专利名称：一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因，这个酶的特殊在 于缺失蔗糖水解的逆反应，该基因编码的蛋白质可用于蔗糖的降解。
背景技术：
蔗糖作为植物中通过光合作用产生的糖类物质，是一种含量丰富的生物质，
全球蔗糖的年产量超过了 l亿吨。蔗糖是由a-D-葡萄糖和D-果糖通过l， 2糖苷键组成的二糖，该二糖分解而成的单糖长期以来作为发酵工业中的碳源 而被利用，特别是水解发酵产酒精工业的应用。
在自然界中，蔗糖被细菌分解利用主要是经过两个途径，不同的微生物使 用不同的途径。 一个是PTS途径，如芽孢杆菌属、梭菌属等微生物使用这样的 途径；另一个是蔗糖渗透酶途径，如双歧杆菌属，肠膜明串珠菌属等菌使用这 个途径。PTS途径通过一个称为phosphoenolpy匿ate-dependent phosphotransferase system把蔗糖磷酸化后转运入细胞膜内，磷酸化的蔗糖再被 磷酸蔗糖水解酶水解成6—磷酸葡萄糖和果糖。而蔗糖渗透途径通过蔗糖渗透 酶把蔗糖运输到细胞内，然后由蔗糖磷酸化酶把蔗糖水解成l一磷酸葡萄糖和 果糖，l一磷酸葡萄糖跟着被转化成6—磷酸葡萄糖。6 —磷酸葡萄糖和果糖进 入微生物的糖酵解发酵途径得到有机醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化 工产品(S. J. Reid， V. R. Abratt. 2005. Sucrose utilization in bacteria: geneticorganization and regulation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:312-321)。蔗糖7JC角军酶 类(磷酸蔗糖水解酶、蔗糖磷酸化酶等)是降解蔗糖代谢途径的第一个酶，也 是微生物蔗糖代谢途径中的关键酶之一，是决定蔗糖发酵时间的最主要的因素 之一。因此寻找新的蔗糖水解酶用于构建新的更适合工业化生产各种化工产品 的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而縮短发酵生 产时间，对于降低直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要 的意义。
蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶 由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基 酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families) (Davies G.， Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859; Henrissat B., Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696)。根据碳水化合物活 性酶数据库(http:〃www.cazy.org/fam/acc—GH.html)上所列糖基水解酶类的最新 清单，目前糖基水解酶类有112个家族。蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶类家族 13。糖基水解酶家族13的糖基水解酶属于以"保留"(retaining)作用方式进行 水解反应，这样的水解作用方式具有水解作用的逆反应，这个逆反应可以把葡 萄糖基转移到受体上形成多糖，这个就是转糖苷作用。
蔗糖磷酸化酶催化蔗糖水解成1一磷酸葡萄糖和果糖。这个催化反应是个可 逆反应在有l一磷酸葡萄糖和果糖存在的条件下，蔗糖磷酸化酶催化逆反应 消耗1—磷酸葡萄糖和果糖生成蔗糖(E. J. Vandamme, J. V. Loo, L. Machtelinckx, A. D. Laporte. 1987. Microbial sucrose phosphorylase: fermentation process, properties, and biotechnical application. Adv. Appl. Micro. 12:163-201 )。 可逆反应 的反应结果是，在反应混合物中，蔗糖、l一磷酸葡萄糖和果糖的量形成动态平 衡，逆反应的存在使正向反应(蔗糖水解)无法进行完全。而人工缺失逆反应使反应产物无法逆向生成反应底物，从而可以使蔗糖的水解彻底进行。
虽然己有研究报告分析和研究蔗糖磷酸化酶在细菌降解利用蔗糖的过程中
所起的重要作用(E. J. Luesink， J. D. Marugg, O. P. Kuipers, W. M. Vos. 1999. Characterization of the divergent sacBK and sac^T operons, involved in sucrose utilization by /actococcws /ac"s. J. Bacterio. 181(6): 1924-1926; B. Kullin, V.R. Abratt， S. J. Reid. 2006. A functional analysis of the /owgwm cscj
and scrP genes in sucrose utilization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:975-981)， 并 且也有研究者研究了不同的蔗糖磷酸化酶水解蔗糖的逆反应-转糖苷作用的作 用方式(L. A. Broek， E. L. Boxtel, R. P. Kievit, R.Verhoef， G. Beldman， A. G. Voragen. 2004. Physico-chemical and transglucosylation properties of recombinant sucrose phosphorylase from 5zy do6acfen.ww ado/ascew/^ DSM20083. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:219-227)。但是目前所发现的蔗糖磷酸化酶都具有催化 l-磷酸葡萄糖和果糖等单糖(如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)进 行转糖苷反应的能力，目前也没有发现任何成功的人工缺失蔗糖磷酸化酶逆反 应的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应 用，所述蔗糖磷酸化酶没有蔗糖水解的逆反应，也没有和各种单糖(阿拉伯糖、 果糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)的转糖苷作用。
本发明通过以下技术方案在到上述目的
一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，所述基因具有SEQ ID NO: 1核苷酸序列或 其功能等同变异体。
所述功能等同变异体为SEQ ID N0:1的核苷酸序列的突变形式，突变形式 包括缺失、无义、插入、错义。所述的基因所编码的蔗糖磷酸化酶，其具有如SEQIDNO: 2所述的氨基酸 序列，由501个氨基酸组成。
一种表达载体，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因。
一种宿主细胞，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因的原核细胞或真核细胞。 所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和对含蔗糖材料处理中的应用。 一种编码蔗糖磷酸化酶的基因^gx (SEQIDN0: 1)，通过分子改造蔗糖磷 酸化酶的基因(GenBank序列号FJ472846)而得到，具体是通过在 "rn;^w分子上加入一段人工设计的核苷酸序列，改造得到一个新的蔗糖磷酸化 酶。
SEQ ID N0: 2的蛋白质是基因^，gx编码的蔗糖酶产物Spgx，由501个氨 基酸组成。
基因sp^y在大肠杆菌中表达的重组产物Spgx能降解蔗糖生成l一磷酸葡 萄糖和果糖。
本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。 本发明的有益效果和突出的实质性特点在于
1、 通过对一个磷酸蔗糖酶进行DNA分子改造，获得了新的基因。这个新的 基因所编码的蛋白质具有水解蔗糖生成l一磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺 失了逆向反应，不能把l一磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同时也缺失了对 各种单糖的转糖苷作用。获得的新的基因可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主 菌。
2、 本发明所提供的蔗糖磷酸化酶基因，在蔗糖的降解中具有广泛的用途。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作详细描述实施例中所用材料包括大肠杆菌(五"/^nV^"co/z')株系XU-blue (购自 TaKaRa公司)；载体为购自Intrivogen公司的表达载体pSE380;购自Stratagene 公司的基因突变试剂盒(QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit，目录号 200521);购自Intrivogen公司的NI-NTA蛋白质组氨酸纯化介质；购自TaKaRa、 MBI的限制性内切酶、修饰酶和购自Sigma公司的各种糖等试剂。
1) w;wpa^基因的克隆
用正向引物
ATTGCC-3，(包含一个Afw"I酶切位点和一个6xHis标签在5，末端)和反向引物, 5'-CACAAGCTTCGATGGAGCGCCGGCATCGGC -3，(包含一个///"dill酶切位 点在5'端)进行PCR扩增。扩增产物用Miml和///mil11进行双酶切然后连接到 pSE380表达载体中。
2) 明^基因的获得
^gx基因是根据"附/ a^基因序列信息进行设计改造。使用正向引物
AGCTG-3，)和反向引物(5'-GAACGTCAGCGTGGCCT GGCTGGTTTCGCCGCGCCAGCGAAGCCGGATTTG-3，)进行PCR， PCR反应 程序第一步95°C 2分钟；第二步进行30个循环，循环为98°C 1分钟，46°C 50 秒，72°C 6分钟；第三步72。C 10分钟。PCR产物使用1 ^LD;wI在37。C酶切 一个小时，然后转化XL10-Gold感受态细胞(CaCl2化学法转化)。转化产物克 隆送交大连宝生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。
3) 蔗糖磷酸化酶基因spgx的表达和纯化
将含有质粒pSE-^ gx的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20 mL含氨苄 青霉素(100pg/mL)的LB培养基中，37。C振荡培养，待00600为0.6时，力口
7入IPTG (终浓度为0.5mmol/L)、 D-山梨醇(终浓度为100 mmol/L)和甜菜碱 (终浓度为2.5mmol/L)， 20'C诱导20小时。11000转/分离心3分钟，收集菌 体，用4mL裂解缓冲液(50mmol/LNaH2PO4， 300 mmol/L NaCl， 10mmol/L咪 唑，pH8.0)重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000转/分离心10分钟，取上清 进行后面的蛋白质纯化。按每4 mL上清液加入1 mL 50°/。的NI-NTA胶体，在4°C 用200转/分摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加lmL冲洗缓冲 液(50mmol/LNaH2PO4， 300 mmol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子 里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2P04， 300mmol/LNaCl， 250 mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱蛋白质。收集洗 脱的蛋白质溶液，并用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证。 4)蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖酶活的测定和转糖苷酶活的测试
蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖反应取10 pL蔗糖磷酸化酶Spgx纯化物，与
1%蔗糖溶液(50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0))在500 pL的反应体系中37。C作
用1小时。蔗糖磷酸化酶Spgx转糖苷反应测试取10 )iL蔗糖磷酸化酶Spgx纯化
物加入含有l-磷酸葡萄糖[2% (w/v)]和不同的受体糖(阿拉伯糖、果糖、半乳
糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)[5%(w/v)]的磷酸缓冲液(50mmol/L,pH7.0)在
37'C放置12个小时。反应时间到后，所有反应在10(TC加热10分钟。蔗糖的水解
能力和转糖苷活性用薄层层析色谱法进行检测，薄层层析是在正丁醇/乙酸/水
(2:1:1， v/v)的展层体系中进行，层析板用溶解在甲醇中的硫酸(50% (v/v))喷
射并在11(TC加热10分钟。序列表
〈110〉广西大学
〈120〉一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用 〈160〉 2
<170〉 Patentln Version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1506
〈212〉 DNA
〈213>人工序列
<220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (1)…(1506)
〈223〉
〈400〉 1
atgaaaaata aggttcagct tattgcctat gtcgetccgta tttccggagg aggtttccgc 60 ^gctccatg cgcc3ttaac agggccgctg gcggaaattt tcggaggagc gcatcttctg 120 ccgtttttca ctcccatcga tggtgcggat gccggattcg atcccagcga tcacacgcag 180 gtggatccac gtcttggaac ctgggacgat gtccgcattc tgggcggcgc aatxgaactg 240 gtcgcggatc tgattgtgaa tcatgtttcc tcatcatctc cgcagtttat cgattattcg 300 aagaagggga gcgattccct gtatgcgggg atgtttctaa cctatgaccg tgtttttccc 360 gagggcgcgc gcgaggcgga cattctgagg atttaccggc cgcgtcccac gcttcctttc 420 agtcctgtaa cgctgtcgtc gagagaaaga aagttattat ggactacgtt taatccggag 480 caggtggaca tcgatgtccg ccatccgg犯gcggaagcgt atctgcattc gattctcaaa 540 aaatttcagg cggcgggaat cagaa/tgata cggctggacg ctgtcgggta tgcgatcaag 600 aaaccgggcg ccagctgttt cstga^ttccg g犯accttcg acttcatcgc cgaactgacc 660 ga犯aagccc gcgca/ttggg aatagaagtt ttagttgaaa ttcacagcca ttacaggaag 720 cagatcgaaa tcgcccgcca ggtggactgg gtctacgatt ttgccttgcc gccgctggtg 780 ttgcacgctc tttttgcctc cgatcctcat cctttggcgc aatggctttc catcagtccc 840 cgcaacgcgg tgacagttct tgacacgcac gacggcatcg gcgtgatcga tgtgggcgcc 900 gatgcggagg ggaatxccgg acttctgtct ccggccgcta tcgacagcct ggtcgagacg %0 attcactcca gaagccaggg acagagccgg gaggcgaccg gcgcggccgc caataatctg 1020 gatctttatc aggtgaactg caccttcctg gacgcgcttg gagggagaga gcccgattat 1080 ctgatcgccc gcgccctcca gttttttgcg ccgggaattc cgcaggtcta ttatgtcggc 1140 ctcctgggag gaaccaatga catggacctt ctcggccgga gcggagtcgg ccgggacatc 1200 aaccgccatt attacacgga tgctgaaatc gatgcggcgc tggcgcgccc tctggtgcgg 1260 acgctgatcg cgttgattcg gcttcggaat acgcacccgg cattcgctgg ggagtttgat 1320 gtgtcggttc ctgctgcaac gcaaatccgg cttcgctggc gcggcgaaac cagccaggcc 1380 acgctgacgt tcgaacactg gattgagctg catgtggact tgtccattcc aaaggcttcc 1440 ataacgggta caggcattca tcctataact attccaggcg ccgccgatgc cggcgctcca 1500 tcgtga 1506<210〉 2 <211> 501 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈400> 2
Met Lys Asn Lys Val Gin Leu lie Ala Tyr VaJ Asp Arg lie Ser
15 10 15 Gly Gly Gly Phe Arg Lys Leu His Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu
16 20 25 30 Ala Glu lie Phe Gly Gly Ala His Leu Leu Pro Phe Phe Thr Pro 31 35 40 45 lie Asp Giy Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Asp His Thr Gin 46 50 55 60 Val Asp Pro Arg Leu Gly Thr Trp Asp Asp Val Arg lie Leu Gly 61 65 70 75 Gly Ala lie Glu Leu Val Ala Asp Leu lie Val Asn His Val Ser 76 80 85 90 Ser Ser Ser Pro Gin Phe lie Asp Tyr Ser Lys Lys Gly Ser Asp 91 95 100 105 Ser Leu Tyr Ala Gly Met Phe Leu Thr Tyr Asp Arg Val Phe Pro 106 110 115 120 Glu Gly Ala Arg Glu Ala Asp lie Leu Arg lie Tyr Arg Pro Arg 121 125 130 135 Pro Thr Leu Pro Phe Ser Pro Val Thr Leu Ser Ser Arg Glu Arg 136 140 145 150 Lys Leu Leu Trp Thr Thr Phe Asn Pro Glu Gin Val Asp lie Asp 151 155 160 165 Val Arg His Pro Glu Ala Glu Ala Tyr Leu His Ser lie Leu Lys 166 170 175 180 Lys Phe Gin Ala Ala Gly lie Arg Met lie Arg Leu Asp Ala Val 181 185 190 195 Gly Tyr Ala lie Lys Lys Pro Gly Ala Ser Cys Phe Met lie Pro 196 200 205 210 Glu Thr Phe Asp Phe lie Ala Glu Leu Thr Glu Lys Ala Arg Ala 211 215 220 225 Leu Gly lie Glu Val Leu Val Glu lie His Ser His Tyr Arg Lys 226 230 235 240 Gin lie Glu lie Ala Arg Gin Val Asp Trp Val Tyr Asp Phe Ala 241 245 250 255 Leu Pro Pro Leu Val Leu His Ala Leu Phe Ala Ser Asp Pro His 256 260 265 270 Pro Leu Ala Gin Trp Leu Ser lie Ser Pro Arg Asn Ala Val Thr 271 275 280 285 Val Leu Asp Thr His Asp Gly lie Gly Val lie Asp Val Gly Ala 286 2%295 300
10Asp Ala 301
Ser Leu 316
Glu Ala 330
Asn Cys 346
Leu lie 361
Val Tyr 376
Leu Gly 391
Thr Asp 406
Thr Leu 421
Ala Gly 436
Leu Arg 451
His Trp 466
lie Thr 481
Asp Ala 496
Glu Val Thr Thr Ala Tyr Arg Ala lie Glu Trp lie Gly Gly
Gly Glu Gly Phe Arg Val Ser Glu Ala Phe Arg Glu Thr Ala
Asn 305 Thr 320 Ala 335 Leu 350 Ala 365 Gly 380 Gly 395 lie 410 Leu 425 Asp 440 Gly 455 Leu 470 Gly 485 Pro 500
Pro
lie
Ala
Asp
Leu
Leu
Val
Asp
lie
Val
Glu
His
lie
Ser
Gly His Ala Ala Gin Leu Gly Ala Arg Ser Thr Val His
Leu Ser Asn Leu Phe Gly Arg Ala Leu Val Ser Asp Pro
Leu Arg Asn Gly Phe Gly Asp Leu Arg Pro Gin Leu lie
Ser 310 Ser 325 Leu 340 Gly 355 Ala 370 Thr 385 lie 400 Ala 415 Asn 430 Ala 445 Ala 460 Ser 475 Thr 490
Pro Gin Asp Arg Pro Asn Asn Arg Thr Ala Thr lie lie
Ala Gly Leu Glu Gly Asp Arg Pro His Thr Leu Pro Pro
Ala Gin Tyr Pro lie Met His Leu Pro Gin Thr Lys Gly
lie
Ser
Gin
Asp
Pro
Asp
Tyr
Val
Ala
lie
Phe
Ala
Ala
Asp 315 Arg 330 Val 345 Tyr 360 Gin 375 Leu 390 Tyr 405 Arg 420 Phe 435 Arg 450 Glu 465 Ser ■ Ala 49权利要求
1、一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO1核苷酸序列或其功能等同变异体。
2、 根据权利要求l所述的一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所 述功能等同变异体为SEQ ID Mhl的核苷酸序列的突变形式，突变形式包括缺 失、无义、插入、错义。
3、 根据权利要求1所述的基因所编码的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，其具 有如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列，由501个氨基酸组成。
4、 一种表达载体，其特征在于它含有权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因。
5、 一种宿主细胞，其特征在于它含有权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基 因的原核细胞或真核细胞。
6、 权利要求3所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和对含蔗糖材料处理中的应用。
全文摘要
一种编码蔗糖磷酸化酶的基因spgx，含有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其功能等同变异体。它是通过对一个磷酸蔗糖酶进行DNA分子改造而得到。所述基因所编码的蛋白质具有水解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺失了逆向反应，不能把1-磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同时也缺失了对各种单糖的转糖苷作用。获得的新的基因可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主菌，在蔗糖的降解中具有广泛的用途。
文档编号C12N1/15GK101608185SQ20081007398
公开日2009年12月23日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者杜丽琴, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学