专利名称：：人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种人工改造合成的杀虫基因以及其构建的植物表达载体及其在抗虫转基因植物研制方面的应用。
背景技术：
：植物生长过程中易遭受虫害，每年因虫害造成的农作物损失量十分巨大。为防治植物虫害发生，需大量喷施农药,长期大量使用化学农药，可导致害虫抗药性增强，并且会大量杀伤其天敌，生态失衡，步入恶性循环。利用基因工程手段使植物获得抗虫性，目前已被广泛采用，用于植物抗虫基因工程的基因主要包括(l)苏云金芽孑包杆菌(_6flc/〃w"/wn'"g/em7'&份)杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因如a7"c,Oj7F，Oj246等；(2)蛋白酶抑制剂(proteinaseinhibitors,PIS)基因如3工豆(w'wem^)月夷蛋白酶卞卩制剂(cowpeatrysininhibitor,CpTI)基因Q77等；(3)淀粉酶抑制剂(amylaseinhibitor,AI)基因如菜豆(尸/w"o/"i"vw/gar的a-淀粉酶抑制剂基因等；(4)植物外源凝集素(lectin)类基因如雪花莲外源凝集素(Ga/a"Awsm'vfltoaggulutinin,GNA)基因g"a等；(5)昆虫特异性神经毒素(neurotoxin)基因如蝎毒素基因5""&/7>等。在生产上利用最成功的基因主要有说杀虫晶体蛋白基因和QTI基因。其中应用最广泛的是价杀虫晶体蛋白基因，即苏云金芽孢杆菌(B)内毒素晶体蛋白基因，克隆于苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌(5)是1901年发现的一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌，已知其是可产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的多种伴孢结晶蛋白质。这种杀虫蛋白质已经发现了五十多大类，三百多种。Bt杀虫蛋白在昆虫消化道内消化酶的作用下，蛋白被水解，释放出约6070kDa抗蛋白酶的活性毒素分子。活性毒素分子可与肠道上皮细胞纹缘膜上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道上皮细胞的离子、渗透压平衡遭到破坏，最终导致昆虫死亡。由于其杀虫的专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。自80年代后期以来，许多实验室已将说杀虫基因导入到不同植物组织的细胞中，并已在被转化的细胞和植物中表达了这种来源与微生物的杀虫基因，使转基因植物具有抗虫性。不同种类Bt杀虫蛋白杀虫谱可能不同，目前人们已经发现了对鳞翅目、鞘翅目、双翅目据有毒性的杀晶体蛋白的大小及性状也不同。在1995年无脊推病理学会(SocietyforInvertebratePathology,SIP)年会上专门成立了由Crickmore等人组成的Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会，提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系，将杀虫基因分为17类，36亚类(Crickmoreeta1.1995)，2008年增补为54类,101亚类(http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil一Crickmore/Bt/)。其中Oj24a对棉铃虫、红铃虫、玉米螟、烟芽夜蛾、粉紋夜蛾、藜豆夜蛾、稻纵巻叶螟、大豆夜蛾、热带家蚊等害虫均具有杀虫效果。由于遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，如果直接将昆虫的基因直接转化至植物中，在一定程度上会影响其蛋白的表达，利用偏爱密码子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密码子合成基因，可以增加蛋白表达量。另外历杀虫晶体蛋白的N端小段氨基酸残基在毒蛋白活化过程中被切除是杀虫活性所必须的。
发明内容为提高转基因植物的抗虫性，本发明的目的在于提供一种在植物中能高效表达的杀虫基因。一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQIDNO:1所示的核苦酸序列。一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2所示的核苷酸序列与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列相比，5'端在起始密码子后少84个碱基。所述核苦酸序列采用了植物偏爱性密码子。所述核苦酸序列采用了棉花偏爱性密码子。本发明的第二个目的在于提供一种含有上述人工改造合成的杀虫基因并可在植物中表达该杀虫基因编码的杀虫蛋白质。一种人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质CmCry2Aa杀虫蛋白，由SEQIDNO:l所示杀虫基因编码，具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，由633个氨基酸残基组成。一种人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质CmlCry2Aa杀虫蛋白，由SEQIDNO:2所示杀虫基因编码，具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，由605个氨基酸残基组成，CmlCry2Aa杀虫蛋白与CmCry2Aa杀虫蛋白相比N端缺失28个氨基酸，二者都具有杀虫活性。一种含有上述人工改造合成的杀虫基因的植物表达载体。用含有上述人工改造合成的杀虫基因植物表达载体转化的具有杀虫能力的植物细胞。用含有上述人工改造合成的杀虫基因植物表达载体转化的植物组织、器官及植林。本发明的第三个目的在于提供人工改造合成的杀虫基因在培育抗虫植物品种中的应用，尤其是在培育抗虫棉花中的应用。本发明利用棉花优化密码子合成了Ow07Z4a以及Cm70724c杀虫蛋白基因，并分别构建了植物表达载体。转基因烟草鉴定结果表明所设计合成的Cw(37Z4a及Ow/Oy24a杀虫基因对棉铃虫具有极显著的抗性，缺失说杀虫蛋白的N端氨基酸可简化杀虫蛋白质的活化，在保持其杀虫活性的同时，扩大其杀虫谱。图l是CwOyZ4aD7-;G五M质粒图语；图2是Ow07Z4flD2-pt/C57质粒图谱；图3是CwCo;Z4aZ^-pi7C57质粒图语；图4是CmQ724aZ)2ZX-;f/C57质粒图语；图5是CwO少24a-;[/C57质粒图谱；图6是OwO少24fl杀虫基因植物表达载体M7-A4i-35S-CwCo/Z4fl的构建流程图7是CwQ724a杀虫基因植物表达载体M7-A4i-35S-OMO少24aPC/扩增鉴定图；图8是CwOj24a杀虫基因植物表达载体M7-A4i-"S-OwO_y24a酶切鉴定图；图9是质粒似/-^47-355-0072^转化烟草抗虫性鉴定图；图10是CmQ724a杀虫基因植物表达栽体M7-P"cw-A^77/-3>55f-0770y24fl的构建流程图1l是CwO;;Z4a杀虫基因植物表达载体M/-JPwos'-M577/-"1S-Cm07Z4a的酶切鉴定图12是Cw/Co;2v4fl-;MD7S质粒图谱；图13a、b是C附/Oy24a植物表达载体MZ-Prnw-A^TTZ-^S-CwJOyZ^的构建流程图14是质粒jW-Z^oj-A^TY/^M-O^OyZ^转化烟草抗虫性鉴定图；图15是OwOy2^基因原核表达栽体CmCo^4a-/7￡n0a的构建流程图；图16是CmO少24fl基因原核表达载体OwQ7Z4a-;^r邓a酶切鉴定图；图17是Cw70少24a基因原核表达栽体Cw7O_yZ4a-;^n0a的构建流程图；图18是Ow70j24fl基因原核表达载体C附70724a-;^rMa酶切鉴定图；图19是CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫蛋白的原核表达的蛋白电泳图；图20是获得转基因棉花植;昧的情况说明。具体实施方式主要试剂配方LB培养基胰蛋白胨10g/1,酵母粉5g/1,氯化钠10g/l,PH:7.0-7.2,固体培养基加1.5%琼脂粉抗生素Kan(卡那霉素)50mg/ml,Chl(氯霉素)34mg/ml1MTris-Hcl(PH6.8):121.2gTris溶于1L水中，用浓盐酸调节PH值到6.8,高压灭菌1.5MTris-Hcl(PH8.8):181.7gTris溶于1L中，用浓盐酸调节PH值到8.8,高压灭菌30%Acrylamide:丙烯酰铵290g、N,N-亚曱双丙烯酰铵10g定容到1L超纯水中0.1mol/lIPTG:0.25g的IPTG溶解于10mL的ddH20中1MDTT:3.09gDTT溶于20ML的0.01M醋酸钠(PH5.2)中，分装成小份一20'C保存10%过硫酸铵lg过硫酸铵加水定容至10ml,分装成小份一20。C保存1xSDS-PAGE凝胶上样緩冲液50mmol/lTris-HCL(PH6.8)、2。/。SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、100mmol/lDTT(临用时加)5xTris-GlycineBuffer:Tris15.1g、Glycine94gSDS5.0g定容到lL水中考马斯亮蓝染色液0.1%考马斯亮蓝R-250、25%异丙醇、10%冰醋酸定容到1L水中考马斯亮蓝脱色液100ml醋酸、50ml乙醇定容到1L水中实施例1CwOy24a杀虫基因的合成1.根据Oy2^杀虫蛋白的氨基酸序列，根据棉花密码子用法，分结构域分别设计合成了构建CwOj;24a杀虫基因的3个基因片段。基因合成委托北京奥科公司完成。根据设计，合成的OwQ724a杀虫基因的密码子用法如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注上表中各密码子所编码氨基酸符号后的三个数字分别表示密码子数量/在蛋白中的出现频率(％。)/密码子用法(％)结构域I(DomainI)DI基因片段BamHI-ATG-DI-Apal,其具体序列如SEQNOID:5所示。结构域II(DomainII)DII基因片段Apal-DII-SspI,其具体序列如SEQNOID:6所示。结构域III(DomainIII)DIII基因片段Xbal-HpaI-DIII-SacI，其具体序列如SEQNOID:7所示。On07Z4a杀虫基因的三个结构域基因编码片段Dl、D2、D3人工合成后，分别克隆到载体pG五M和/f/C57中，质粒分别命名为CmCryZ4aD7-pG￡M,质粒图语如图1所示；CmO少Z4flD2-/L/C57,质粒图语如图2所示和CwOjZ^aDJ-pC/C57,质粒图谱如图3所示。2.OwOj24fl杀虫基因的克隆拼接首先将CwO少Z4fli^-;7t/C57中的Hpal-D3-Sacl片段克隆到CmCo/24flD2-;t/C57中的Sspl和Sacl位点之间，一平端一粘端连接，构建得到载体质粒Cw0724aZ)2.D3-/t/C57，质粒图傳如图4所示，然后将CwOjZ^Z^-pGEM中的Sphl-ApalDl片段克隆到该载体中，得到质粒CmCry2Aa-pUC57,质粒图谱如图5所示，完成CFMCw07Z4fl杀虫基因的拼接，CwOj24fl杀虫基因的核香酸序列如SEQIDNO:1所示。与天然的Oy24"(genebank登陆号AY496458:http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=45685585)基因对应部分的核苷酸序列对比，其同源性为75.97%。其编码蛋白质氨基酸序列的同源性为99.95%。实施例2C附Oy24a杀虫基因植物表达载体ikO-A4/-35S-CmO^Z4a的构建带有完整CwO;;24"杀虫基因的质粒CwCo/24fl-/^C57,进一步按照如图6所述程序构建植物表达载体M7-5^-35S-Cw07^4a。植物表达栽体M7-」R4U5S-OwOyZ4a构建过程中筛选鉴定的PCR鉴定结果及酶切鉴定结果分别如图7和图8所示，图7中1、2和3泳道代表以1、2和3号克隆子为模板扩增出了目标条带，"+"代表以质粒JW-A4i-35S-CwOy24fl为模板扩增出目标条带(阳性对照)，"-"代表以水为模板未扩增出目标条带(阴性对照)；图8中1泳道为限制性内切酶XbaI+Sacl切质粒M7-A4及-7)ms-G^，切下GUS，大约1.8Kbp左右，2，3，4,5和6泳道为限制性内切酶Xbal+SacI切1,2,3,5,6克隆子，切下来35S+Cw0724a,大约2.7Kbp左右。结果表明l、2、3号克隆均为正确克隆。实施例3转On0^24fl杀虫基因烟草获得采用农杆菌介导叶盘法转化烟草(本领域科研人员周知的方法)，经PPT生根筛选，获得抗性植林46抹，提取抗性烟草叶片总DNA,进行PCR鉴定，筛选出27株阳性植抹，并进行抗棉铃虫飼虫试验，每叶接5头初孵幼虫，三天后结果如图9所示，1为未转CFMCw07Z4a杀虫基因烟草叶片，2、3和4分别为转化CwO_yZ4a杀虫基因烟草叶片，结果表明所合成Cw0724a杀虫基因抗棉铃虫效果非常突出。经调查，棉铃虫平均校正死亡率93.3%。实施例4iV』W//为选择标记的CmOj24a杀虫基因植物表达载体^-尸/105-7\^77/-355-00724(|的构建鉴于OKOjZ4a杀虫基因具有理想的棉铃虫毒杀效果，进一步进行了棉花的农杆菌转化。由于原Cw0^240植物表达栽体M7-A4i-35S-On0724a中选择标记基因万ar不利于棉花的农杆菌转化体系(草丁膦对棉花细胞的再生分化有抑制作用)，设计了克隆路线，获得A/pf//为选择标记基因的CwCo;24a杀虫基因植物表达载体M7-尸"os-iV尸77W:W-CwCo;24a,从通过PCR获得的^户///基因经克隆后经测序验证，确信所扩增7印///基因核苷酸序列正确。整个克隆流程如图10。最终载体似7-户"0^^>77/-155^附0724"经酶切鉴定，结果如图11所示，1,2泳道为EcoRI切M/^ww-MT/W^-OnCo^Ifl的克隆子7,22的结果，能切下1.7Kbp左右的带，卩日性；3泳道为EcoRI切/5wo;y-A^77/-r"ay-jPaS>作为阳性对照，切下1.7Kbp左右的带；4,5泳道为Ncol+Kpnl切M7-Pww-A^P77/-J5S-On07Z4a的克隆子7，22的结果，能切下1.4Kbp左右的带，为阳性；6，7泳道为PstI切M7-JPww-iV尸77/-^5(S-Cwa724a的克隆子7，22的结果，能切下3Kbp左右的带，阳性；证明所构建以A(pr//为选择标记基因的OwQ724a植物表达载体完全正确。实施例5CmJC/y24a杀虫基因的克隆及植物表达载体的构建及其功能鉴定(1)Cm7Q7Z4a杀虫基因的克隆根据Cm07Z4a杀虫蛋白的分子结构，杀虫基因N端存在长度为29个氨基酸的Coli结构片段，位于结构域la-螺旋l的前端。4艮据杀虫蛋白结构功能关系，该氨基酸序列为原毒素活化时需要被昆虫消化道胰蛋白酶水解去除。经DNAman软件分析，在第29、30氨基酸之间的确存在胰蛋白酶识别切割位点。如果杀虫蛋白进入昆虫消化道后如不能切除该段多肽，杀虫活性降低。因此，设计突变引物，将CmCV724a的5'端28个氨基酸去除，使表达出的蛋白直接为活性蛋白，对于扩大杀虫谱(昆虫不能正确活化原毒素时)和提高杀虫效率有利(活化效率不是100%时)。将其命名为Cm/Co^4a。C附/0;;Z4a5端引物加BamHI位点，3端引物加SacI位点，以便下一步的克隆。所设计的引物如下引物12Aa5:5'-GGGATCCATGTCTTTGGACACTATCCA-3'引物22Aa3:5'-GAGCTCTTAGTACAAGGGT-3'以质粒Cm0724fl-/C/C57为模板，扩增出的目的条带为1820bp。将扩增出的Cw70j24a克隆到pMD7S-r上，命名为Cm/OjZ4a-;MDM，其质粒图谱如图12所示。(2)C附7Q7Z4a植物表达载体^^-户"0-7\^77/-"5-07072^的构建为在植物中验证Cw/Co;2^的杀虫功能，设计构建以]\^//为选择标记基因的Cm70y24a植物表达栽体M7-Pww-7W577/-35S-Cm/Oiy24a,构建流程如图13a和b所示。(3)Ow7OyZ4a在烟草中的抗棉铃虫鉴定采用农杆菌介导叶盘法转化烟草(本领域科研人员周知的方法)，经卡那霉素生根筛选，获得抗性植林25林，提取抗性烟草叶片总DNA，进行PCR鉴定，筛选出22林阳性植抹，并进行抗棉铃虫饲虫试验，每叶接5头初孵幼虫，三天后部分结果如图14所示，1、2为未转Cm/CV少24a杀虫基因烟草叶片(对照试验)，3和4分别为转化CFMOw07Z4a杀虫基因烟草叶片，结果表明所合成Cw/Oj24fl杀虫基因抗棉铃虫效果与OwO72力fl杀虫基因基本相当。经调查，棉铃虫平均校正死亡率87.7%。统计学分析表明差异不显著，与设计的预期结果一致。实施例6(Qz7Cryi^a及070j24fl杀虫基因原核表达栽体的构建及原核表达(1)CwO少Z4a基因原核表达载体CmO7Z4a-/7￡n0a的构建CmCry24a基因原核表达载体CwO7Z^-;五r3Oa的构建流程如图15所示，其酶切鉴定结果如图16所示，"B+S"表示BamHI+Sacl切1号CwO7Z^-;五n0阳性克隆子质粒，能切下完整的C附OyZ4a，1.9Kbp左右，大小符合；"+"表示BamHI+Sacl切Ow0724a-;7f/C57质粒做为正对照，也能切下完整的OwCV_v24a,1.9Kbp左右，大小符合；"B"BgII单酶双切CwO少Z4fl-;^n0的阳性克隆子质粒，能切下1.3Kbp左右的带，大小符合，可见此构建正确。(2)Cm70^Z4a基因原核表达载体On7O7Z4a-p￡r30a的构建G^OyZ4G基因原核表达载体Cw7O7Z4fl-;五r30fl的构建流程如图17所示，其酶切鉴定结果如图18所示，1,DNALadder;2,BamHI+Sad切4号CmlCry2Aa-pET30a阳性克隆子质粒，能切下完整的On70;;24a，1.8Kbp左右，大小符合；3,BamHI+Sacl切1号Cw70^24a-;jE7^a阳性克隆子质粒，能切下完整的Cw/C>724fl,L8Kbp左右，大小符合(载体酶切不充分)；4,Kpnl切4号0^0724a-p￡"^阳性克隆子质粒，能切下1.78Kbp左右基因片段，大小符合；5，Kpnl切1号Cw/0724a-;￡n^阳性克隆子质粒，能切下1.78Kbp左右的基因片段，大小符合。可见此构建正确。(3)CwC/7Z4a及Cw70724a基因的原核表达制备感受态大肠杆菌细胞在LB培养基平板上活化E.coliRosetta(DE3)菌抹，挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37。C摇菌过夜，取此菌液500^1加入到100mlLB液体培养基中，37。C培养2-2.5hr，有大量絮状菌体出现时，冰浴15min，4°C、6000r/m离心5min，弃上清，加入1/5体积预冷的氯化4丐，重悬菌体，4°C、6000r/m离心5min,再加1/3体积的氯化4丐，重悬菌体，冰浴30min,4'C、6000r/m离心5min,弃上清，吸千，加入1/25体积氯化钙重悬菌体，以lOO^il菌液分装，-7(TC保存。分别将空原核表达载体p五7^0a义C附O7Z4"-;^n0a及Cw/O7Z4a-p￡n0a原核表达载体转入菌抹E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中，具体方法为从-70。C冰箱中拿出E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上把lOlil连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，再在42。C水浴中热激90sec,迅速再冰浴2min，再加入350plLB空白液体培养基，37。C下摇动培养40min,再将此管菌体全部加入到含有50pg/mlKan的固体培养基中，均勻涂布平板，待液体完全被吸收后，37。C倒置培养12~16小时。挑取单菌落接种到含有50pg/mlKan和34|ag/mlChl抗生素的5mL液体培养基中37。C过夜培养，取100pl接种到含有50吗/mlKan和3化g/mlChl抗生素的10mL液体培养基中，37。C培养2hr左右，OD6000.6时加入IPTG至终浓度lmmo1〃1,37。C下诱导表达。诱导表达4hr后，各取lmL菌液，10000r/m离心5min,收集菌体，加入100pl含有10Ommol/1DTT的1xSDS-PAGE凝胶上样緩沖液重悬，取40pl在IOO'C煮5min，取20^1上样，进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE分析法参考《分子克隆》，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%,先以80v电压电泳，待溴酚蓝指示剂进入到分离胶后，加大电压到110v，大约lhr30min待指示剂移动到胶底部时，结束电泳，用考马斯亮蓝染色液染色过夜，再用脱色液脱色直至蛋白条带清晰为止。图19为CwOjZ4a及On/0;/Z4a基因的原核表达SDS-PAGE电泳结果，1和2分别为经大肠杆菌表达的CmlCry2Aa蛋白及CmCry2Aa蛋白，可见大小在约66kD附近，CmlCry2Aa目的蛋白较CmCry2Aa蛋白略小(pET30a载体上HISTag基因150bp,编码50个氨基酸)；3为转化/五nOa空栽体的阴性对照试验；5为蛋白质Marker。实施例7利用CmC^24fl及Ow/Oj24a杀虫基因植物表达栽体获得转基因棉花分别通过花粉管通道法和农杆菌介导法将CwOj24a或0^QjZ4a杀虫基因植物表达载体转化棉花，均获得了转基因棉花。花粉管通道法导入是利用微量注射器将DNA溶麻注入棉花受精子房，并收获种子进行筛选鉴定而获得转基因棉花。具体操作程序为1)选择次日将开放的花蕾进行自交，并用毛绳标记；2)在开花后20~24h左右，即开花次日，选择果枝和花位專交好的幼子房作为导入对象，摘除或剥去花瓣，抹平花柱，使用50pL微量进样器作为微注射工具，一般用右手持微量注射器，左手轻扶摘除花瓣后的幼子房，从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度的约三分之二处，并后退至约三分之一处，轻轻操作微量注射器，将DNA溶液推入受精子房中。每朵花注射基因片段浓度为0.01lag/pl,每朵花注射5pi;3)未铃柄基部涂抹40ppm的赤霉素溶液，以减轻幼铃脱落；4)挂牌标记已经转基因的棉花幼铃；5)收获种子，田间密植，根据选择标记基因种类进行筛选鉴定，获得转基因棉花植抹。农杆菌介导法是本领域科研人员熟知的植物遗传转化方法。具体操作程序为1.菌林培养将所构建的杀虫基因植物表达载体电激转化到农杆菌菌抹LBA4404中，农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(kanamycin,km)50mg/L、利福平(rifampicin,rif)25mg/L的LB或YEB液体培养基中。28。C振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养46h,将菌液稀释至OD600值0.3~0.35。2.无菌苗制备(1)棉花种子用硫酸(H2S04)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾千后用70%乙醇对种子进行表面消毒1min,再用10%~15%过氧化氢(11202)处理2~4h,用无菌水冲洗23次；(2)在无菌水中浸泡18-24h,待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培i基(l/2MS+琼脂6g/L,pH6.8)中；(3)25。C28。C光培养35d时备用。3.棉花外植体与农杆菌的共培养取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，浸入稀释好的菌液中5~10min,然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2.4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L,pH5.0,表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22。C25。C共培养2天。4.诱导愈伤组织及抗性愈伤组织的筛选(1)愈伤组织的诱导经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+Km50~100mg/L+Cef500mg/L+葡萄糖30g/L,pH5.8),在常规条件下(25。C)培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。(2)抗性愈伤组织的检测无菌条件下挑取愈伤组织少许进行选择标记基因甲///的ELISA检测或报告基因g^的检测，检测结果为阳性的愈伤组织继续继代，非阳性的愈伤组织淘汰。通过对"^//或基因表达的检测，获得棉花抗性愈伤组织的频率为50°/。~76%。5.愈伤组织的增殖继代诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，常规条件下(25。C)培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤組织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。6.愈伤组织的分化及转基因苗移栽愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH4+、且KN03加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L十天门冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91~1.35g/L+Gelrite2.0~3.0g/L+葡萄糖20~30g/L，pH5.8),进一步分化成胚状体，胚状体长成为小植林后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉抹根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足营养液。栽好的再生棉苗放入控温22。C、控湿80~85%的人工培养箱中5~7d，再在温室中培养1020d后移栽到土盆或大田中。利用上述方法，分别将CwD724a及Cw7Qy24fl杀虫基因植物表达载体导入棉花中获得了转基因棉花。图20为获得转基因棉花植抹的情况说明，l为利用花粉管通道法将#/-/3/05-yV尸777-J必-C历7C/丁iMa载体转化棉花后，利用1000ppm卡那霉i在温室筛选转基因植抹的情况；2为非转基因植林叶片卡那霉素处理后变黄；3为筛选获得的转基因植抹，叶片经卡那霉素处理后不变色；4为非转基因植抹叶片50ppm草丁磷处理后萎缩受害情况；5为利用花粉管通道法将C/z7Cryi^a杀虫基因植物表达载体#7-^y-J5^-(QzOy^a转化棉花后，筛选到的转基因植抹，利用50ppm草丁磷处理后叶片不受害。6为利用农杆菌介导法将C历&r2^杀虫基因植物表达载体#/-尸/305-AP77/-M5"-CfflCry^Ia转入棉花后获得的尚未移栽的抗卡那霉素转基因棉花植林。SEQUENCELISTING<110〉创世纪转基因技术有限公司<120>人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用<160>7<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>l卯2<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaataacgttcttaattctggtagaactaccatttgtgatgcttataacgtggttgca60catgatcctttctcatttgaacacaagtctttggacactatccaaaaggagtggatggaa120tggaaaaggacagatcattcactttatgttgctcctgtggttggaactgtctcttccttc180ttgcttaagaaagttggttctcttattggaaagaggatcttgtcagaactttggggtatt240atctttccttctggttcaaccaatcttatgcaagacattcttagagagactgaacagttc300ttgaaccaaaggttgaatacagatactcttgctagagttaacgctgaacttattggattg360caagccaatattagagagttcaatcagcaagttgataactttcttaatcctactcaaaac420ccagttcctcttagcattacttcttcagtgaatacaatgcagcaacttttcttgaacaga480cttcctcaattccag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