基于环介导等温扩增技术的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

专利名称：基于环介导等温扩增技术的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种嗜肺军团菌基因快速诊 断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
目前对嗜肺军团菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、
形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7—2003)， 到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技 术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化学工业 出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和 灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、 生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而 直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且 与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和 自动化的方向发展。
以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实 际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要 专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光 实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，
因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术 中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快 速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确 性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最 新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等 温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)具有^艮 多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测嗜肺军团菌 的基因快速诊断试剂盒。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种检测成本 低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的 嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供上述嗜肺军团菌基因快速诊断试剂 盒的检测方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
一、本发明的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、
B"DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对
照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中 所述的两对引物为外引物F3: TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT，如SEQ ID NO: 1
所示；
外引物B3: TGGATTCCGATCGGGATG,如SEQ ID NO:2所示；
内引物FIP: GCTGTTCC ATAACTGCTC AC AAnTttttAATTTAG AGTCTTCATACGACTGA，如SEQ ID NO:3所示；
内引物BIP: TTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTT CATTGCCAGCCTG，如SEQ ID NO:4所示；
上述每lL反应液中含有1.6 2mmo1 dNTP 、 20 25mmol Tris-HCl、 10 12.5mmol氯化钾、10 12.5mmol硫酸铵、8 10mmol 硫酸镁、l 1.25ml TritonX-lOO、 0.8 lmol甜菜碱、内引物FIP/BIP 各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mol;优选的比例是每1L反应 液中含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmo1 硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜碱、内引物 FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.2511101。
上述每1L样品预处理液中含有10 20 mmol pH 8.0的Tris-HCl、 1 2 mmol EDTA和10 12ml Triton X-IOO。优选的比例是每1L样品预 处理液中含有20mmo1 Tris-HCl (pH 8.0)、 2mmo1 EDTA和12ml Triton X曙100。
上述显色液优选为荧光染料SYBR Green I或EvaGreen;
上述稳定液优选为石蜡油。 上述阳性对照为嗜肺军团菌基因组DNA。 二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；
4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、 组装试剂盒。
三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法
1、 样品处理
将待测样品经滤膜(滤膜孔径为0.22pm 0.45Pm)过滤，洗 脱后，于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均 匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA;
2、 环介导等温扩增技术反应过程
在反应管中加入反应液38 40体积％， Bst DNA聚合酶大片段 0.9 1.8体积％，稳定液52 54.5体积％，样品模板DNA 4.5 9体 积％， 63 65。C恒温反应45 90min。所述体积百分比是指占四个组 分总体积的体积百分比。
3、 反应后处理
在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显 色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
本发明的原理是利用DNA聚合酶和根据耙基因序列设计的 两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异 性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在耙标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多 环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的MgZ+结合，产生副产物——焦 磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒 温(63 65°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条 件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检 测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检 测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂 和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一 种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与P CR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术 在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技 术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而 且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试 剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结 合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2 3天，完 成鉴定报告需10 15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2 小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清 晰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 l.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反 应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的 存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增 快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4本发明的基 因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发 明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与 反应溶液中的Mg^结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼 观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高， 更加明显可靠。
具体实施例方式
实施例l试剂盒的制备
(1) 按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 夕卜弓l物F3: TCTATTGAAATAGCACITAAGCT，如SEQ ID NO:l
所示；
外引物B3: TGGATTCCGATCGGGATG，如SEQ ID NO:2所示； 内引物FIP: GCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAG
AGTCTTCATACGACTGA，如SEQ ID NO:3所示；
内引物BIP: TTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTT
CATTGCCAGCCTG，如SEQ ID NO:4所示；
(2) 购置DNA聚合酶DNApolymerase (大片段)，置于容器。
(3) 配制反应液反应液的配方按每1L溶液含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-Cl、 12.5mmo1氯化钾、12.5mmo1硫酸铵、lOmmol硫酸镁、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol 和外引物F3/B3各0.25mol配制，置于容器。
(4) 配制样品预处理液样品预处理液的配方按每1L溶液含有20 mmolTris-HCl (pH8.0) 、 2 mmol EDTA和12ml Triton X-100配制，
置于容器。
(5) 购置稳定液石蜡油，置于容器；
(6) 购置显色液SYBRGreenI，置于容器。
(7) 提取阳性对照金黄色葡萄球菌基因组DNA，置于容器。
(8) 将上述7个容器装成试剂盒，封装。 制备工艺简述如下
1、 将内引物FHVBIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、 将稳定液分装，抽样质检；
4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、 组装试剂盒。
实施例2试剂盒的制备 反应液的配方为每1L反应液中含有1.6mmo1 dNTP、 20mmo1 Tris-HCl、 lOmmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、lml Tr itonX-100、 0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mo1和外引物F3/B 3各0.2mol;样品预处理液的配方为每lL样品预处理液中含有10mmo1 pH 8.0的Tris-HCl、 lmmol EDTA和10ml Triton X-100 。
显色液为EvaGreen。 其他同实施例l。
实施例3嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒的应用
1、 样品处理(模板DNA提取)
(1) 采用无菌操作技术取水样(或沉积物、软泥等样品)约200ml， 如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心lmin去除大颗粒物质；
(2) 将经沉淀或离心的样品(上清)通过孔径0.22 u m 0.45 P m 滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱；
(3) 取5ml洗脱样品，10000ipm离心2min，获得菌体沉淀；
(4) 在上述菌体沉淀中加入lOOiil样品预处理液混合均匀，沸水中 煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清 即为样品模板DNA。
2、 环介导等温扩增技术的反应过程
1) 在200^1反应管配制反应体系反应液22^1， fof DNA聚合 酶0.5jal (4U)，模板DNA2.5^1。
2) 将配制好的反应管于64。C恒温反应lh。
3、 反应后处理
向上述PCR反应产物中加入2jxlSYBRGreenl，混匀，同时也向 阳性对照管(嗜肺军团菌基因组DNA)中加入SYBRGreenI混匀，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴 性。基于环介导等温扩增技术的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法序列表.txt SEQUENCE LISTING
<丄10〉 广州华峰生物科技有限公司
<120>基于环介导等温扩增技术的嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
<130〉
〈160〉 4
<170〉 Pateivtln version 3. 2
〈210〉 1
<211> 23
<212> D脆 〈213〉人工合成
〈400〉 1
tctattgaaa tagcacttaa get 23
<210〉 2
<211> 18
<212〉 鹏 <213>人工合成
<400> 2
tggattccga tegggatg 18
〈400〉 3
gctgttccat aactgctcac aattttttta atttagagtc ttcatacgac tga 53
〈210〉 4
<211> 48
<212> DNA 〈213〉人工合成
<400> 4
ttagaagtaa gtcg朋atgc g3gtgttttg tatttcattg ccagcctg 4:8
<210> <211〉 〈212〉 <213>
成
合
A工
权利要求
1. 一种嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，上述两对引物为外引物F3TCTATTGAAATAGCACTTAAGCT；外引物B3TGGATTCCGATCGGGATG；内引物FIPGCTGTTCCATAACTGCTCACAATTTttttAATTTAGAGTCTTCATACGACTGA；内引物BIPTTAGAAGTAAGTCGAAATGCGAGTGttttGTATTTCATTGCCAGCCTG；每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L样品预处理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；上述阳性对照为嗜肺军团菌基因组DNA。
2、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述的显色液为SYBR Green域EvaGreen。
3、 根据权利要求l所述试剂盒，其特征在于所述每1L样品预处理 、液中含有20 mmol pH 8.0的Tris- HC1、 2mmo1 EDTA和12ml TritonX-IOO。
4、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmo1 硫酸铵、lOmmol硫酸镁、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜碱、内引 物FIP/BIP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
5、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油。
6、 一种检测嗜肺军团菌的方法，其特征是使用权利要求l所述试剂盒，按下列步骤进行(1) 将待测样品经滤膜过滤，洗脱后，于离心管中离心，去上 清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA;(2) 在反应管中加入反应液38 40体积％， BstDNA聚合酶大 片段0.9 1.8体积％，稳定液52 54.5体积％，样品模板DNA4.5 9体积％，恒温反应；(3) 在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样 品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
7、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(1)中，滤 膜孔径为0.22 u m 0.45 u m。
8、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(2)中，恒 温反应的反应条件为温度63 65°C ，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明公开了嗜肺军团菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、稳定液、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。
文档编号C12Q1/04GK101302554SQ20081002844
公开日2008年11月12日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者刘妙琴, 曹以诚, 李心晖, 杜正平, 磊 石, 谭惠媚, 赵长臣, 洵 陈 申请人:广州华峰生物科技有限公司