基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

专利名称：基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技 术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
目前对结核分歧杆菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴
定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7 — 2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应 (PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化 学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准 确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形 态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提 纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检 测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、 灵敏和自动化的方向发展。
以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实 际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要 专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光 实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，
因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术 中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快 速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确 性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最 新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等 温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP) 具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核 分歧杆菌的基因快速诊断试剂盒。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使 用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核 分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术 来检测结核分歧杆菌的。
本发明的另一个目的是提供上述结核分歧杆菌基因快速诊断试 剂盒的检测方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的 一、本发明的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、
S^DNA聚合酶、裂解液l、裂解液2、稳定液、样品预处理液、显色
液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，其中 所述两对引物为外引物F3: GGCTGGTCTCTGGCGTT,如SEQ ID NO:l所示； 外引物B3: GGCCTATACAAGACCGAGCT,如SEQ ID NO:2
所示；
内引物FIP: GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGT AGGCAGCCT，如SEQ ID NO:3所示；
内引物BDP: GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGG CAAGCCCT,如SEQ ID NO:4所示；
上述反应液每lL中含有1.6 2mmo1 dNTP、 20 25mmolTris-Cl、 10 12.5mmol氯化钾、10 12.5mmol硫酸铵、8 10mmol硫酸镁、 l 1.25ml TritonX-lOO、 0.8 lmol甜菜碱、内引物FHVBIP各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mo1。优选的比例是每1L中含有 2mmoldNTP、 25mmol Tris-Cl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、 10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引物FDVBIP各 2mol和夕卜引物F3/B3各0.25mo1。
上述裂解液1每1L中含有10 20 mmol pH8.3的Tris-HC1、50 100 mmol KC1、 2.5 5 mmol MgCl2、 5 10ml Triton X-IOO、 5 1 0ml吐温-20和0.1 0.2g明胶。
上述裂解液2为蛋白酶K。
上述阳性对照为结核分歧杆菌基因组DNA。
上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。
上述稳定液优选为石蜡油。
二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、 将内引物FHVBIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检;
3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；
4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、 组装试剂盒。
三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法
1、 样品处理
将待测痰样液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；在裂解 液l中加入裂解液2，吹打混匀后，加入前述沉淀中，水浴裂解反应， 反应结束后离心，上清即为样品模板DNA;
上述痰样液化所用的液化试剂为质量百分数4%NaOH溶液或胰 酶，液化至样品中无痰丝即可；
上述水浴裂解反应中，水浴温度为55 60°C，裂解反应时间为 60min 90min。
2、 环介导等温扩增技术反应过程
在反应管中加入反应液38 40体积％、Bst DNA聚合酶0.9 1.8 体积％ 、稳定液52 54.5体积％ 、样品模板DNA4.5 9体积％ ， 63 65"C恒温反应45 90min。所述体积百分比是指占四个组分总体积的 体积百分比。
3、 反应后处理
在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
本发明所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isotherma 1 amplication of DNA,简称LAMP)快速检测结核分歧杆菌的方法， 是利用fof DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外 引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的 六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合 成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的 茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离 子与反应溶液中的Mg^结合，产生副产物一焦磷酸镁乳白色沉淀， 即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C)条件 下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环 使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染 及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要 求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于 建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度 特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光 实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性 和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何 专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于 荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国 家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清 学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发 明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明的基因快 速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设 备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四 条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特 异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到l小 时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度 高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒 鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg"结合， 产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液 后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
具体实施例方式
实施例l试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 外引物F3: GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ ID NO:l所示； 外引物B3: GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ ID NO:2
所示；
内引物FIP: GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGT AGGCAGCCT，如SEQ ID NO:3所示；
内引物BIP: GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGG CAAGCCCT，如SEQ ID NO:4所示；(2) 购置DNA聚合酶fi^DNA聚合酶置于容器。
(3) 配制反应液反应液按每1L中含有2mmo1 dNTP、 25mmo 1 Tris-Cl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1. 25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mo1和外引物 F3/B3各0.25mol配制，置于容器。
(4) 配制裂解液1:裂解液1按每1L中含有lOmmol pH8.3的T ris-HCl、 50mmo1 KC1、 2.5mmol MgCl2、 5ml Triton X-IOO、 5ml吐 温-20和0.1g明胶配制。
(5 )配制上述裂解液2:裂解液2按lml含20mg蛋白酶K配制。
(6) 购置稳定液石蜡油，置于容器。
(7) 购置显色液SYBR Green I，置于容器。
(8) 提取阳性对照结核分歧杆菌基因组DNA，置于容器。
(9) 将上述8个容器装成试剂盒，封装。 制备工艺简述如下
1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、 将稳定液分装，抽样质检；
4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、 组装试剂盒。
实施例2试剂盒的制备反应液按每1L中含有1.6mmoldNTP、 20mmol Tris-Cl、 lOmmol 氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、lml TritonX-100、 0.8mol 甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B3各0.2mol配制，
置于容器，
裂解液1按每1L中含有20 mmol pH8.3的Tris-HCl、 100 mmol KC1、 5 mmol MgCl2、 10ml Triton X-IOO、 10ml吐温-20和0.2g明
胶配制。
显色液为EvaGreen。 其他同实施例l。
实施例3结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒的应用 1、样品处理(模板DNA提取)
(1)取痰样l 2ml，加入等体积4质量免NaOH溶液涡悬混匀， 使两者充分接触，静置30分钟至充分液化无痰丝，吸取0.5mL液化 好的样品入Eppendorf管中，10000r/min离心5分钟，弃上清液，沉 淀加生理盐水lmL。振荡洗涤沉淀后10000r/min离心5分钟。如此2
次，弃上清液，收集沉淀；
(2)于50^1裂解液1中加入0.5^1裂解液2，配置成样品裂解 液，加入上述沉淀物中，6(TC水浴裂解反应lh，煮沸15min终止反 应后，10000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。 2、环介导等温扩增技术的反应过程 (1)在20(^1反应管配制反应体系反应液22^d， fof DNA聚合酶0.5jxl (4u)，穏定液30m1，模板dna2.5(！1。
(2)将配制好的反应管于64。C恒温反应lh。 3、反应后处理
向上述反应管中加入2^1 SYBRGreenI，混匀，同时也向阳性对 照管(结核分歧杆菌基因组DNA)中加入SYBRGreenI混匀，若反
应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法序列表.txt SEQUENCE LISTING
<110> 广州华峰生物科技有限公司
<120>基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 4
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
〈211〉 17
<212〉 DNA
〈213〉 人工合成
<400> 1
ggctggtctc tggcgtt 17
〈210〉 2
<211> 20
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 2
ggcctataca agaccgagct 20
〈210〉 3
<2.11> 42
〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈400〉 3
gcctctacca gtactgcggc ttttga.gcgt agtaggcagc ct 42
<210〉 4
<211> 40
<212> 腿 <213>人工合成
<400〉 4
gttgaaccag tcgacccagc gttttaaccc ggcaagccct 40
权利要求
1. 一种结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、BstDNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，上述两对引物为外引物F3GGCTGGTCTCTGGCGTT；外引物B3GGCCTATACAAGACCGAGCT；内引物FIPGCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT；内引物BIPGTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT；每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-Cl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L裂解液1中含有10～20mmol pH8.3的Tris-HCl、50～100 mmol KCl、2.5～5mmol MgCl2、5～10ml Triton X-100、5～10ml吐温-20和0.1～0.2g明胶；上述裂解液2为蛋白酶K；上述阳性对照为结核分歧杆菌基因组DNA。
2、 根据权利要求l所述试剂盒，其特征在于所述显色液为SYBR Green域EvaGreen。
3、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-Cl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmo1硫 酸铵、lOmmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引物 FIP/BIP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
4、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L裂解液1 中含有10 mmol pH8.3的Tris-HCl、 50mmo1 KC1、 2.5mmo1 MgCl2、 5ml Triton X-IOO、 5ml吐温-20和O.lg明胶。
5、 根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述稳定液为石 蜡油。
6、 利用权利要求1所述试剂盒检测结核歧杆菌的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1) 将待测痰样液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；(2) 在裂解液1中加入裂解液2，吹打混匀后，加入上述沉淀 中，水浴裂解反应，反应结束后离心，上清即为样品模板DNA;(3) 在反应管中加入反应液38 40体积％、 Bst DNA聚合酶0. 9 1.8体积％、稳定液52 54.5体积％、样品模板DNA 4.5 9体积 。％，恒温反应；(4) 在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样 品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
7、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(1)中的液 化为加入质量百分数4 %NaOH溶液或胰酶对痰样进行液化。
8、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(2)中，水浴温度为55 6(TC，裂解反应时间为60min 90min。
9、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(3)中，恒 温反应的反应条件为温度63 65"C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、反应液、裂解液1、裂解液2、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。
文档编号C12Q1/68GK101302553SQ20081002844
公开日2008年11月12日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者刘妙琴, 曹以诚, 李心晖, 杜正平, 磊 石, 谭惠媚, 赵长臣, 洵 陈 申请人:广州华峰生物科技有限公司