo)产生对应的三酰基甘油和/或磷脂酰酯组合物。同样，可以增加参与营养物输入的其它基因的数量或活性，所述营养物为一种或更多脂肪酸、油、极性和/或中性脂类的生物合成所需要，使得细胞中或贮藏区中这些前体、辅助因子或中间体的浓度升高，由此如下描述，细胞产生PUFAs的能力进一步增强。通过优化参与这些化合物生物合成的一种或更多A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和/或A5-延伸酶基因的活性或增加其数量，或者通过破坏参与降解这些化合物的一种或更多基因的活性来提高来自生物并有利地来自植物的脂肪酸和脂类分子中的产量、生产和/或生产效率是可能的。本发明方法中使用的核酸分子编码蛋白质或其部分，然而所述蛋白质或单个蛋白质或其部分包含氨基酸序列，其与在序列SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172或SEQIDNO.52和适当时SEQIDNO.194或SEQIDNO.78中描述的氨基酸序列具有足够的同源性，使得蛋白质或其部分仍然具有A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶和/或A5-延伸酶活性，和适当时具有A-4-去饱和酶和/或co-3-去饱和酶活性。由核酸分子/多个核酸分子编码的蛋白质或其部分优选地仍然具有它的/它们的基本酶促活性和参与生物中，有利地植物中对构建细胞膜或脂质体必需的化合物代谢或参与跨这些膜进行分子运输的能力。由所述核酸分子编码的蛋白质与在SEQIDN0.65、SEQIDNO,2、SEQIDNO.172、SEQIDNO,52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78中描述的氨基酸序列具有至少约60%并优选至少约70%、80%或卯％,并特别优选至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。同源性或同源的在本发明的上下文中指同一性或同一的。在整个氨基酸或者核酸序列区上计算同源性。为了比较不同序列，利用基于多种算法的一系列程序。在该上下文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法给出尤其可靠的结果。为了进行序列比对，使用程序PileUp(J.MoLEvolution.,25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS,51989:151-153)或者程序Gap和BestFit[Needleman和Wunsch(丄Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)]，其是GCG软件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)的部分。使用程序GAP使用下面的设置在整个序列区上确定上面给出的序列同源性数据(以％表示)缺口权重50，长度权重3，平均匹配10.000和平均错配0.000。除非另外指出，这些设置总是还用作序列比较的标准设置。本发明的方法中使用的ro-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-6-延伸酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-5-去饱和酶的基本酶促活性指，与由具有SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDN0.171、SEQIDNO,51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的序列编码的蛋白质/酶相比，它们仍然具有至少10%，优选至少200/。，特别优选至少30%并最优选至少40、50或60%的酶促活性，并因此能够参与植物或植物细胞中合成脂肪酸，有利地脂肪酸酯如砩脂酰酯和/或三酰甘油酯所必需的化合物代谢或参与分子跨膜运输。有利地用于方法的核酸可源自细菌、真菌、硅藻、动物如隐杆线虫或大马哈鱼属或者植物，如藻类或者藓类，如希瓦氏菌属(Shewanella)、剑叶藓属、破嚢壶菌属、镰孢属(Fusarium)、疫霉属、角齿藓属、畸雌腐霉(Pytiumirregulare)、Mantoniella、Ostreococcus、等鞭金藻属、Aleurita、Muscarioides、被孢霉属、琉璃苣属、褐指藻属、隐甲藻属，尤其来自畸雌腐霉、虹鳟、非洲爪蟾、玻璃海鞘、假矮海链藻、Mantoniellasquamata、Ostreococcussp.、Ostreococcustauri、细小棵藻、展叶剑叶藓、致病疫霉、Fusariumgraminaeum、寇氏隐甲藻、角齿藓(Ceratodonpurpureus)、球等鞭金藻(Isocrydidgalbana)、Aleuritafarinosa、破嚢壶菌属的种、Muscarioidesviallii、高山#支孢霉、玻璃莴苣、三角褐指藻、秀丽线虫的属和种或尤其有利地来自畸雌腐霉、破嚢壶菌(Thraustochytriumsp.)和/或Ostreococcustauri。此外在本发明方法中使用编码A-12-去饱和酶、A-9-延伸酶或A-8-去饱和酶的核苷酸序列是可能的。将本方法中使用的核酸序列有利地引入表达盒中，所述表达盒使核酸在植物中的表达成为可能。将编码A-12-去饱和酶、(D-3-去饱和酶、A-9-延伸酶、A-6-去饱和酶、A-8-去饱和酶、A-6-延伸酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶或A-4-去饱和酶的核酸序列有效连接到一种或更多调节信号中来提高基因表达。这些调节序列旨在使基因的定向表达成为可能。这可以指例如，根据植物的不同，基因只在诱导后表达和/或过表达，或立即表达和/或过表达。有利地用于表达的序列使组成型表达成为可能，如CaMV35S、CaMV36S、CaMV35Smas、nos、mas、ubi、stpt、lea或Super启动子。表达优选发生在如上描述的营养组织中。在另一优选实施方案中，所述表达发生在种子中。这些调节序列是例如诱导物或阻抑物结合的序列并因此调节核酸的表达。除了不在它们天然基因座连接到核酸序列上的调节序列，或代替这些序列，这些序列的天然调节也可以在实际结构基因前存在，并且适当时已经被遗传々务饰，使得天然调节被关闭并提高基因表达。基因构建体可以额外有利地也包含一种或更多功能连接到启动子上的所谓"增强子序列"，其使核酸序列的增强表达成为可能。额外有利的序列也可以插入到DNA序列的3，末端，如其它调节元件或终止子。有利的终止子为例如病毒终止子，如35S终止子或其它。本发明方法中使用的核酸序列可以存在于一个或更多拷贝的表达盒(=基因构建体)中。优选地，只有一个拷贝的基因存在于每一个表达盒中。该基因构建体或多个基因构建体可以同时或连续引入植物中并在宿主生物中一同表达。在该上下文中，基因构建体可以插入到一个或更多栽体中并在细胞中以游离形式存在，或也可以插入到基因组中。当待表达的基因共同存在于一个基因构建体中时，在植物中插入其它基因是有益的。然而，在每种情况下将含有核^f列的基因构建体引入到植物中并将得到的植物相互杂交以获得共同含有所有基因构建体的后代也是可能的。在该上下文中，调节序列或因子可以，如上描述优选地对引入基因的基因表达具有积极作用，因此加强它的表达。因此，调节元件有利地在转录水平上的增强可以通过使用强转录信号如启动子和/或增强子来发生。此外，然而，例如通过提高mRNA的稳定性增强翻译也是可能的。为了保证生物合成基因在数代间稳定整合到转基因植物中，编码A6-去饱和酶、A6-延伸酶、A5-去饱和酶或A5-延伸酶和适当时co3-去饱和酶或下表达。这对于每种序列可以是相同的或不同的。在该上下文中，有利地以这种方式构建表达盒启动子后接着是合适的剪切位点用于待表达的核酸插入，所述剪切位点有利地位于多位点接头中。适当时，终止子可以位于多位点接头的后面。该序列重复多次，优选3、4、5或6次，使得高达6个基因可以组合在一个构建体中并因此引入到转基因植物中以便表达。为了表达核酸序列，核酸序列通过例如多位点接头中的合适切割位点在启动子后面插入。每种核酸序列有利地具有自身的启动子并且根据需要具有自身的终止子。然而仍然可在启动子后面并且根据需要在终止子前插入多个核*列。这里表达盒中所插入核酸的插入位点或其序列并不特别重要，也就是说核酸序列可在表达盒中最先的位置或最末的位置插入而该位置不显著地影响这种核酸序列的表达。在有利的实施方案中，不同的启动子例如USP、LegB4或DC3启动子和不同的终止子可有利地在表达盒中使用。在进一步有利的实施方案中，也可以使用相同的启动子如CaMV35S启动子。如以上所述，已导入基因的转录应当通过位于已导入的生物合成基因3，端的合适终止子有利地终止(在终止密码子之后)。在本上下文中，可使用序列的例子是OCSl或35SCaMV终止子。如同启动子的情况，对每种基因应该使用不同的终止子序列。如以上所述，基因构建体还可包含欲导入生物中的其它基因。向宿主扭物中导入并且因此在其中表达调节基因如诱导物、阻抑物或酶基因是可能并且有利的，其中这些诱导物、阻抑物或酶因其活性参与了生物合成途径中一种或多种基因的调节。这类调节基因可为异源或同源。而且脂肪酸或脂类代谢中的其它生物合成基因可在核酸构建体或基因构建体中有利地存在；备选地，这些基因还可以存在于一种或多种其它核酸构建体中。优迭选择的脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因是选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[-酰基载体蛋白1去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶或它们组合的一种或多种基因。尤其有利的核酸序列是脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因，这些生物合成基因选自酰基辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、A8-去饱和酶、A9-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或A9-延伸酶。在本上下文中，以上提到的核酸或基因可与其它延伸酶和去饱和酶组合在以上提及的表达盒中克隆并在农杆菌属协助下转化植物。在该说明书中使用的术语"载体，，指这样的核酸分子，其能够运输与这种核酸分子所结合的其它核酸。载体的一个类型是"质粒"，即可连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一个类型是病毒载体，对额外的DNA片段而言有可能向这种病毒的基因组内连接。某些载体能够在已导入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它载体当向宿主细胞导入时有利地在宿主细胞的基因组内整合并JL因此随宿主基因组一起复制。而且某些载体能够控制与这些栽体有效连接的基因的表达。这些载体在本上下文中称为"表达载体"。通常适用于DNA重组技术的表达载体采用了质粒的形式。在本说明书中由于质粒是最常用的载体形式，故"质粒，，和"载体"可交换使用。然而本发明还将覆盖具有类似功能的其它形式的表达载体如病毒载体。而且术语"载体"还将包含技术人员熟知的其它载体如噬菌体、病毒如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线形或环形DNA。有利地在方法中使用的重组表达栽体包含具有宿主细胞中适于所用核酸表达的形式的根据本方法使用的核酸序列或者所述基因构建体，即所述重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞所选择的一种或多种调节序列，其中这种(类)调节序列与将要表达的核酸序列有效连接。在重组表达载体中，"有效连接，，意指将目的核苷酸序列与调节序列以如此方式连接，即有可能使这种核苷酸序列表达并且它们彼此连接而使这两类序列(例如在体外转录/翻译系统中，或如果栽体导入了宿主细胞，在宿主细胞中)都执行了属于该序列的预期功能。术语"调节序列"旨在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)—书中或参见Gruber和Crosby,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida,Glick和Thompson编著，Chapter7，89-108,包括其中引用的参考文献。调节序列包含那些在多种类型的宿主细胞中控制核苷酸中于特定条件下直接表达的调节序列。技术人员知道表达载体的设计可依赖多种因素，如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质的目的表达程度及其它因素。可以以这种方式设计所用的重組表达载体用于表达本方法中所用的核^列可以将它们转化到原核中间宿主中并最后引入植物后使基因在其中的表达成为可能。因为简单，这是有利的，栽体构建中的中间步骤经常在孩史生物中进行。例如，A-6-去饱和酶、A-6-延伸酶、A-S-去饱和酶和/或A-5-延伸酶基因可以在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞和其它真菌细胞(见Romanos，M.A.，等人(1992)Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.J"等人(1991)"Heterologousgeneexpressionin打lamentousfungi",in:MoreGeneManipulationsinFungi，J.W.Bennet&L丄.Lasure，编辑，页396-428:AcademicPress:SanDiego;和vandenHondd，C.A.M.J.J.，&Punt，P.J.(1992)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.，等人，编丰卑，页1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻类(Falciatore等人(1999)MarineBiotechnology.l:(3):239-251)、纤毛虫中使用载体根据WO98/01572中描述的转化方法表达，并优选地在多细胞植物的细胞中表达(见Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants'，PlantCellRep.:538-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，Florida,章6/7，页71-119(1993);F.F.White,B.Jenes等人，TechniquesforGeneTransferinTransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,编辑Kung和R.Wu,AcademicPress(1993)，128-43;Potrykus(1991)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225(和其中引用的参考文献))。合适的宿主是在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中进一步讨论的宿主。重组表达载体可以或者在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶进行转录和翻译。原核生物中蛋白质的表达通常利用栽体进行，所述载体包含控制融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子。典型的融合表达载体尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和A蛋白分别融合到重组靶蛋白质上。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其为pTrc(Amann等(1988)Gene69:301-315)和pETlid(1990年加利福尼亚圣迭哥AcademicPress出版牙土《MethodsinEnzymology》185的Studier等《GeneExpressionTechnology》第60-89页)。耙基因自pTrc载体的表达是基于宿主RNA聚合酶自杂合trp-lac融合启动子的转录。耙基因自pETlid载体的表达是基于经共表达的病毒RNA聚合酶(T7-gnl)所介导的T7-gnl0-lac融合启动子的转录。这种病毒RNA聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)的定居k-原噬菌体提供，其中所述定居k-原噬菌体携带了受lacUV5启动子转录控制的T7gnl基因。适合于原核生物的其它载体为技术人员已知，这些栽体是例如在大肠杆菌中pLG338、pACYC184，pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系歹'、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN國III113-Bl、kgtll或pBdCI,在链霉菌属中pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中为pUB110、pC194或pBD214中，在棒状杆菌中为pSA77或pAJ667。在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酿酒酵母中表达的载体的例子包含pYeDesaturasecl(Baldari等.(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cdl30:933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。用于构建适用于其它真菌如丝状真菌的载体和构建方法包含在1991年剑桥大学的剑桥大学出版社丄F.Peberdy等编辑的《AppliedMolecularGeneticsoffungi》第1-28页，vandenHondel、C.A.M,J.J;和Pun，P.J.的"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi"中或在《MoreGeneManipulationsinFungi》圣迭哥AcademicPress出版社J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页中所详细描述的那些载体和方法。其它合适的酵母载体为例如pAG-l、YEp6、YEpl3和pEMBLYe23。或者，本发明方法中使用的核酸序列可以使用棒状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的棒状病毒栽体包括pAc系歹'J(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。以上提到的载体仅概略回顾了可能适合的载体。其它的质粒为技术人员所知并且在例如《Cloningvector》(1985年阿姆斯特旦-纽约-牛津Elsevier出版社，Pouwels，P.H.等编辑，ISBN0444卯4018)中描述。对于其它合适用于原核及真核细胞的表达系统，见1989年纽约冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版社，Sambrook，J.、Fritsch,E.F.和Maniatis，T.的((MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版第16和第17章中的描述。本方法中使用的基因也可以在单细胞植物细胞(如藻类)中表达，见Falciatore等人(1999)MarineBiotechnology1(3):239-251和其中引用的参考文献，和在来自高等植物(例如种子植物如耕种作物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包含在Becker,D.、Kemper,E.、Schell，J.和Masterson，R.(1992)PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan，M.W.(1984)Nucl.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants;in:TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,编辑Kung和R.Wu，AcademicPress,1993,页15-38中详细描述的那些载体。植物表达盒优选包含调节序列，其能够控制植物细胞中的基因表达并有效连接使得每种序列可以实现它的功能如转录终止，例如多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌T-DNA的那些，如Ti质粒pTiACH5的基因3(Gielen等人，(1984)EMBOJ.3835etseq.),其已知为章鱼碱合成酶，或其功能等价物，但是在植物中功能活性的所有其它终止子也是适合的。因为植物基因表达调节经常地不局限于转录水平，植物表达盒优选包含有效连接的其它序列如翻译增强子，例如超驱动序列，其增强烟草花叶病毒5，-非翻译前导序列，其增加蛋白质/RNA比率(Gallie等人(1987)Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。如上描述，植物基因表达必须与控制基因表达的合适的启动子有效连接。有利地可利用的启动子是组成型启动子(Benfey等人，EMBOJ.(1989)8:2195-2202)，如来自植物病毒的那些，如35SCaMV(Franck等人(1980)Cell21:285-294)、19SCaMV(也见US5352605和WO84/02913),或者植物启动子，如US4，962，028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基的启动子。植物基因表达盒中用于功能联系的其它优选序列是靶定序列，其对引导基因产物进入它的合适的细胞区室，例如进入液泡、细胞核、所有类型的质体如造粉体、叶绿体、色质体、细胞外间隙、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体或植物细胞的其它区室是必要的；(见Kermode(1996)Crit.Rev.PlantSci.15(4):284-423中的综述和其中引用的参考文献)。载体DNA可通过常规的转化或转染技术向原核和真核细胞内导入。术语"转化，，和"转染"、接合和转导如在本上下文中所用，旨在包含本领域众知的用于向宿主细胞内导入异源核酸(如DNA)的多种方法，包括磷酸钩或氯化钓共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。适用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的方法可在Sambrook等(1989年纽约冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版社《MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版)和其它的实验室手册如1995年新泽西Totowa的HumanaPress出版社《MethodsinMolecularBiology》第44巻Gartland和Davey编辑的《Agrobacteriumprotocols》中找到。如此处所用的术语"核酸(分子)，，在有利的实施方案中额外包含位于编码基因区3，末端和5，末端的非翻译序列编码区5，末端的序列上游至少500，优选200,特别优选100个核苷酸和编码基因区3，末端的序列下游至少100，优选50，特别优选20个核苷酸。"分离的"核酸分子与该核酸天然来源中存在的其它核酸分子相分离。"分离的"核酸优选不具有在该核酸来源的生物的基因组DNA中在所述核酸天然侧翼的序列(例如定位于核酸5，和3，末端的序列)。在多种实施方案中，本方法中使用的分离的A-6-去饱和酶、A-6-延伸酶或A-5-去饱和酶和，适当时co-3-去饱和酶或A-4-去饱和酶分子可以例如包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在核酸来源的细胞基因组DNA中所述核酸分子的天然侧翼。本方法中使用的核酸分子可以通过使用分子生物学的标准技术和此处提供的序列信息来分离。例如在比较算法的帮助下在DNA或氨基酸水平上鉴定同源序列或同源、保守序列区也是可能的。这些在标准杂交技术中可以用作杂交探针(例如在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中描述)用于分离可用于本方法中的其它核酸序列。本方法中使用的核酸分子或其部分此外可以通过聚合酶链式反应来分离，在该情况下使用基于该序列或其部分的寡核苷酸引物(例如包含全部序列或其部分的核酸分子可以使用寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离，已基于该相同序列构建了所述引物)。例如，可以从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等人(1979)Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸胍提取法)并且可以在反转录酶(例如从Gibco/BRL，Bethesda获得的莫洛尼MLV反转录酶、从SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL获得的MD或AMV反转录酶)的帮助下制备cDNA。可以在SEQIDNO,64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中显示的序列之一的^出上或在SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78描述的^J^酸序列的帮助下构建合成的寡核苷酸引物用于通过聚合酶链式反应扩增。可以使用cDNA或者基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物通过标准的PCR扩增技术来扩增本发明的核酸。可以将以该方式扩增的核酸克隆到合适载体中并通过DNA序列分析对其进行表征。可以通过标准的合成方法，例如使用自动DNA合成仪来制备寡核苷酸。所用的具有序列SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的A-5-延伸酶、co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-6-延伸酶、A-4-去饱和酶或A-5-去饱和酶核酸序列的同源物是指例如等位变体，其与SEQIDNO.64、66、68或70中显示的核苷紗列之一，与SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中显示的核苷餅列之一，与SEQIDNO.171、173、175、177、179、181或183中显示的核苷酸序列之一，与SEQIDNO,51、53或55中显示的核苷酸序列之一，与SEQIDNO.193或195中显示的核苷,列之一或与SEQIDNO.77、79、81、83、85、87、89、91或93中显示的核苷酸序列之一，尤其是SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中显示的核苷酸序列或它们的同源物、《汙生物或类似物或其部分具有至少约40、50或60%，优选至少约60或70%，更优选至少约70或80%、90%或95%并且甚至更优选至少85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性或同源性。同样包括的是核苷^f列的分离的核酸分子，所述核酸分子例如在严格条件下与SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中显示的核苷酸序列之一或其部分杂交。部分在本发明该方面指至少25个碱基对(=bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp，优选至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp,特另)J优选350bp、400bp、450bp、500bp或更多碱基对用于杂交。使用完整序列也可能是有益的。等位变体包含特定功能变体中，其可以通过SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中描述的序列的核苷酸的缺失、插入或替代而获得，但是对于插入，基本上保留了由此编码的蛋白质的酶活性。可以基于它们与此处公开的co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-6-延伸酶核酸序列的同源性，通离有利于本发明方法的核酸分子。在该方面例如使用至少15个核苷酸长的分离的核酸分子并在严格条件下与包含SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77核苷酸序列的核酸分子杂交是可能的。使用具有至少25、50、100、250或更多核苷酸的核酸分子也是可能的。如此处使用的术语"在严格条件下杂交"旨在描述杂交和洗涤条件，在所述条件下至少60%互相同源的核酸序列通常保持杂交在一起。所述条件优选为使得至少约65%,优选至少约70%并特别优选至少约75%或更高互相同源的序列通常保持杂交在一起的条件。这些严格条件为技术人员已知并可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中发现。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在6x氯化钠/柠檬酸钠(=SSC)中约45。C的条件杂交，接着在0.2xSSC,0.1%SDS中50至65。C的一个和更多个洗涤步骤。技术人员知道这些杂交条件根据核酸的类型和例如存在有机溶剂而不同，与温度和緩冲液的浓度有关。例如在"标准杂交条件"下的温度根据核酸的类型在浓度为0.1到5xSSC(pH7.2)的水性緩沖液中为42°C到58°C之间。如果有机溶剂，例如50%曱酰胺存在于上述緩冲液中，那么标准条件下的温度为约42。C。DNA:DNA杂交分子的杂交条件优选为例如0.1xSSC和20。C至45。C,优选30。C至45。C。DNA:RNA杂交分子的杂交条件优选为例如0.1xSSC和30°C至55°C，优选45。C至55。C。例如对于具有约100bp(=碱基对)长度和5(T/。的G+C含量的核酸，在没有甲酰胺的条件下确定上述杂交温度。技术人员知道可以基于教科书如上述的教科书或从以下教科书Sambrook等人，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(编辑)1985,"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(编辑)1991，"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford中怎样确定必须的杂交条件。为了确定两种氨基酸序列(例如SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78的序列之一)或两种核酸(例如SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77)的同源性(=同一性)百分比，将所述序列写在另一序列的下面以能够最佳地比较它们(例如，可以将空位引入蛋白质或核酸的序列中以产生与另一蛋白质或核酸的最佳比对)。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸基团或核苷酸。如果序列中的位置与另一序列中的对应位置被相同的氨基酸基团或相同的核苷酸占据，那么分子在该位置上是同源的(即如本上下文中所用的氨基酸或核酸"同源性，，对应了氨基酸或核酸"同一性")。两种序列间同源性的百分比M列共有的同一位置数目的函数(即同源性=同一位置的数目/位置的总数x100)。在上面描述了用于确定同源性的程序和算法。可以通过向SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的核苷酸序列中引入一个或更多核苷酸替代、添加或缺失产生编码w-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-6-延伸酶的分离的核酸分子，所述co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-6-延伸酶用于本方法中并与SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78的蛋白质序列同源，使得一个或更多氨基酸替代、添加或缺失被引入到编码的蛋白质中。突变可以通过标准技术如位点特异性诱变和PCR介导的诱变而引入SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77序列之一中。保守的^J^酸替代优选在一个或更多预测的非必需氨基酸残基处产生。在"保守的M酸替代"中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、p-分枝侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在co-3-去饱和酶、去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-6-延伸酶中的预测非必需氨基酸残基因此优选被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基代替。在另一实施方案中另一可能是在整个或部分的co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶和/或A-6-延伸酶编码序列范围内例如通过饱和诱变随机引入突变，并且可以对所得突变体筛选此处描述的co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶或A-6-延伸酶活性以鉴定突变体，该突变体已保持了co-3-去饱和酶、A-6-去饱和酶、A-5-去饱和酶、A-5-延伸酶、A-4-去饱和酶或A-6-延伸酶活性。编码的蛋白质可以在诱变后重组表达，并且蛋白质的活性可以例如通过^f吏用此处描述的测定法来确定。本发明由以下实施例更详尽地阐述，其不被理解为限定。将专利申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公布的专利申请的内容引用作为参考o下面的表显示了如在2006年2月21的优先权申请(具有德国申请号102006008030.0)中4吏用的序列标识符和在该后续申请中的对应序列标识符。由优先权申请的SEQIDNO:1标识的核酸序列对应例如由后续申请的SEQIDNO:64标识的核酸序列。优先权申请的序列标识符和后续申请中序列标识符索引表:<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>实施例实施例1:通用的克隆方法克隆方法例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、核酸转移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌培养和重组DNA的序列分析按照Sambrook等(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)所描述实施。实施例2:重组DNA的序列分析重组DNA分子以ABI激光荧光DNA测序4义按照Sanger(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463-5467)的方法测序。通过聚合酶链反应获得的片段经过测序和验证以避免待表达的构建体中的聚合酶偏差。实施例3:从Ostreococcustauri中克隆基因序列保守区是可能的，所述序列编码具有A-5-延伸酶活性或A-6-延伸酶活性的蛋白质。这些是以下序列<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>OtElo2.1与来自斑马鱼(Daniorerio)的延伸酵(GenBankAAN77156;约26%同一性)具有最高相似性，而OtElol.l与来自剑叶藓属(Physcomitrella)(PSE)的延伸酶(约36%同一性)具有最高相似性(用tBLASTn算法进行比对(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410))。延伸酶的克隆如下进行将40ml处于稳定期的Ostreococcustauri培养物离心并在100pi双蒸水中重悬浮并保存于-20。C。用PCR方法扩增相应的基因组DNA。选择相应引物对使得它们在起始密码子旁具有用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak(1986)Cell44:283-292)。在每种情况下，在含1pi解冻的细胞、200pMdNTPs、2.5UTaq聚合酶和100pmol每种引物的50pl总体积内进行OtEloDNA的扩增。用于PCR的条件如下在95°C第一次变性5分钟，随后是94。C30秒、55。C1分钟和72°C2分钟进行30个循环，和72。C10分钟的最后延伸步骤。实施例4:来自Ostreococcustauri延伸酶基因的优化如实施例3中描述的分离来自生物Ostreococcustauri的延伸酶。为实现C22脂肪酸含量的增加，使序列SEQIDNo.143(A6-延伸酶)和SEQIDNo.109(编码由SEQIDNo.110鉴定的蛋白质)(A5-延伸酶)适应于油菜、亚麻和大豆中的密码子选择。为此目的，将A6-延伸酶和A5-延伸酶的氨基酸序列(A6-延伸酶为SEQIDNO.144;A5-延伸酶为SEQIDNO.65)反向翻译以获得简并DNA序列。考虑到单个密码子的固有频率，通过GeneOptimizer程序(来自Geneart，Regensburg)4吏这些DNA序列适应于油菜、大豆和亚麻中的密码子选择。在体外合成以该方法获得的优化序列，其在SEQIDNO.64(A5-延伸酶)和SEQIDNO.122(编码SEQIDN0.123鉴定的蛋白质)(A6-延伸酶)中指出。实施例5:克隆表达质粒用于在酵母中进行异源表达为表征经优化核酸序列的功能，将各DNA的可读框克隆到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖诱导型GAL1启动子下游，获得质粒pOTEl.2(包含A6-延伸酶序列)和pOTE2.2(包含A5-延伸酶序列)。克隆到酵母载体pYES2.1/V5-His-TOPO中的延伸酶序列概述:基因名称SEQID氨基酸pOTEl.l，(A-6-延伸酶)SEQIDNO.143292pOTE1.2，(A隱6-延伸酶)SEQIDNO.122292，优化的密码子pOTE2.1，(A-5画延伸酶)SEQIDNO.109300pOTE2.2，(A-5画延SEQIDNO.64300，优化的密码伸酶)子通过电穿孔法(1500V)用载体pOTE1.2和pOTE2.2及分别包含编码A6-延伸酶和A5-延伸酶的天然核酸序列的比较构建体pOTEl.l和pOTE2.1对酿酒酵母菌抹(Saccharomycescerevisiae)334进行转化。转化了空载体pYES2的酵母用作对照。在含2%葡萄糖但无尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择转化的酵母。选择后，在每种情况下糸L选三个转化体用于进一步的功能表达。为表达Ot延伸酶，首先，在每种情况下用筛选的转化体接种含2%(w/v)棉子糖但无尿嘧啶的5mlCMdum液体培养基组成的预培养物并在30°C，200rpm下培养2天。然后用预培养物接种含2%棉子糖的5mlCMdum液体培养基(无尿嘧啶)至OD6。。为0.05。此外，在每种情况下，向pOTEl.l和pOTE1.2转化的酵母培养物中加入0.2mMy-亚麻酸(GLA)。基于OtELOl.l的活性，期望Y-亚麻酸延伸为20:3脂肪酸。在花生四烯酸和二十碳五烯酸。对应OtEL02.1的活性，期望脂肪酸ARA和EPA分别延伸为22:4和22:5脂肪酸。通过加入2%(w/v)半乳糖诱导表达。培养物在20。C继续培养96小时。实施例6:酵母中OtEL02.2(如SEQIDNO:64中描述)和OtELOl.2(如SEQIDNO:122中)的表达以如下方式分析如在实施例5中用质粒pYES2、pOTE1.2和pOTE2.1转化的酵母为除去残留培养基和脂肪酸，通过离心(100xg，5分钟，20。C)从主要培养物中收集酵母细胞并用100mMNaHC03，pH8.0进行洗涤。通过酸性甲醇分解从酵母细胞沉淀中制备脂肪酸甲脂(FAMEs)。为此目的，用2ml1N硫酸的甲醇溶液(methanolicsulfuricacid)和2%(v/v)二甲氧基丙烷在80。C温育细胞沉淀1小时。通过用石油醚(PE)萃取两次来萃取FAMEs。为除去未衍生的脂肪酸，用2ml100mMNaHC03，pH8.0和2ml蒸馏水洗涤有机相各一次。然后用Na2S04干燥PE相、在氩气下蒸发并在100plPE中吸收。在带有火焰电离检测器的Hewlett-Packard6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm,0.25fim，Agilent)上分离样品。GLC分析条件如下炉温设定为以5。C/分钟速率从50。C至250°C并最终在250°C(保持)10分钟。通过利用适当的脂肪酸标准品(Sigma)比较滞留时间来鉴定信号。例如在Napier和Michaelson(2001)Lipids36(8):761-766;Sayanova等人(2001)JournalofExperimentalBotany52(360):1581-1585，Sperling等人(2001)Arch.Biochem.Biophys.388(2):293-298和Michaelson等人(1998)FEBSLetters439(3):215-218中描述了该方法。在表1中描述了分析结果。确定pOTEl.l/pOTEl.2和pOTE2.1/2.2的适当活性是可能的。优化序列(分别pOTEl.2和pOTE2.2)在两种情况下都显示活性。相比于野生型序列，？01￡1.2只能轻微地提高？亚麻酸的合成。相反，对于pOTE2,2可能令人惊讶地观察到活性的增加和特异性的改变(表l)。在该方面，EPA延伸的活性已经几乎加倍，而ARA的延伸已经超过四倍。因此在酵母中等量底物的情况下，用来自Ostreococcustauri的A5-延伸酶的序列的优化增加DHA前体产量6倍是可能的。实施例7:克隆表达质粒用于植物中的种子特异性表达除非另有说明，以下描述的一般条件应用于所有的后续实验。根据本发明，pBinl9、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA或pSUN优选用于下面的实施例。双元载体及它们用途的综述可在Hellens等人，TrendsinPlantScience(2000)5:446—451中找到。使用如DE10205607中描述的pGPTV衍生物。该载体与pGPTV的不同之处是额外插入的Ascl限制酶切割位点。克隆方法的起点为克隆载体pUC19(Maniatis等人)。在第一步中，用如下引物扩增conlinin启动子片段CnllC5，gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcgaCnllC3，cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgatPCR混合物的组成(50nl):5.00jil模板cDNA5.00jil10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl5.00jil2mMdNTP1.25jil每种引物(lOpmol/fil)0.50Advantage聚合酶(CIontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶EcoRI在37。C温育2小时，并然后与限制性内切酶Smal在25°C温育12小时。用同样方式温育克隆载体pUC19。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和2668bp切割的载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒(QiagenGelPurificationKit)按制造商的说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒(RapidLigationKit)用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19画Cnll画C。在下一步中，使用如下引物从载体pGPVT-USP/OCS(DE10205607)扩增OCS终止子(GenbankAccessionV00088;DeGreve，H.，等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1(6):499-511):OCS—C5，aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgccOCS_C3，cccgggccggacaatcagtaaattgaacggagPCR混合物的组成(50jil):5.00pi模板cDNA5.00pi10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl5.00jil2mMdNTP1.25jil每种引物(lOpmol/jil)0.50piAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶Stul在37°C温育2小时然后与限制性内切酶Smal在25°C温育12小时。载体pUC19-Cnll-C与限制性内切酶Smal在25。C温育12小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后的载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll-C—OCS。在下一步中，用如下引物通过PCR扩增Cnll-B启动子Cnll-B5，aggcctcaacggttccggcggtatagCnll-B3，cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttctPCR混合物的组成(50fil):5.00pi模板cDNA5.00nl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25pi每种引物(10pmol/pl)0.50ftlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶Stul在37°C温育2小时然后与限制性内切酶Smal在25。C温育12小时。载体pUC19-Cnll-C与限制性内切酶Smal在25°C温育12小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后的载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商i兌明书纯化DNA。随后，连接栽体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll-C_CnllB_OCS。在下一步中，插入CnllB的OCS终止子。为此，用如下引物进行PCR:OCS25，aggcctcctgctttaatgagatatgcgagacOCS23，cccgggcggacaatcagtaaattgaacggagPCR混合物的组成(50jil):5.00pi模板cDNA5.00pi10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25nl每种引物(lOpmol/fil)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶Stul在370C温育2小时然后与限制性内切酶Smal在25°C温育12小时。载体pUC19-CnllC—CnllB_OCS与限制性内切酶Smal在25。C温育12小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll-C—CnllB—OCS2。在下一步中，用如下引物通过PCR扩增Cnll-A启动子Cnll-B5，aggcctcaacggttccggcggtatagagCnll-B3，aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggtPCR混合物的组成(50jU):5.00jil模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00fil2mMdNTP1.25nl每种引物(10pmol/jil)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物与限制性内切酶Stul在37。C温育2小时。载体pUC19-Cnll-C与限制性内切酶Smal在25。C温育12小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-CnllC_CnllB—CnllA—OCS2。在下一步中，插入CnllA的OCS终止子。为此，用如下引物进行PCR:OCS25，ggcctcctgctttaatgagatatgcgaOCS23，aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggagaPCR混合物的组成(50^1):5.00fil模板cDNA5.00nl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25fil每种引物(10pmol/nl)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶Stul在37。C温育2小时然后与限制性内切酶HindlII在370C温育2小时。载体pUC19-CnllCj:iillBj:nllA—OCS2与限制性内切酶Stul在37°C温育2小时并与限制性内切酶HindIII在37°C温育2小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后的载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll-C—CnllB—CnllA—OCS3。在下一步中，质粒pUC19-CnllC—CnllB—CnllA—OCS3用于克隆A6画、A5-去饱和酶和A6-延伸酶。为此，用如下PCR引物扩增PhytiumirregulareA6-去饱和酶(WO02/26946):D6Des(Pir)5，agatctatggtggacctcaagcctggagtgD6Des(Pir)3，ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgatPCR混合物的组成(50nl):5.00nl模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00fil2mMdNTP1.25jil每种引物(lOpmol/jil)0.50Advantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶BglII在37°C温育2小时然后与限制性内切酶Ncol在37°C温育2小时。载体pUC19-CnllC_CnllB_CnllA_OCS3与限制性内切酶BglII在37。C温育2小时并与限制性内切酶NcoI在3"C温育2小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后载体并切除对应的DNA片段用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll—d6Des(Pir)。在下一步中，质粒pUC19-Cnll—d6Des(Pir)用于克隆Thraustochytriumssp.A5-去饱和酶(WO02/26946)。为此，用如下PCR引物扩增破嚢壶菌(Thraustochytriumssp.)A5-去饱和酶D5Des(Tc)5，gggatccatgggcaagggcagcgagggccgD5Des(Tc)3,:ggcgcegacaccaagaagcaggactgagatatcPCR混合物的组成(50jd):5.00pi模板cDNA5.00fil10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25nl每种引物(10pmol/nl)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶BamHI在37°C温育2小时然后与限制性内切酶EcoRV在37°C温育2小时。载体pUC19-Cnll—d6Des(Pir)与限制性内切酶BamHI在37°C温育2小时并与限制性内切酶EcoRV在37°C温育2小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cn11—d6Des(Pir)_d5Des(Tc)。在下一步中，质粒pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)用于克隆展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)A6-延伸酶(WO01/59128)，为此目的，用如下PCR引物扩增后者D6Elo(Pp)5，gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtgD6Elo(Pp)3，gcaaaagggagctaaaactgagtgatctagaPCR混合物的纟且成(50nl):5.00pi模板cDNA5.00jil10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25fil每种引物(10pmol/nl)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94。C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物先与限制性内切酶Notl在37°C温育2小时然后与限制性内切酶Xbal在37°C温育2小时。载体pUC19-Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)与限制性内切酶Notl在37°C温育2小时并与限制性内切酶Xbal在37°C温育2小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和切割后栽体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cn11—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)。由pUC19-CnU—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)JD6Elo(Pp)开始制备用于植物转化的双元载体。为此，pUC19-Cnlld6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)与限制性内切酶AscI在37。C温育2小时。用同样方式处理载体pGPTV。随后，来自pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6EIo(Pp)的片段和切割后的pGPTV载体用琼脂糖凝胶电泳进行分离并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接栽体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pGPTV-Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)。使用进一步的构建体pGPTV-Cnll—d6Des(Pir)d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)。为此，由pUC19-CnIlC_OCS开始用如下引物进行扩增Cnll一OCS5，gtcgatcaacggttccggcggtatagagttgCnll一OCS3，gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggagaPCR混合物的组成(50nl):5.00jil模板cDNA5.00nl10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00nl2mMdNTP1.25jil每种引物(lOpmoI/pl)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55°C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物与限制性内切酶Sail在37。C温育2小时。载体pUC19与限制性内切酶Sail在37°C温育2小时。随后，PCR产物和切割后载体用琼脂糖凝胶电泳进行分离并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cnll—OCS。在下一步中，将金盞花(Calendulaofficinalis)A12-去饱和酶基因(WO01/85968)克隆至pUC19-Cnll—OCS中。为此，用如下引物扩增dl2Des(Co):D12Des(Co)5，agatctatgggtgcaggcggtcgaatgcD12Des(Co)3，ccatggttaaatcttattacgataccPCR混合物的组成(50jil):5.00fil模板cDNA5.00pi10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25pi每种引物(lOpmol/jil)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反应条件退火温度1分钟55。C变性温度1分钟94°C延伸温度2分钟72。C循环数35PCR产物与限制性内切酶BglII在37°C温育2小时然后与限制性内切酶NcoI在37。C温育2小时。用同样方式温育载体pUC19-Cnll—OCS。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段和切割后载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接栽体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序^ii获得的质粒pUC19-Cnll—D12Des(Co)。质粒pUC19-Cnll_D12Des(Co)和质粒pUC19Cnlld6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)与限制性内切酶Sail在37。C温育2小时。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离载体片段和切割后载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和和载体片段。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pUC19-Cn11d6Des(Pir)—d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co)。由pUC19-Cnll_d6Des(Pir)—d5Des(Tc)D6Elo(Pp)一D12Des(Co)开始制备用于植物转化的双元载体。为此，pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)与限制性内切酶AscI在37。C温育2小时。用同样方式处理载体pGPTV。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离来自pUC19画Cn11—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)的片段和切割后的pGPTV载体并切除对应的DNA片段。用Qiagen凝胶纯化试剂盒按制造商说明书纯化DNA。随后，连接载体和PCR产物。Roche的快速连接试剂盒用于此目的。通过测序验证获得的质粒pGPTV-Cnlld6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)D12Des(Co)。种子特异性表达构建体用途的其它实施例是Napin启动子。在Wu等人(2005)Nat.Biotech.23:1013-1017中描述了用载体pGPTV或pSUN制备这些表达构建体。适合植物转化的另一载体是pSUN2。为使载体内存在的表达盒数目增力口至多于四个，该载体与Gateway系统(Invitrogen，Karlsruhe)组合4吏用。为此，如下描迷按照制造商的说明书将GatewayA盒插入载体pSUN2:pSUN2载体(1jig)与限制性内切酶EcoRV在37。C温育1小时。然后使用来自Roche,Mannheim的快速连接试剂盒将GatewayA盒(Invitrogen，Karlsruhe)连接到切割后的载体中。将获得质粒转化到大肠杆菌DB3.1细胞(Invitrogen)中。然后通过测序验证分离的质粒pS跳GW。在第二步中，用Ascl从pUC19画Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)切下表达盒并连接到同样处理的载体pSUN-GW中。以该方式获得的质粒pSUN-4G用于其它基因构建体。为此目的，首先按照制造商说明书(Invitrogen)修饰pENTR克隆。质粒pENTRlA(Invitrogen)与限制性内切酶EcoRI在37°C温育1小时然后用Klenow酶和1pMdNTP混合物处理30分钟，并随后将Ascl接头(5，-ggcgcgcc;5，端磷酸化，双链)连接到pENTRlA载体中。如上描述将基因逐步插入在这些修饰的Cnl盒并通过Ascl转移进入pENTR载体，获得pENTR-Cnl载体。在下一步中，制备pSUN-8G构建体。为此目的，产生具有SEQIDNOs:1、3、5和7的基因的5，和3，引物(其含有如上描述的限制性切割位点及可读框的前20个和在每种情况下最后20个核苷酸)，并用标准条件(见上)扩增并连接到pENTR-Cnl载体中，其随后按照制造商说明书与pSUN-4G载体进4亍重组反应。以该方式制备构建体pSUN-8G并转化到芥菜(Brassicajuncea)和欧洲油菜(Brassicanapus)中。通过气相色谱分析转基因植物的种子。用于芥菜和欧洲油菜转化的另一构建体是构建体pSUN-9G。用油菜籽蛋白(napin)启动子根据Wu等人(2005)Nat.Biotech.23:1013-1017制备该构建体。在Wu等人2005的修改方法中，用所述方式插入0促L02,2的编码序列代替基因OmELO。然后将获得的构建体pSUN-9G转化到芥菜和欧洲油菜中。实施例8:从植物材料中提取脂类通过在合适条件(例如上面所描述)下生长经修饰的植物并分析用于提高目的产物(即脂类或脂肪酸)产量的培养基和/或细胞成分可确定植物中遗传修饰对目的化合物(如脂肪酸)产量的影响。这些分析技术为技术人员已知并包括光谱学、薄层层析法、多种类型的染色方法、酶学及微生物学方法和分析型层析例如高效液相色谱法(见，例如，Ullman，EncyclopediaofIndustrialChemistry,巻A2，页89-90和页443-613,VCH:Weinheim(1985);FallonA.等人(1987)"ApplicationsofHPLCinBiochemistry"in:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17;Rehm等人(1993)Biotechnology,巻3，章III:"Productrecoveryandpurification",页469-714，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人(1988)Bioseparations:downstreamprocessingforBiotechnology,JohnWiley和Sons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)RecoveryprocessesforbiologicalMaterials,JohnWiley和Sons;Shaeiwitz，J.A.和Henry,J.D.(1988)BiochemicalSeparations,in:Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,巻B3;章11，页1-27，VCH:Weinheim;和Dechow，F.J.(1989)Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications)除了上面提及的方法，如Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad，Sci.USA96(22):12935-12940和Browse等人(1986)AnalyticBiochemistry152:141-145描述的从植物材料中提取植物脂类。Christie,WilliamW.，AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress(OilyPressLipidLibrary;2);Christie,WilliamW.，GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989，Repr.1992,IX，307pp.(OilyPressLipidLibrary;1);"ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)underthetitle:ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN描述了脂类或脂肪酸的定性及定量分析。除了测量发酵的终产物以外，还可分析用于产生目的化合物的代谢途径中的其它成分例如中间体和副产物以测定该化合物的总生产效率。分析方法包括测量培养基中营养物(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)的量，测量生物量的组成和生长，分析生物合成途径中的常规代谢物的产生和测量发酵期间所产生的气体。用于这些测量的标准方法在IRLPress出版社P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编辑的《AppliedMicrobialPhysiology;APracticalApproach》(ISBN:0199635773)的第103-129页、第131-163页和第165-192页以及其中所引用的参考文献中描述。一个分析的例子是脂肪酸的分析(缩略语FAME,脂肪酸甲酯；GC-MS，气液色镨/质谱；TAG,三酰甘油；TLC,薄层层析)。可如Christie及其中的参考文献(1997年Dundee的OilyPress出版社Christie的《AdvancesonLipidMethodology》第四版中第119-169页；1998年Gaschromatographie-Massenspektrometrie画Verfahren[GasChromatography/massspectrometricmethods],Lipide33:343-353)数次描述的那样^^用分析性标准方法GC、GC-MS或TLC通过分析重组生物清楚无误地检测脂肪酸产物的存在。欲分析的材料可通过超声处理、玻璃磨中研磨、液氮和研磨或者通过其它可利用的方法加以破碎。这种材料在破碎后必须离心。在蒸馏水中重悬沉淀，10(TC加热10分钟，水上冷却并且再次离心，然后在含0.5M硫酸和2%二曱氧基丙烷的甲醇溶液中卯。C提取1小时，由此产生了已水解的油和脂类化合物，产生了已转曱基化的脂类。这些脂肪酸甲酯在石油醚中提取并且最后通过使用毛细管柱(Chrompack，WCOTFusedSilica,CP-Wax-52CB，25pm,0.32mm)经20分钟的170。C至240。C之间的温度梯度并且在240。C维持5分钟进行GC分析。得到的脂肪酸甲酯的身份必须使用可从商业来源获得的标准品(即Sigma)确定。首先通过往返于研杆和研钵之间机械地勻浆植物材料以使其更便于提取。随后100。c加热io分钟并且在;水上冷却后再次离心。细胞沉淀以iM硫酸的曱醇溶液(methanolicsulfuricacid)和2%二甲氧基丙烷卯。C水解一小时并且将脂类转曱基化。得到的脂肪酸曱酯(FAME)在石油醚中抽提。所提取的FAME通过使用毛细管柱(Chrompack,WCOTFusedSilica,CP-Wax-52CB，25pm，0.32mm)的气液色i普经20分钟的170oC至240°C之间的温度梯度并且在240°C维持5分钟进行分析。脂肪酸甲酯的身份通过与相应FAME标准品(Sigma)的比较确认。双键的身份和位置通过使FAME混合物适当地化学衍生以产生例如4,4-二甲氧5悉唑啉衍生物(Christie,1998)经GC-MS进一步分析。实施例9:来自Ostreococcustauri的优化的A5-延伸酶(如SEQIDNO:64中描迷)用于组成型表达构建体的用途产生基于pGPTV-35S的转化栽体和基于pBIN19-35S(BevanM.(1984)Nucl.AcidsRes.18:203)的质粒用于植物转化。为此目的，首先将由启动子元件CaMV35S(SEQIDNo.161)和35S终止子(SEQIDNO.162;Franck，A.等人(1980)Cell21(1):285-294)组成的表达盒装配到pUC载体中。这需要经Sall/Xbal限制性切割位点插入的启动子和经BamHI/Smal限制性切割位点插入的终止子。此外，带有Xhol切割位点的多接头连接到终止子上(三重连接)。得到的质粒pUC19-35S然后用于克隆PUFA基因。平行地，A6-去饱和酶(SEQIDNO.1)、A5-去饱和酶(SEQIDNO.51)和A6-延伸酶(SEQIDNO.171)序列的可读框经EcoRV切割位点插入到pUC19-35S载体。得到的质粒pUC-D6、pUC-D5、pUC-E6(Tc)用于构建双元载体pGPTV-35S—D6D5E6(Tc)。为此目的，用酶Sail消化载体pGPTV,用Sall/Xhol消化质粒pUC-D6,并连接正确的片段。随后用Sail消化得到的质粒pGPTV-D6，用Sall/Xhol消化质粒pUC-D5，并连接正确的片段。然后再用SalI消化所获质粒pGPTV-D6-D5一次，用SalI/XhoI消化质粒pUC-E6(Tc)，并连接正确的片段。这些连续的克隆步骤生成双元载体pGPTV-D6D5E6(Tc)，其用于转化。在下一步中，d6Elo(Tp)(SEQIDNO.163)的序列代替d6Elo(Tc)序列插入到载体pUC19-35S中。所获质粒pUC-E6(Tp)用于制备双元载体pGPTV-35S一D6D5E6(Tp)。在下一步中，将co3Des(SEQIDNO.193)的可读框克隆到pUC19-35S中。所获质粒pUC-co3Pi经Sall/Xhol转移至双元载体pGPTV-D6D5E6(Tc)和pGPTV-D6D5E6(Tp)。所获载体pGPTV-D6D5E6(Tc)co3Pi和pGPTV-D6D5E6(Tp)o3Pi用于植物转化。在下一步中，将来自Ostreococcustauri的优化A5-延伸酶的可读框(SEQIDNo.64)和来自破嚢壶菌的A4-去饱和酶的可读框(SEQIDNo.77)克隆到pUC19-35S中。按照上面的叙述通过Sall/Xhol将所获质粒pUC-E5和pUC-D4转移至载体pGPTV-D6D5E6(Tp)o3Pi中。所获栽体pGPTV画D6D5E6(Tp)co3PiE5D4用于植物转化。按照生产商说明书将所有双元载体转化到大肠杆菌DH5a细胞(Invitrogen)中。通过PCR鉴定阳性克隆并分离质粒DNA(QiagenDneasy)。实施例10:组成型双元载体向植物的转化a)转基因植物欧洲油菜和芥菜的产生。使用油菜植物转化方案(Moloney等人(1992)PlantCellReports8:238-242的改进方法)。将双元载体pGPTV-D6D5E6(Tp)co3PiE5D4转化到根癌农杆菌C58Cl:pGV2260中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)。阳性转化的农杆菌菌落的过夜培养物在添加有3%蔗糖的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)(3MS培养基)中1:50稀释后用于转化诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)。新萌发的无菌植物的叶柄或下胚轴(在每种情况下约1cm2)在培养jDL内与1:50的农杆菌稀释物温育5-10分钟。随后在添加有0.8%Bacto琼脂的3MS培养基上在25。C黑暗中共培育3天。随后，在添加有500mg/1头孢參將(头孢蓉將钠)、50mg/1卡那霉素、20千基氨基噪呤(BAP)和1.6g/l葡萄糖的MS培养基上以16小时光照/8小时黑暗及每周节律继续培养。转移长出的苗至添加有2%蔗糖、250mg/1头孢噻肟和0.8%Bacto琼脂的MS培养基上。如果三周后根未发育，那么向培养基添加2-吲咮丁酸作为生根用生长激素。在含卡那霉素和头孢噻肟的2MS培养基上获得再生苗，然后在生根后，转移至土壤并，栽培后，在受控环境箱或温室内生长两周，允许开花，收获成熟种子并通过脂类分析来分析延伸酶的表达如A6-延伸酶活性或A5-或A6-去饱和酶活性。以该方式，鉴定到多不饱和C20-和C22-脂肪酸含量升高的抹系。b)转基因诸葛菜植物的产生使用如a)中描述的油菜植物转化方案(Moloney等人(1992)PlantCdlReports8:238-242的修改方案)。为产生转基因植物，将双元载体pGPTV-D6D5E6(Tp)o3PiE5D4转化到根癌农杆菌C58Cl:pGV2260中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)。阳性转化的农杆菌菌落的过夜培养物在含3%蔗糖的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)(3MS培养基)中l:50稀释后用于转化诸葛菜。新萌发的无菌植物的叶柄或下胚轴(每种约1cm2)在培养脏内与1:50的农杆菌稀释物温育5_10分钟。随后在添加有0.8%Bacto琼脂的3MS培养基上在25。C暗中共温育3天。随后在含500mg/1头孢噻將(头孢噢將钠)、15mg/1卡那霉素、20nM节基氨基噤呤(BAP)和1.6g/1葡萄糖的MS培养基上以16小时光照/8小时黑暗及每周节律继续培养。转移长出的苗至添加有2%蔗糖、250mg/1头孢瘗肟和0.8%Bacto琼脂的MS培养基。如果三周后根未发育，那么向培养基添加2-吲咮丁酸作为生根用生长激素。在含卡那霉素和头孢噻肟的2MS培养基上获得再生苗并，并在生根后转移至土壤，并栽培后，在受控环境箱或温室内生长两周，允许开花，收获成熟种子并通过脂类分析来检验延伸酶的表达如A-6-延伸酶活性或A-5-或A-6-去饱和酶活性。以该方式鉴定多不饱和C20-和C22-脂肪酸含量升高的林系。c)拟南芥植物的转化使用Bechthold等人(1993)C.R.Acad.Sci.Ser.IllSci.Vie.316:1194-1199的方案。为产生转基因植物，将产生的双元载体pGPTV-D6D5E6(Tp)(o3PiE5D4转化到根癌农杆菌C58Cl:pMP卯中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)，并按照Bechthold等人(1993)的方案，将拟南芥cv.Columbia0的花浸在OD600=1.0的农杆菌溶液中。两天后再次重复该步骤。然后将这些花的种子放置于含V2MS、2%蔗糖和50mg/1卡那霉素的琼脂板上。然后将绿色幼苗转移至土壤。实施例11:转基因诸葛菜属(Orychophragmus)或拟南芥植物的植物材料的分析如实施例8中描述进行pGPTV-D6D5E6(Tp)co3PiE5D4转化的转基因植物诸葛茱和拟南芥叶片材料的提取及气相色谱分析。表2显示分析结果。多种脂肪酸以重量百分比指出。可能表明长链多不饱和脂肪酸由两种不同植物物种合成。与例如Robert等人(2005)FunctionalPlantBiology32:473-479才艮道的用拟南芥获得1.5%DHA相比，利用来自Ostreococcustauri的AS-延伸酶的优化序列(如SEQIDNO:64中描述)得到显著更高的DHA产量，这是令人惊讶的。第一次实现诸葛菜中长链多不饱和脂肪酸的合成是可能的。实施例12:转基因芥菜林系种子的分析如实施例8中描述进行pSUN-9G转化的转基因芥菜种子的提取和气相色镨分析。表6显示分析结果。多种脂肪酸以百分比面积指出。如在Wu等人2005中，可能表明长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的合成。令人惊奇地，修饰的延伸酶序列OtEL02.2如SEQIDNO:64描述的核酸序列的使用导致C22脂肪酸含量显著提高。总之，以重量％计，种子油含约8。/。的多不饱和C22脂肪酸。尤其是，以重量％计种子油中脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)的含量为1.9%，表示与Wu等人2005相比升高10倍。实施例13:来自"^者葛菜叶材料的的脂类类别和位置分析的详细分析约lg的叶组织在4ml异丙醇中95。C下加热10分钟，通过Polytron进行匀浆并在加入1.5ml氯仿后振荡。将样品离心，收集上清液，并用异丙醇氯仿1:1(v/v)再次抽提沉淀。将两种提取物合并，干燥并在氯仿中溶解。在二氧化硅prepsep柱(FisherScientific,Nepean，加拿大)上将脂提取物预分级分离成中性脂类、糖脂和磷脂，分别用氯仿乙酸100:1(v/v)、丙酮乙酸100:1(v/v)和甲醇氯仿水100:50:40(v/v/v)洗脱。这些级分在二氧化硅G-25薄层层析板(TLC;Macherey-Nagel，Dtiren，德国)上进一步分级分离。中性脂类用己烷二乙醚乙酸(70:30:1)显色，糖脂用氯仿曱醇氨(65:25:4v/v/v)显色，且磷脂用氯仿曱醇氨水(70:30:4:1v/v/v/v)显色。在UV灯下用樱草灵喷雾后鉴定各脂类，用于进一步的分析。通过公开的方法分级分离多种脂类(中性脂类、磷脂和半乳糖脂)并分别分析是可能的。糖脂用于额外检测各脂肪酸的位置。a)三酰甘油酯(TAG)的区域专一性分析3至5毫克TLC纯化的TAG在玻璃管中氮气下干燥，在水性緩冲液中通过短暂的超声处理(1MTrispH8;2.2%CaCl2(w/v);0.05%胆汁盐(w/v))重悬浮并在40°C温育4分钟。在加入0.1ml胰脂肪酶(水中10mg/ml)溶液后，将样品剧烈涡旋3分钟，并通过加入1ml乙醇和1.5ml4MHC1终止消化。用二乙醚两次萃取部分消化的TAG,用水洗涤，干燥并在小体积的氯仿中溶解。如上对于中性脂类所述，在TLC板上从游离脂肪酸和未消化的TAG中分离单酰基甘油(MAG)。对应于MAG的点通过GC来分析并代表TAG的sn-2位置。通过以下公式来计算脂肪酸相对于剩余sn-1和sn-3位置的分布sn-1+sn-3=(TAGx3-MAG)/2。三酰甘油酯的该位置分析揭示在该情况下EPA和DHA以相似浓度存在于sn-2和sn-1/3位置中，而发现ARA全部地仅以少量存在于三酰甘油酯中，并且此处主要在sn-2位置中(表3)。b)磷脂的立体特异性分析分级分离并萃取的磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)在N2下干燥并在0.5ml硼酸盐緩沖液(0.5M，pH7.5，含有0，4mMCaCl2)中重悬浮。短暂超声处理后，加入来自莫桑比克眼镜蛇(Najamossambica)毒液的5U磷脂酶A2(SigmaP-7778)和2ml二乙醚并在室温下将样品涡旋2小时。将醚相干燥，用0.3ml的1MHC1终止所述消化，并用氯仿甲醇(2:1v/v)萃取反应混合物。在氯仿甲醇氨水(70:30:4:2v/v/v/v)中通过TLC分离消化的磷脂并且通过刮除来去除对应于释放的游离脂肪酸和溶血磷脂的点并直接进行转甲基作用。磷脂的位置分析显示EPA和DHA在磷脂酰胆碱(PC)的sn-2位置中积累，而DHA类似地分别在磷脂酰乙醇胺(PE)的sn-1和sn-2位置中。在两种磷脂中发现仅痕量的ARA或者没有ARA(表4)。EPA和DHA在磷脂酰甘油中的浓度低于在其它研究的磷脂中的浓度，在该脂类类别中也观察到在sn-2位置中的积累(表4，PG)。c)糖脂的立体特异性分析研究半乳糖脂作为其它极性脂类。半乳糖脂在质体的膜中发现并在那里形成主要成分。TLC纯化的单半乳糖二酰基甘油(MGDG)和二半乳糖二酰基甘油(DGDG)在氮气下干燥并在0.51111二乙醚中溶解。然后加入来自少才艮才艮霉(Rhizopusarrhizus)的25单位的脂肪酶(Sigma62305)(该脂肪酶在2ml硼酸盐緩冲液(50mM，pH7.5含有2mMCaCl2)中重悬浮)，并且在室温下将样品涡旋2小时。将所述醚相干燥并通过加入0.311111MHC1终止消化作用，并用4ml氯仿甲醇(2:lv/v)萃取所述脂类。干燥后，消化的半乳糖脂存在于小体积的氯仿甲醇(2:1v/v)中并首先用氯仿曱醇氨7K(70:30:4:1v/v/v/v)在预涂布的二氧化硅TLC板上显色两次到达平板高度的约2/3，接着是在己烷二乙醚乙酸(70:30:1)中完全显色。在用樱草灵喷雾后鉴定了对应于释放的游离脂肪酸和溶血半乳糖脂的点，将其刮掉并直接进行转曱基用于GC分析。在这些脂类中发现VLCPUFA也是可能的，观察到EPA在sn-2位置中的积累。仅在二半乳糖二酰基甘油(DGDG)中发现了DHA，且在单半乳糖二酰基甘油(MGDG)中未检测到(表5)。VLCPUFA在半乳糖脂中的分布显示了合成和随后转化的动力学，所述半乳糖脂是没有预期含有这些脂肪酸的区室。极性脂类中的VLCPUFA具有特别的营养价值，因为相比于中性脂类，它们可以在哺乳动物肠内被更好地吸收。表1:酵母中pOTEl.l和pOTE2.1优化序列的检测。根据底物转化确定转化率。用质粒pOTE2.2中的优化序列可以实现活性的显著提高。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表2:诸葛菜和拟南芥叶材料的气相色语分析。各脂肪酸以百分比面积指出。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>拟南芥叶材料的脂肪酸组成<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表3:来自转基因诸葛菜植物叶材料的三酰甘油酯的区域专一性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表5:来自转基因诸葛菜植物叶材料的半乳糖脂的立体特异性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表6:气相色谱确定用构建体pSUN-9G转化的转基因芥菜植物种子的脂肪酸(以重量百分比计)。WT描述了未^"饰的野生型对照。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>权利要求1.在转基因植物中产生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法，其包括在植物中提供编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽的至少一种核酸序列；编码具有Δ6-延伸酶活性的多肽的至少一种核酸序列；编码具有Δ5-去饱和酶活性的多肽的至少一种核酸序列；和编码具有Δ5-延伸酶活性的多肽和任选地编码Δ4-去饱和酶的至少一种核酸序列，其中编码具有Δ5-延伸酶活性的多肽的核酸序列因为其适应于一种或更多植物物种中的密码子选择，与该序列的来源生物中的核酸序列相比较受到修饰。2.权利要求l的方法，其中所述核酸序列至少适应于油菜、大豆和/或亚麻中的密码子选棒。3.权利要求1或2任一项的方法，其中考虑个体密码子的固有频率来适应所述核酸序列。4.权利要求1到3任何一项的方法，其中所述经修饰的核酸序列对应于SEQIDNo.64中指出的核酸序列。5.权利要求1到4任何一项的方法，其中所述核酸序列在种子特异性启动子的控制下表达。6.权利要求5的方法，其中所述启动子是USP、豌豆球蛋白、油茱冲予蛋白、Glp、SBP、过氧化物氧还蛋白(peroxireduxin)、豆球蛋白、Fad3、conlinin或油质蛋白启动子。7.权利要求6的方法，其中多不饱和C22脂肪酸在种子油中的含量以重量计为种子油含量的5%或更高。8.前述权利要求中任何一项的方法，其中在植物中额外地提供一种或多种核酸序列，其编码具有co3去饱和酶和/或A4-去饱和酶活性的多肽。9.权利要求8的方法，其中二十二碳六烯酸在种子油中的含量以重量计为种子油含量的1%或更高。10.前述权利要求中任何一项的方法，其中二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸主要作为酯如磷脂或三酰甘油酯以结合形式存在于植物中。11.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述植物为选自欧洲油菜、芥菜和大豆的产油植物。12.前述权利要求中任何一项的方法，还包括从植物中以油、脂类或游离脂肪酸形式吸收二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。13.分离的核酸分子，其包含如在SEQIDNo.64中显示的核酸序列。14.重组核酸分子，其包含a)在植物细胞中有活性的一个或更多拷贝的至少一种启动子，b)至少一种核酸序列，其编码具有A6-去饱和酶活性的多肽，c)至少一种核酸序列，其编码具有A5-去饱和酶活性的多肽，d)至少一种核酸序列，其编码具有A6-延伸酶活性的多肽，e)至少一种核酸序列，其编码具有A5-延伸酶活性的多肽并且由于适应于一种或更多植物物种中的密码子选择，与该序列的来源生物中的核酸序列相比较受到修饰，和f)一个或更多拷贝的至少一种终止子序列。15.权利要求14的重组核酸分子，其中所述修饰的核酸分子对应于在SEQIDNo.64中指出的核醋列。16.权利要求14或15任何一项的重组核酸分子，其额外地包含编码具有co3-去饱和酶和/或A-4-去饱和酶活性的多肽的一种或多种核酸序列。17.转基因植物，其包含权利要求22至25任何一项的重组核酸分子或包含在SEQIDNo.64中指出的核餅列。18.权利要求19中要求保护或通过权利要求18的方法获得的油、脂类或游离脂肪酸用于生产饲料、食品、化妆品或药物的用途。全文摘要本发明涉及在转基因植物中产生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法。根据所述方法，提供了植物，该植物具有至少一种核酸序列，其编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有Δ6-延伸酶活性的多肽；至少一种核酸序列，其编码具有Δ5-去饱和酶活性的多肽；和至少一种核酸序列，其编码具有Δ5-延伸酶活性的多肽，其中编码具有Δ5-延伸酶活性的多肽的核酸序列与该序列的来源生物中的核酸序列相比较受到修饰，使得它适应于至少一种类型的植物中的密码子选择。为了产生二十二碳六烯酸，还向植物中引入编码具有Δ4-去饱和酶活性的多肽的至少一种核酸序列。文档编号C12N15/82GK101400798SQ200780007847公开日2009年4月1日申请日期2007年2月21日优先权日2006年2月21日发明者B·程,G·吴,J·鲍尔,M·特鲁克萨,P·奇尔普斯,T·韦特耶恩,X·邱申请人:巴斯福植物科学有限公司