专利名称：：日本血吸虫肌动蛋白基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肌动蛋白，特别是涉及一种日本血吸虫肌动蛋白基因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
：血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病的血吸虫有3种，g先日本血吸虫(Schistosomaj即onicum)，曼氏血吸虫(S.mansoni)和埃及血吸虫(S.haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretoryprotein,ESP)就是一类可以发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫肌动蛋白基因、其编码蛋白及应用，该肌动蛋白可成为很好的诊断标记分子。为解决上述技术问题，本发明的日本血吸虫肌动蛋白的基因，包括具有SEQIDN0.l所示的核苷酸序列。所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQIDNO.2所示序列的蛋白。本发明的日本血吸虫肌动蛋白，包括具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，该蛋白是具有SEQIDNO.l序列编码的蛋白。本发明利用蛋白质组学手段，在国际上首次分析了日本血吸虫的体外提取的ESP的组成成分。我们发现日本血吸虫的肌动蛋白(Actin)是其ESP的主要成分之一，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避方面发挥重要作用；同时，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现该蛋白的确在宿主血液中也存在，这也使它成为很好的诊断标记分子。本发明的日本血吸虫肌动蛋白作为免疫原，在制备血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选化学和其他种类药物方面的应用；作为特异性血吸虫抗原，在制备抗血吸虫抗体方面的应用；在血清学诊断方面的应用；日本血吸虫肌动蛋白的编码基因，在基因治疗方面的应用。具体实施方式—、方法1、日本血吸虫排泌蛋白的分离和鉴定实验1).日本血吸虫成虫排泌产物的制备和蛋白提取日本血吸虫成虫从感染动物体内分离出来后用1XPBS(磷酸盐缓冲液)洗2次，大约800条成虫用lmlPBS悬浮，10分钟后低速离心(500rpm)把上清吸出收集，重复10编，把上清合并。用丙酮沉淀上清中的蛋白，溶解沉淀用50mMTris-HCl(pH8.3)，5mMEDTA，lmM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)，0.5%十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)和0.5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5%SDS，超声促溶。2).日本血吸虫排泌蛋白的酶解过程排泌蛋白混合物用lOmMDTT和55mM的碘乙酰氨处理，稀释后用胰酶酶解过夜。3).日本血吸虫排泌蛋白酶解肽段的在线色谱分离和质谱鉴定酶解产生的肽混合物，用真空将溶液体积抽减到30iU。之后，每个组分的肽混合物上样到一个反相捕获柱(C18，5iim，300A，300iimi.dX5mm，LCPackings)，在20iU/min的流速下脱盐。然后这个捕获柱和一个分析用的75iimX150mmC18柱(LCPackings)相连接，肽混合物就在200nl/min的流速下，从这个柱子上洗脱进入装有ProtanaNanoES的电喷雾离子源的QSTARpulseri中。Agilent1100毛细液相系统(AgilentTechnologies)用来提供流动相A(O.5%乙酸/水)和流动相B(0.5%乙酸/乙腈)，线性梯度是60分钟内5XB到50XB，30分钟内50%B到90%B，然后是在90%B停留15分钟。在分析柱后通过一个不锈钢的两通(ValcoInstrument)连接一个10-ym直径的PicoTip纳喷雾头(NewObjective)，加上2500-3000伏的喷雾电压，以获得稳定的喷雾。MS/MS串联质谱谱图通过信息依赖的采集(IDA)和任务-循环增强来记录。在每个测定扫描中，选取3-6个信号最强、带2到3个电荷的离子，用滚动碰撞能量打碎，以获得串联质谱的信息。4).日本血吸虫排泌蛋白的软件搜索鉴定质谱搜索用的数据库，包括从11717个从公共数据库NCBI下载的日本血吸虫蛋白质序列(时间是2008年10月16日)。搜索软件是MASCOT(http:〃www.matrixscience.com/，MatrixScience)。搜索参数为最大漏切点，3个；monoisotopic;肽电荷数，+1/+2/+3;修饰，半胱氨酸carbamoylmethylation禾Pmethionine氧化。搜索结果合并后，用下列标准进行过滤筛选1.对每一个串联质谱谱图的搜索结果列表，只提取排位在第一个的结果，其他的则丢弃；2.搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，则这个肽段丢弃；3.搜索得到的肽段，长度在8个氨基酸以上的保留，小于8个氨基酸的丢弃；4.重复打到的肽段，只计算其中分值最高的，把这些肽段分值加起来，做为蛋白的得分；5.蛋白的得分超过60，就认为是可信的结果。低分的蛋白，手工检查后保留或者丢弃。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，则丢弃。同时进行反向蛋白质序列数据库的搜索。反向蛋白库是将日本血吸虫蛋白质序列反转，保持长度、组成不变。根据正向库和反向库搜索得到的结果，确定假阳性率。计算方法假阳性=2*(反向库肽段数)/(正向库肽段数+反向库肽段数)。假阳性控制在0%。2、从感染动物血清中直接分析日本血吸虫的排泌蛋白1).日本血吸虫尾蚴感染兔子，收集感染后第42天的动物血清。血清蛋白酶解后用液相色谱-质谱分析蛋白质组成。质谱数据搜索日本血吸虫的蛋白质数据库，按照上述标准筛选肽段。得到的肽段用Blast搜索兔子的基因/蛋白数据库(包括mRNA，EST，基因组测序数据等)，去掉任何匹配的肽段，保证保留下来的肽段都是血吸虫特有的。然后利用肽段，搜索得到相应的血吸虫蛋白序列。2).蛋白丰度定量分析计算每个蛋白鉴定得到的质谱图总数(Spectraco皿t，SC)，以此代表丰度高低。二、结果1)日本血吸虫体外排泌蛋白的蛋白质组学鉴定结果共鉴定出110个血吸虫蛋白。其中肌动蛋白是丰度比较高的蛋白之一，SC总数是45，肽段得分总和为1852，共鉴定到该蛋白的11种肽段(表1)，蛋白序列的覆盖率是35%。这说明，肌动蛋白是日本血吸虫成虫排泌产物中的主要的蛋白成分之一。成虫在宿主(如人)体内，其排泌产物必然释放到宿主的血液循环体系中，因此，检测血吸虫排泌产物的存在，就可以检测血吸虫感染。而排泌产物中丰度高的蛋白，最容易被检出，因此，肌动蛋白是合适的临床诊断分子，可以利用现有的普及的方法如ELISA来很方便地检测患者血样中的血吸虫特征蛋白。表1日本血吸虫肌动蛋白的在体外排泌蛋白组中的质谱鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)我们在国际上首次从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白。鉴定到actinl的4种肽段(表2)，证明了日本血吸虫的肌动蛋白的确存在于宿主动物的血清中，可以被检测到，因而可以成为血吸虫临床诊断的靶标分子。表2日本血吸虫肌动蛋白在感染动物血清中的鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3)日本血吸虫肌动蛋白的功能传统上，肌动蛋白被认为是细胞质骨架蛋白。而研究发现肌动蛋白定位在血吸虫的表皮上，而本研究发现该蛋白被血吸虫释放到宿主的血液中，说明该蛋白能与宿主的免疫系统直接接触，发送相互作用，其到调节宿主免疫的作用。棘口属的Ec即roni的吸虫的排泌蛋白中的肌动蛋白可以诱导动物的早期IgM反应，说明肌动蛋白对该虫在宿主中的早期生存发挥了一定作用。序列表〈110〉上海人类基因组研究中心〈120〉日本血吸虫肌动蛋白基因、其编码蛋白及应用〈130>NP-08-12793〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211〉1173〈212>RNA〈213〉日本血吸虫(Schistosomajaponicum)〈400〉1gcggcgttggtcatcgacaatgggtctggcctggcttcgctgg卿tgac60gctcccagagctgtgttcccgtctetcgtggg皿gacctegacatc^gg3gtgatggtg120ggcatgggtcttetgttggtgacg皿gctc3gtCg皿3Cgtggtetcctg180acccaattgaacatggcattgtgacteactgggatgatetggag皿gate240tggcatcatecattctecaacg皿ttgcgagtggctcctgagtgttgttg300accgaagccccattgaatccg皿ggcg皿tcgtgag皿皿tgacgca^tcatgtttgag360acattcaatgccccagctetgtetgtegctattc郷cggtgttgtcattgtecgcatct420ggtcgtecgactggtetegtgttggattcaggtgatggtgtcactcacacagttcctett■tetg皿ggctatgcattgcctcatgctetettgcgtctcgatctegcgggcagagatctt540acggactetctgatg皿gatcttgactgaggttttecgacg3C3gCgg皿600cgtg卿tegtccgagacatttgtgttetgttgctttggatttcgaacag660g卿tgggtecggcagcttcgagttcggcgttgg卿卿gttetgagcttcctgatggt720c皿gtgattectettggteacgagcggtttaggtgtccggaggctctcttccagcctegt780ttcttgggaatggaatcgtcggggattratgagactecttacaattctettetg皿gtgt840gacgtegatetccgte皿gatctgtecgcc皿cac3gtettgtcgggtggtegcac皿tg■tetcctggtettgctgatcgtetgcag皿gg卿t皿gtgctctggcccccagtec皿tg960aagateaagategtcgcaccacctgaacgtaaatettcagtetggattggtggttccatt1020ttggcttcattgtcaacattccagcagatgtggatctcteaacaagaatetgacgagtcc1080ggcccgagcattgttcaccgtaaatgcttcteatttgatttcattetttttgtecaaatt1140aagtttcgcatcatataatgttttccttaattc1173〈210>2〈211>360〈212>PRT〈213〉日本血吸虫(Schistosomajaponicum)〈400>2MCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQG丽GMGQKDSYVGDEAQSKRGILVT誦DMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFEIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLRGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMGTMSSSALEKSYELPDGRCPEALFQPSFLGMESSGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYANTVLSGGSTMEISALAPSTMKIKIVAPPERKYSWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDESTLKYPIEHGI60TFNAP層VA120TDYLMKILTE180QVITIGNERF240YPGIADRMQK300GPSIVHRKCF360权利要求一种日本血吸虫肌动蛋白的基因，其特征在于包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的日本血吸虫肌动蛋白的基因，其特征在于所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQIDN0.2所示序列的蛋白。3.—种日本血吸虫肌动蛋白，其特征在于包括具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。4.一种日本血吸虫肌动蛋白在制备血吸虫疫苗方面的应用。5.—种日本血吸虫肌动蛋白在筛选药物方面的应用。6.—种日本血吸虫肌动蛋白在制备抗血吸虫抗体方面的应用。7.—种日本血吸虫肌动蛋白在血清学诊断方面的应用。8.—种日本血吸虫肌动蛋白，利用其编码基因，在基因治疗方面的应用。全文摘要本发明公开了一种日本血吸虫肌动蛋白基因、其编码蛋白及应用，该基因包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；日本血吸虫肌动蛋白，包括具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，该蛋白是具有SEQIDNO.1序列编码的蛋白。本发明的日本血吸虫肌动蛋白作为免疫原，在制备血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选化学和其他种类药物方面的应用；作为特异性血吸虫抗原，在制备抗血吸虫抗体方面的应用；在血清学诊断方面的应用；日本血吸虫肌动蛋白的编码基因，在基因治疗方面的应用。文档编号C12N15/12GK101748127SQ20081004409公开日2010年6月23日申请日期2008年12月11日优先权日2008年12月11日发明者冯正,刘锋,胡薇,韩泽广申请人:上海人类基因组研究中心