专利名称：一种新型重组病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码致病病毒抗原的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组体。
背景技术：
乙型肝炎是由人乙型肝炎病毒(Human Hepatitis B virus, HBV)引起的，HBV为DNA双链病毒，主要经血液、密切接触和母婴垂直传播。不同地区，HBV的感染几率及传播方式也不尽相同。感染HBV后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬化或原发性肝细胞癌。目前，据估计，全世界乙肝带毒者约3.5亿人，亚洲地区约2. 2亿。我国约有1. 3亿人是乙肝病毒携带者，每年用于治疗肝炎的医疗费用约300-500亿元，并且多数感染发生在新生儿或儿童期，由于这一阶段发生的感染早期多无症状，急性期极难被发现，因此90%以上将发展为慢性乙肝患者。目前，对于慢性乙肝患者和乙肝抗原表面携带者来说目前尚无有效的治疗方法。有限的化学疗法虽然能在一定程度上抑制HBV复制，但却不能彻底清除体内的感染病毒。研究发现，乙肝患者的急性和慢性肝病的不同结局很大程度上是由于机体对HBV感染的免疫反应不同所致。在急性乙肝患者体内，针对HBV的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)反应是^艮活^夭的、是多位点和高度特异性的，可迅速清除感染病毒；而慢性乙肝患者和乙肝病毒健康携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，致使病毒持续存在，因此目前学术界认为纠正和克服患者体内的CTL低反应状态可能是机体清除HBV，使患者得到彻底恢复的关键。
CTL是通过什么;f几理来达到清除HBV的目的的呢？由于HBV cccDNA结构特殊，又具有长期的稳定性，最初一直认为CTL只有通过破坏和杀伤感染的肝细胞才能达到清除病毒的作用。但近年来的研究发现事实并非如此。在HBV转基因鼠模型中，病毒特异性的CTL主要是通过非细胞致病性过程来清除病毒的，只有极小一部分残存病毒的清除是通过CTL介导的细胞凋亡和细胞毒性反应来实现的，整个病毒清除过程中受损肝细胞不足1 % 。 Guidotti在HBV急性感染黑猩猩动物;漠型中也发现，在急性期，HBV DNA绝大部分被清除，而这个期间并没有肝损害、细胞凋亡及ALT升高。由此可见在HBV急性感染过程中，HBV主要是通过这种非细胞致病性机理清除的。其具体过程为HBV特异性的CTL识别感染肝细胞表面的病毒靶抗原，随即释放细胞因子，主要是IFN~y和TNF- a ,通过旁分泌机制直接作用于HBV感染肝细胞，激活肝细胞内的抗病毒分子机制。同时，这些细胞因子激活Kupffer细胞，并通过正反馈机制进一步产生更多的TNF-ct 。这种细胞因子的环境导致细胞内病毒颗粒和病毒RNA的降解。
目前市面上应用的乙肝疫苗是酵母重组乙肝疫苗，主要用于乙肝的预防，不能起到治疗乙肝的作用。蔡雄茂等，2002年，将HBV核心和前SI融合蛋白在大肠杆菌及真核进行表达。陈新春等，2003年，用乙型肝炎病毒核心抗原与前SI抗原融合蛋白诱导小鼠，使其产生免疫反应。
国外进入临床I期和国内外处于实验室阶段的治疗性乙肝疫苗都属于DNA疫苗，DNA疫苗目前存在的问题是外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变，能否引起免疫病理作用等问题尚未有确切结论，且疫苗诱发的免疫反应强度较弱。所以应用具宿主范围广、高效转导、稳定、安全、易操作等优点的腺病毒做为载体，则能避免上述缺点。
腺病毒在自然界分布广泛，在许多哺乳动物和畜类中都发现其存在。至今已分离到IOO种以上不同血清型的各种腺病毒。腺病毒是二十面体病毒壳体结构，其基因组为线性的双链DNA。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、同时高滴度重组病毒的制备较简单、容量适合装载大多数外源基因、不整合入輩巴细胞基因组等等的优点，故腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新型重组病毒载体。为达到上述目的，本发明的技术方案为 一种新型重组病毒载体，该载体包括病毒载体和一条核苷酸序列，所述核苷酸序列编码致病病毒的两个抗原的融合蛋白，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。
所述病毒栽体是腺病毒栽体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒栽体、单纯疱渗病毒载体或痘苗病毒载体。所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。
5所述核苷酸序列插入至腺病毒的El、 E2、 E3或E4区域。 所述腺病毒载体是人腺病毒载体。
所述腺病毒载体是人5型腺病毒载体、35型腺病毒载体、2型腺病毒载体或6 型腺病毒载体。
所述腺病毒载体是动物腺病毒载体。
所述致病病毒是曱型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒 或者戊型肝炎病毒。
所述核苷酸序列是编码乙型肝炎病毒抗原表位的核苷酸序列。
所述致病病毒的抗原是乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原、pol抗原或含T 细胞表位的抗原，所述核苷酸序列编码上述抗原中的两种。
所述核苷酸序列编码乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，两个抗原 的核苷酸序列可以通过一段核苷酸序列连接，也可以直接连接。
所述核苷酸序列编码乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，如SEQ ID NO: 1所示。
所述致病病毒为人乳头瘤病毒、禽流感病毒、sars病毒或者HIV病毒。 所述重组栽体还含有至少 一个免疫刺激物基因序列。
所述免疫刺激物是白细胞介素、千扰素、粒细胞集落刺激因子或者粒细胞-巨 噬细胞集落刺激因子。
上述新型重组病毒栽体在制备用于预防和治疗由致病病毒引起的疾病的药物中 的应用。
一种用上述新型重組病毒载体制备的疫苗。
本发明的新型重组腺病毒是通过如下方法获得的，是将两个或两个以上的目的 基因通过基因工程方法进行融合，然后以酶切方式插入到经改良过的腺病毒载体中 形成重组体，然后在大肠杆菌中进行扩增，经分离、提取、纯化后，转染293细胞 (人胚肾细胞)，在2 9 3细胞内包装成的类病毒颗粒。
根据上述方案，首先通过PCR扩增得到所需目的基因，将两个目的基因HBc和 HBs通过PCR扩增方法进行连接，得到带有HBc和HBs基因的新的片段。将该新得 到的目的基因片段克隆入穿梭质粒载体pDC515 (io)，通过FLP-frt重组酶系统在 293细胞中获得重组腺病毒。
乙肝核心抗原和乙肝表面抗原具有引起CTL反应和体液免疫应答的作用。用乙肝核心抗原和表面抗原做为目的基因的重组体作用于动物能引起动物体内CTL反应 及体液免疫应答。本申请所述重组腺病毒载体作用于动物后引起的CTL反应强度远 远大于乙肝核心抗原重组腺病毒载体和表面抗原重组腺病毒载体的组合，也强于单 独乙肝核心抗原的重组体，由于腺病毒〗故为栽体具有高的感染效率和高的外源基因 表达水平、不整合入靶细胞基因组等等的优点，因此注射本发明所述重组腺病毒载 体具有高度安全性。另外，用乙肝核心抗原、表面抗原和其它抗原做为目的基因的 重组腺病毒载体也能引起4艮强的CTL反应。因此，注射本发明的重组病毒载体后， 能使动物体内引起体液免疫反应和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。
图1是CS9重组腺病毒疫苗构建流程图。
图2是pDC515 ( io)质粒图谱。
图3是PBHG厶E1. 3flp质粒图谱。
图4是PCR方法^r测重组腺病毒HB-CS的电泳图片。
图5是各组小鼠注射重组腺病毒后1 、 4周CTL反应强度表(n = 3 )。
具体实施例方式
实施例1、 CS9重组腺病毒疫苗的构建
下面结合图1对CS9重组腺病毒疫苗的构建做进一步详细描述。
以下所述5型人腺病毒还可以是2型人腺病毒、6型人腺病毒、35型人腺病毒或
者动物腺病毒。
1、 编码乙型肝炎病毒表面抗原的核苷酸序列HBs的获得抽取乙肝病人血清， 从病人血清中提取乙肝病毒DNA,以提取的DNA为模板，设计引物
HBV-S-F: 5'- ATCTCAATGT GAGAGCACAAC-3'， HBV-S-R: 5'-TCAAATGTATACCCAAAGAC-3'(华大基因上海鼎安合 成)，进行PCR扩增，扩增条件为第一循环94。C变性2分钟，以后各循环94°C 变性30秒，49。C退火30秒，72。C延伸1分，共35个循环，之后72。C延伸7分钟， 得到HBs片段得，其具体序列如SEQ ID NO: 2所示。
2、 编码乙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列HBc的获得抽取乙肝病人血清，从病人血清中提取乙肝病毒DNA,以提取的DNA为模版，设计引物 HBV-C-F: 5'-GCTAGCATGGA CATTGACCCGTAT-3'， HBV-C-R: 5'-GTTGTGCTCTCACATTGAGAT-3'(华大基因上海鼎安合
成)，进行PCR扩增，扩增条件为第一循环94。C变性2分钟，以后各循环94。C
变性30秒，49'C退火30秒，72'C延伸1分，共35个循环，之后72"C延伸7分钟，
得到HBc片段，其具体序列如SEQ ID NO: 3所示。
3、 CS融合基因片段的获得先将上两步得到的HBc片段和HBs片段混合，再加 入dNTPs， rTaq酶，緩冲液和双蒸水，94。C变性2分钟，94。C变性30秒，55。C退火 30秒，72。C延伸2分， 一个循环后，再往PCR体系中加入引物HBV-C-F和HBV-S-R， 进行PCR:第一循环94。C变性2分钟，以后各循环94。C变性30秒，49。C退火30 秒，72'C延伸1. 5分，共35个循环，之后72°〇延伸7分钟。得到CS融合基因片段， 其具体序列如SEQ ID NO: 1所示。将其得到的PCR片段插入到T载体(Promega公 司)中，得到T/CS载体。
4、 腺病毒穿梭栽体PDC515/CS的获得用Nhel和Sail酶切质粒T/CS得到CS 片段；用Nhel和Sail酶切载体PDC515 ( io) (Microbix Biosystems公司)，其质 粒图语如图2所示，得到PDC515/Nhel + Sail片段，用T4DNA连接酶连接上述两个 片段，得到携带乙肝表面抗原基因HBs和核心抗原基因HBc的穿梭质粒pDC515/CS, 命名为腺病毒穿梭载体PDC515/ CS。
5、同源重组腺病毒穿梭载体PDC515/ CS与5型人腺病毒骨架载体PBHG厶 El. 3flp ( ( Microbix Biosystems 司，其质粒图i普如图 3所示，利用 Lipofectamine2000 (invitrogen)共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病 毒。共转染11-15天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗 原和乙肝表面抗原的重组腺病毒，命名为HB-CS重组腺病毒疫苗(简称为CS9)。提 取重组腺病毒DNA，PCR方法检测插入的CS序列，目的基因检测引物为引物HBV-C-F 和HBV-S-R,腺病毒载体检测引物为
E2BF : 5' -TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3',
E2BR: 5' -CATCTGAACTCAAAGCGTGG3';
PDC515F: 5' ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC 3'，
PDC515R: 5'GAC,AAA,CCA，CAA,CTA,GAA,TGC3'(华大基因上海鼎安)，对重组腺病毒进行鉴定，鉴定结果见图4:泳道1为DL2000 marker,泳道2 -4以E2BF和E2BR为引物2为阳性对照，3为样品，4为阴性对照，泳道5-7 以pDC515F和pDC515R为引物5为阳性对照，6为样品，7为阴性对照，泳道10 -12以HBV-C-F和HBV-S-R为引物IO为样品，ll为阳性对照，12为阴性对照。 同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为腺病毒疫苗 HB-CS (简称为CS9)。
实施例2、重组腺病毒生产实验 重组腺病毒扩增
培养293细胞(人胚肾细胞)，接种重组腺病毒于293细胞中进行扩增。扩增方 法为本技术领域已知的，可以参考《组织培养和分子细胞学技术》(鄂征北京出版 社)。
重组腺病毒纯化
采用离子交换柱HPLC纯化系统对重组腺病毒进行纯化。 重组腺病毒活性测定
TCID50方法测得重组腺病毒CS9的比滴度为4. 80%。 实施例3、重组腺病毒疫苗免疫小鼠实验
整合了乙肝核心抗原基因与乙肝表面抗原基因的腺病毒疫苗CS9在感染动物后 会模拟正常腺病毒感染模式，诱导免疫系统产生针对乙肝核心抗原的特异性细胞免 疫和体液免疫，当机体再次接触病原体时，通过多信号途径刺激特异性免疫记忆细 胞分泌细胞因子Y-IFN， Y-IFN已经证实具有抗病毒效果。ELISPOT实验即通过检 测y -IFN的分泌从而间接检测特异性CTL反应。重组腺病毒CS9免疫C5VBL小鼠， 同时用单独含HBc基因的重组腺病毒C7和单独含HBs基因的重组腺病毒S8 ( H和 S8的构建方法参考本申请所述重组腺病毒CS9的构建方法，此处未详细叙述)组合 (C7/S8)做为对照，于第1、 4周取其脾脏制备单个脾细胞悬液，分别以乙肝核心抗 原多肽和乙肝表面抗原多肽为体外刺激物，进行ELISPOT试验。相同条件下，看试 验组分泌Y-IFN的鼠脾细胞即形成斑点的细胞(spot forming cell, SFC )是否 比对照组显著增多。
实3佥共分三组，分别注射CS9, C7/S8和病毒保存液，每组动物注射6只C5〃BL 小鼠(雄性，6-8周龄，中山大学试验动物中心)。后腿肌肉注射100ul/只，CS9组10'。vp/小鼠，C7/S8组:C710"Vp + S810'。vp/小鼠。注射后1、 4周时，每组取3只 动物处死。
体液免疫实验摘眼球取全血，5000rpm离心10分钟后吸出上层血清，1: 2 稀释后进行ELISA实验(按上海实业科华生物技术有限公司说明书进行)，测HBV 表面抗体。结果显示，1、 4周实验组小鼠和注射C7/S8组小鼠血清抗HBV表面抗体 均为阳性，注射病毒保存液组均为阴性。即注射腺病毒后诱导了体液免疫反应，说 明本发明的腺病毒疫苗具有预防乙肝的作用。
ELISPOT实验动物处死后无菌取脾脏研磨制成单个细胞悬液，进行稀释，将 之加于预先包被并封闭好的ELISPOT板上96孔内，每孔5 x 105个脾细胞。加入乙 肝核心抗原多肽和乙肝表面抗原多肽(华大基因上海天源合成)作为刺激物。进行 ELISPOT实验具体步骤参考见U-Cytech试剂盒说明书。
试验组同时携带乙肝核心抗原表位和表面抗原表位，在诱导CTL反应上具有优 势。由图5结果可知试验组的CTL反应强度远远高于对照组。
由上可知小鼠注射重组腺病毒CS9后在体外经特异性多肽刺激后能释放y -IFN，从而证明重组腺病毒CS9可以诱导机体产生特异性细胞免疫反应，当激活的 细胞再次遇到相同病原体时，就会释放y-IFN等细胞因子发挥抗病毒作用。
所以说本发明的重組腺病毒CS9可以诱导小鼠产生HBV核心抗原特异性CTL反 应和HBV表面抗原特异性CTL反应，从而提示重组腺病毒CS9对乙肝具有更好的治 疗作用。
10<formula>formula see original document page 11</formula>gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct ctacttccag gaacaacaac taccagtacg 900 ggaccatgca agacctgcac gattcctgct caaggaacct ctatgtttcc ctcttgttgc 960 tgtacaaaac cttcggaegg aaactgcact tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc 1020 gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagcgcca 1080 tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg1140 tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc ttgagtccct ttttacctct attaccaatt 1200 ttcttttgtc tttgggtata catttga 1227
<210> 2
<211> 688
<212> DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400> 2
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<213>乙型肝炎病毒
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56权利要求
1. 一种新型重组病毒载体，其特征在于该载体包括病毒载体和一条核苷酸序列，所述核苷酸序列编码致病病毒的两个抗原的融合蛋白，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。
2. 根据权利要求1所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述病毒载体是腺病毒 载体、腺相关病毒载体、SV4G病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱渗病毒载体 或疰苗病毒载体。
3. 根据权利要求2所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是缺失 性腺病毒载体。
4. 根据权利要求3所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述核苦酸序列插入至 腺病毒的E1、 E2、 E3或E4区域。
5. 根据权利要求4所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是人腺 病毒栽体。
6. 根据权利要求5所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是人5 型腺病毒载体、35型腺病毒栽体、2型腺病毒载体或6型腺病毒载体。
7. 根据权利要求2所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是动物 腺病毒载体。
8. 根据权利要求1所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述致病病毒是曱型肝 炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或者戊型肝炎病毒。
9. 根据权利要求8所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述核苷酸序列是编码 乙型肝炎病毒抗原表位的核苷酸序列。
10. 根据权利要求9所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述致病病毒的抗原是 乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原、pol抗原或含T细胞表位，所述核苷酸序 列编码上述抗原中的两种。
11. 根据权利要求10所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述核苷酸序列编码 乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，两个抗原的核苷酸序列可以通过 一段核脊酸序列连接，也可以直接连接。
12. 根据权利要求10所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述核脊酸序列编码 乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，如SEQ ID NO: 1所示。
13. 根据权利要求1所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述致病病毒为人乳头 瘤病毒、禽流感病毒、sars病毒或者HIV病毒。
14. 根据权利要求1所述的新型重组病毒载体，其特征在于重组载体还含有至少一 个免疫刺激物基因序列。
15. 根据权利要求14所述的新型重组病毒载体，其特征在于所述免疫刺激物是白 细胞介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
16. 权利要求1 - 15任一项所述的新型重组病毒载体在制备用于预防和治疗由致病 病毒引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种新型重组病毒载体，该载体包括病毒载体和一条核苷酸序列，所述核苷酸序列编码致病病毒的两个抗原的融合蛋白，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。同时注射本发明所述重组腺病毒载体具有高度安全性。
文档编号C12N15/869GK101497891SQ200810065359
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者刘俊云, 周向军, 唐云霞, 进 李, 华 秦, 军 郭 申请人:深圳市源兴生物医药科技有限公司