专利名称：使用基因工程菌生产d(-)-酒石酸或其盐的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列、编码所述酶的核
苦酸序列、表达所述酶的重组孩i生物，以及使用所述的酶和/或重组纟鼓生物由 顺式环氧琥珀酸或其盐生产D(-)-酒石酸或其盐的方法。
背景技术：
D(-)-酒石酸，又名(2S，3S)-2,3-二羟丁烷-l，4-二羧酸，是天然L(+)-酒石酸 的同型异构体，在自然界中极少存在，在制药行业它主要被用作手性合成的 手性源及拆分剂。目前D(-)-酒石酸的需求量正在逐年递增，迫切需要提高产 量，以满足国内外市场的需求。
到目前为止，D(-)-酒石酸的生产方法主要有三种(1)利用化学拆分剂 将DL-酒石酸拆分为L(+)-酒石酸和D(-)-酒石酸的化学拆分法。如Lola等 (Chinese J Chem Eng 2002, 10(2):244-248)以 L(-)隱a-曱千基胺 (L(-)-a-methylbenzyl amine)为拆分剂实现了将DL-酒石酸分离制得L(+)-酒石 酸和D(-)-酒石酸。不过这类手性拆分剂往往价格昂贵， 一次拆分后对映体的 光学纯度和得率均较低，且后续分离纯化工艺复杂，导致其生产成本居高不 下；(2)利用特殊微生物将DL-酒石酸中的L(+)-酒石酸耗竭而得到D(-)-酒石 酸的生物拆分法。如日本未经审查的专利申请(JP申请号24490， 1975)报道的 利用气杆菌属的菌种04era6acfer平)，Sato等(US Patent 4904589, 1990; EP 0311835B1, 1993)利用假单胞菌属的菌种CPsewfifomowo^/7.)、隐球菌属的菌种 (Oj^ptococciw平)、丝孑包酵母属的菌种(7Hc/zospora" s/ . )和克雷伯氏菌属的菌 种(K/eZmW/a平)，JP-63245693 (1988)利用假单胞菌属的菌种等微生物对DL-酒石酸中的L(+)-酒石酸进行选择性同化。不过该方法的原理决定了从原料 DL-酒石酸到产物D(-)-酒石酸的理论得率最高只有50%,从而使该方法的制 备成本较高；(3)利用微生物所分泌表达的顺式环氧琥珀酸水解酶 (c红-epoxysuccinate hydrolase, ESH)将顺式环氧琥珀酸或其盐催化水解为D(-)-酒石酸或其盐的生物转化法。如Yamagishi等(JP-08245497, 1996; Ann N Y
4Acad Sci 1996, 799: 784-785)利用恶臭假单胞菌(尸化^fowo"似/ w"&) MCI3037， Asai等(JP-2000-295992， 2000)利用产碱杆菌属菌种(^/￡^//^"^平) MCI3611, Li等(FEMS Microbiol Lett, 2007, 267: 214-220)利用博德特氏菌属 的菌种(SoWefe〃a 1-3将顺式环氧琥珀酸转化为D(-)-酒石酸。 一般认为， 生物转化法生产D(-)-酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯 度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点，不仅克服了前述两种方法 存在的缺陷，且大幅降低了生产成本，因此釆用ESH酶的生物转化法制备 D(-)-酒石酸将成为D(-)-酒石酸生产技术的发展方向。然而，由于微生物体内 固有的酶系统非常复杂，ESH酶的表达量不高，其活性亦受到多种胞内外因 素的多重制约，导致D(-)-酒石酸生产效率低下。利用基因工程技术构建具有 ESH酶编码基因的基因工程菌，实现ESH酶的高效表达将成为生物转化法工 业生产D(-)-酒石酸的关^:。
发明内容
本发明涉及如下方面
(1) 一种顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其由来源于博德特氏菌(SoWefe〃a sp.)的多核苷酸编码，其分子量约为32kDa;
(2) (1)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其在pH6.5、 M。C的条件下具有 最高的酶活力，在pH 6.5-8.5、 30-50 。C条件下酶活力达到最高酶活力的70% 以上；
(3) (l)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其通过一种重组;微生物菌抹的胞内 表达而获得；
(4) (l)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其中所述的重组微生物菌抹为一种 细菌或真菌；
(5) (1)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有50%以上的同源性；
(6) (5)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有70%以上的同源性；
(7) (6)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列与SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有90%以上的同源性；
(8) (l)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于所述多肽包含全部或部
5分SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性；
(9) (1H8)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的多核苷酸；
(10) (9)的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:6所示的核香酸序列；
(11) (10)的多核苷酸，其由SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成；
(12) —种载体，其包含(9)-(ll)的核苷酸序列，和任选的一个或多个来源 于同源或异源微生物的调控序列；
(13) —种重组微生物菌抹，其表达(l)-(8)的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽；
(14) (13)的重组微生物菌抹，其表达的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽是由 (9)-( 11)的多核香酸编码的；
(15) (13)-(14)的重组微生物菌抹，其用(12)的载体转化；
(16) —种生产D(-)-酒石酸或其盐的方法，其包括使用(l)-(8)的顺式环氧 琥珀酸水解酶多肽或由(9)-(1 l)的多核苷酸编码的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽 与顺式环氧琥珀酸或其盐反应；
(17) —种生产D(-)-酒石酸或其盐的方法，其包括如下步骤
(a) 在合适的培养基中培养(13)-(15)的重组微生物菌抹；
(b) 将步骤(a)中得到的重组微生物菌抹的细胞、细胞抽提物或无细胞抽 提物或由所述微生物菌抹纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶固定在固体支持物上 或包埋在固定载体中；
(c) 将步骤(b)中得到的制备物与顺式环氧琥珀酸或其盐在适于水解的条 件下反应以生产D(-)-酒石酸或其盐；和
(d) 任选地重复利用上述固定或包埋的酶和/或细胞。
发明详述
本发明涉及一种用于编码一种顺式环氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，其 来源于分离纯化的博德特氏菌(5oWete〃a sp.)，优选为具有中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物保藏中心馆藏号CGMCCNo. 2075的微生物。
本发明涉及的编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列(基因组 DNA、 cDNA或RNA)，与SEQ ID NO:6所示核香酸序列具有50%以上，优 选为70%以上，更优选为90%以上的同源性。
本发明涉及的编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列含有全部 SEQ ID NO:6所示序列的核苷酸序列或含有部分SEQ ID NO:6所示序列的核香酸序列。
本发明涉及的"含有部分SEQIDNO:6所示序列的核苷酸序列"是指该 序列含有超过100个与SEQIDNO:6所示序列中的核苷酸相同的核苷酸，亦 指其编码的蛋白具有与由全部SEQ ID NO:6所示序列编码的蛋白(即SEQ ID NO:7的完整氨基酸序列)相似的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。
本发明的"含有部分SEQIDNO:6所示序列的核苷酸序列"编码的蛋白 具有与由全部SEQ ID NO:6所示序列编码的蛋白(即SEQ ID NO:7)相似的顺 式环氧琥珀酸水解酶活力，优选具有SEQ ID NO:7 80%以上的顺式环氧琥珀 酸水解酶活力，优选具有SEQ ID NO:7 100%的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。
本发明提供一种重组核苷酸序列，其含有前述编码顺式环氧琥珀酸水解 酶多肽的核苷酸序列，且邻接有一个或多个、来源于同源或异源微生物的调 控序列。
本发明所述调控序列，其包括选自启动子序列、分泌信号序列、终止信 号序列等调控序列中的 一种或多种。
本发明涉及一种含有前述编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列 的载体，其任选地还包含一个或多个来源于同源或异源微生物的调控序列。
本发明所述"载体"系指所有可用于将核苷酸序列转导或转染进入宿主 细胞的生物化学构架。本发明涉及的载体可为质粒、病毒、噬菌粒、脂质体、 阳离子嚢泡中的一种或几种。上述载体中可以包含一个或多个前述的调控序 列。本发明的载体优选为质粒，如pET系列、pGEX系列、pQE系列、pPR0EX 系列等。
本发明涉及的宿主细胞，优选为一种重组宿主细胞，其由本发明所述核 苷酸序列或载体经转化(如氯化钙法、硫酸镁法、高压电穿孔法等)而来。
"本发明所述核苷酸序列或载体经转化而来的宿主细胞"，系指该宿主本 身没有前述的编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的核苷S吏序列或载体，而是经 过转化后，使得宿主带有该核苷酸序列或载体。
上述宿主菌能表达前述编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列或 载体，并且产生前述核普酸序列或载体编码的氨基酸序列。本发明涉及的前 述核普酸序列能整合到所选宿主的基因组中，或以游离型载体的形式存在于 前述宿主细^<中。
为了便利起见，本发明涉及的重组宿主细胞包括微生物，优选为细菌和
7真菌，包括酵母。上述重组宿主细胞经改造优选后，能高水平表达顺式环氧 琥珀酸水解酶。
上述"高水平表达"是在前述重组宿主细胞中，通过相邻调控序列控制 前述核苷酸序列来实现过量表达。
本发明还涉及分离纯化后得到的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列， 其由前述分离纯化后的核苷酸编码，并(或)由前述重组宿主细胞表达。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶具有较强的温度稳定性，50 。C保温30 分钟后仍剩有70°/。以上的活力，其在30-50 。C，优选为35-45 。C有较高的活 力(最高酶活的75%以上)。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶具有较强的pH稳定性，在pH4.6-9.0， 优选为pH 5.0-8.0，更优选为pH 6.0-7.0之间放置30分钟后仍剩有90%以上 的活力，其在pH 6.0-8.5，优选为pH 6.0-7.0之间有较高的活力(最高酶活的 70%以上)。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶，其分子量在25-35 kDa，优选为约32 kDa (理论值为32.4779 kDa)。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列或其多肽由前述重组宿主细 胞胞外或胞内表达和(或)分泌表达。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸 序列具有50%以上，优选为70%以上，更优选为90%以上的同源性。
本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列具有SEQ ID NO:7所示氨基 酸序列的全部或部分(50个以上，优选100个以上的氨基酸)，其顺式环氧琥 珀酸水解酶活力至少为完整氨基酸序列SEQ ID NO:7的80%以上，优选为 95%以上。即，可将本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列部分缺失 或将部分序列插入其中，但仍可维持其活力。本发明的顺式环氧琥珀酸水解 酶或其部分序列的分子量约32kDa或更低或更高。
本发明涉及的顺式环氧琥珀酸水解酶可通过无争议的酶实-验鉴定，比如 将顺式环氧琥珀酸或其盐水解成D(-)-酒石酸或其盐。在合适的培养基中培养 孩吏生物并产酶。用该培养物或分离该培养物中的孩i生物细胞，并测其酶活力。
在合适的培养中诱导野生型微生物或本发明所述的重组细胞产顺式环氧 琥珀酸水解酶，通过熟知的方法如柱层析，分离出目的顺式环氧琥珀酸水解 酶，检测酶氨基S臾序列的"活性部位，，，并从上述野生型微生物或重组细胞中获得编码顺式环氧琥珀酸水解酶的DNA序列。
编码顺式环氧琥珀酸水解酶的DNA序列，通过从《效生物中純化出的顺式 环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和GenBank中登录号为E50984的序列获得。
本发明中，通过纯化出的顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和 GenBank中登录号为E50984的序列设计引物，经过PCR技术，将约0.9 kb 含顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的PCR产物插入pUCm-T载体，并将该质 粒命名为pUCm-T-ESH。整个插入片段的DNA序列通过所属领域的技术人员 熟知的测序技术检测。
设计含AWeI和5am//1限制性内切酶位点的引物，通过PCR技术，得 到含顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的PCR产物，并用7V&I和限 制性内切酶消化该PCR产物，并将该酶切后的片4爻插入pET22b(+)载体相应 的限制性酶切位点处，将该质粒命名为pET22b-ESH。整个插入片l殳的DNA 序列通过术所属领域技术人员熟知的测序技术检测。
上述构建好的表达载体在大肠杆菌宿主中表达。含pET22b-ESH质粒的 上述大肠杆菌宿主培养在含相应抗生素的合适培养基(比如LB培养基)中，使 pET22b-ESH质粒能持续的存在于宿主细胞中，然后收集上述细胞并测定顺式 环氧琥珀酸水解酶活力。本发明中顺式环氧琥珀酸水解酶基因并不仅限于在 大肠杆菌中表达。本发明中编码顺式环氧琥珀酸水解酶的DNA片段能很便利 地在细菌或真菌，包括酵母中表达。为了使上述基因能在细菌、真菌以及酵 母中表达，编码顺式环氧琥珀酸水解酶的DNA序列可以通过控制与其相邻的 DNA序列(如启动子、终止子、上游激活序列等)使得该基因在所选宿主中最 终得以(过量)表达。
编码顺式环氧琥珀酸水解酶的DNA序列通过恰当的修饰，可以使顺式环 氧琥珀酸水解酶分泌(胞外表达)在宿主细胞培养基中。这种修饰通常可通过插 入编码？ 1导序列的DNA序列来实现。该引导序列在所选宿主中通过分泌机制 使得顺式环氧琥珀酸水解酶得以分泌表达并在，在宿主培养基中得以复性。
本发明提供了表达顺式环氧琥珀酸水解酶的宿主的培养条件(比如培养 基、温度等)。
本发明提供一种利用本发明涉及的重组宿主细胞或本发明涉及的顺式环 氧琥珀酸水解酶氨基酸序列来水解一种顺式环氧琥珀酸或其盐。本发明所涉 及的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸与各种阳离子形成的盐，阳离子包括且不仅限于铵离子、钾离子、钠离子、镁离子和4丐离子等。
本发明涉及的酶可以下列形式应用可直接利用透析或未透析培养的细 胞；该酶可作为纯化的蛋白或细胞抽提物(即经过一次或多次离心提取步骤后 得到的宿主细胞的部分物质)。本发明涉及的酶能以上述任何形式与其它酶以 上述任何形式联合应用。除此之外，顺式环氧琥珀酸水解酶在宿主细胞表达 后分泌到其胞外的培养基中，并在培养基中复性。亦即，该酶制剂可与(或不 与)一种或多种其它酶联合并以粗酶制剂或部分(或完全)纯酶制剂的形式应 用。
上述细胞、细胞抽提物、无细胞抽提物或纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶 能通过任何简便的方法固定在固体支持物上(比如层析柱等)或包埋在固定 载体中(如采用卡拉胶包埋等)，使其能持续水解具有环氧基的底物，并使得 上述酶制剂(细胞、细胞抽提物、无细胞抽提物或纯化的顺式环氧琥珀酸水 解酶)能重复利用。
本发明提供了 一种利用本发明所述的基因工程菌生产D(-)-酒石酸或其盐 的方法。在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中加入本发明所述的基因工程菌细胞， 在适当的温度下进行酶促反应，获得D(-)-酒石酸或其盐。其中，顺式环氧琥 珀酸或其盐的摩尔浓度为0.1~2 mol/L,优选为0.5~1.5 mol/L,更优选为0.8 1.2 mol/L;反应温度为10 50 。C,优选为25~40 。C，更优选为32~40 。C;顺式 环氧琥珀酸或其盐溶液的pH值为4.5~9.5，优选为6.0~8.5，更优选为6.0 7.0。
本发明提供了 一种利用细胞固定化技术制备本发明所述的基因工程菌固 定化细胞，并用于生产D(-)-酒石酸或其盐的方法。其中，顺式环氧琥珀酸或 其盐的摩尔浓度为0.1-2 mol/L，优选为0.5~1.5 mol/L，更优选为0.8~1.2 mol/L;反应温度为10-50 。C，优选为25~40 。C,更优选为32-40 。C;顺式 环氧琥珀酸或其盐溶液的pH值为4.5~9.5,优选为6.0-8.5，更优选为6.0 7.0。
下面通过实施例的方式进一 步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说 明的目的，而并非限制本发明的范围。
具体实施例方式
实施例1顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化 1.顺式环氧琥珀酸水解酶活性的分离纯化
博德特氏菌BK-52 (5wr/efe〃a sp. BK-52)保存于BK-1斜面培养基，该培养基配方为0.5°/。葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.25%酵母膏，2%琼 脂，pH7.0。从斜面培养基上接种博德特氏菌BK-52至BK-2种子培养基中， 30。C振荡培养24h后，转接于BK-3发酵培养基中，用顺式环氧琥珀酸盐30 。C振荡诱导36 h,使其产顺式环氧琥珀酸水解酶。该BK-2种子培养基配方 为0.2%酵母提取物，1%葡萄糖，0.2%硫酸铵，0.1。/。三7jc磷酸氬二钟，0.05% 七水硫S吏镁，0.001。/。七水硫酸亚铁，pH7.0。该BK-3发酵培养基配方为1% 顺式环氧琥珀S吏钠，0.2%酵母提取物，1°/。葡萄糖，0.2%硫酸铵，0.1%三水磷 酸氢二钾，0.05。/。七水硫酸镁，0.001。/。七水硫酸亚铁，pH7.0。离心收集细胞 并于-20 。C保存备用。
将上述冷冻的细胞用0.01 mol/L磷酸钾緩冲液悬浮，于冰浴中超声20 min, 8000 rpm离心30 min, q欠集上'J青液1。 )7Jc浴中力口石克酉臾4妄于上'J青液1中至 50%饱和度，10000 rpm离心20min，收集上清液2。然后在上清液2中加石克 酸铵至80%饱和度后，4 。C静置过夜，10000 rpm离心20 min，收集沉淀。 沉淀用预冷的0.1 mol/L磷酸钾緩冲液溶解，4 。C于0.01 mol/L磷酸钾緩冲 液中透析48 h,期间更换3-4次透析液。透析后的酶液用PEG20000浓缩， 浓缩液过Phenyl-Sepharose柱(2.6 cm i.d. x 50 cm),并用0.01 mol/L磷酸钾緩 冲液(pH8.0)洗脱。先用500mL的洗脱液洗去非结合的蛋白，接着用1000 mL含0-0.35 mol/L氯化钠的磷酸钾緩冲液梯度洗脱结合的蛋白，流速为1 mL/min。收集具酶活性的流出液，PEG20000浓缩，将浓缩液过Q-Sepharose 柱(2.6 cm i.d. x 50 cm),用0.01 mol/L磷酸钾緩冲液(pH8.0 )洗脱，流速为1 mL/min。收集具酶活性的流出液，并用PEG20000浓缩，将浓缩液过MonoQ HR 5/5柱，并用0.01 mol/L磷酸钾緩冲液(pH8.0 )洗脱，流速为0.2 mL/min。 收集具酶活性的流出液，并用PEG20000浓缩。该过程重复三次，耳又部分重 复三次后的收集液，跑12%的十二烷基;5克酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考 马斯亮蓝R250染色，观察蛋白条带的单一性及其分子量。
结果显示，纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶在十二烷基-危酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳胶中条带单一，并且其分子量约为32kDa。
2.顺式环氧琥珀酸水解酶活性的4佥测
取约1.0 g湿细胞，生理盐水洗两次，用10 ml 1 mol/L的顺式环氧琥珀 酸钠(pH8.0)为底物悬浮，37。C反应lh后，测定反应液中酒石酸的含量。
ii酶活单位定义为在上述反应条件下，1.0 g湿细胞1 h产生1 pmol酒石酸
所需的酶量。
反应液中酒石酸含量的检测方法如下取2.5 ml 1%的偏钒酸铵于一25 ml 的容量瓶中，加适量的上述反应液后，再加1 ml lmol/L的硫酸，用蒸馏水定 容至25ml，混匀后测480nm处的吸光值，并根据制定的标准曲线计算反应 液中酒石酸的含量。
为了快速定量检测可溶性酵液中顺式环氧琥珀酸水解酶的活力，其检测 方法如下在3.9 ml 0.1 mol/L磷酸钾緩冲液(pH8.0)中加入1.0 ml 1 mol/L的 顺式环氧琥珀酸钠底物，37。C保温5min后，加入0.1 ml酶液并在37 。C反 应20min,取适量上述反应液，测定其中酒石酸的含量。
实施例2顺式环氧琥珀酸水解酶N末端氨基酸序列的检测 顺式环氧琥珀酸水解酶N末端氨基酸序列通过常用的方法检测，其方法 如下将上述分离纯化后得到的顺式环氧琥珀酸水解酶跑十二烷基硫酸钠聚 丙烯酰胺凝胶电泳后，通过Western杂交后转移PVDF膜上。该膜用考马斯 亮蓝染色，切割顺式环氧琥珀酸水解酶对应的条带并回收，然后用蛋白测序 仪(Applied Biosystems Procise 492 cLC)测其N末端序列。测序结果显示，其 N末端氨基酸序列为MTRTKLILEARI (SEQ ID NO:l)。
实施例3顺式环氧琥珀酸水解酶基因的获得
才艮据上述顺式环氧琥珀酸水解酶N末端序列(SEQ ID NO:l)和GenBank 中登录号为E50984的序列设计如下引物5，-ATGACNYGNACNAARXTN-3， (SEQ ID NO:2)和5，-CTAGTTGCTAATACCCAG-3， (SEQ ID NO:3)，其中Y代 表A或C， R代表A或G, X代表T或C， N代表A、 C、 G、 T四种碱基的 任何一个。
博德特氏菌BK-52 30 。C培养过夜，离心收集细胞，用EZ-10柱式基因 组DNA抽提试剂盒(Bio Basic Inc.)抽取博德特氏菌BK-52的基因组DNA。以 基因组DNA为模板，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为引物，通过常用的PCR 技术获得一段约0.9 kb的片段。其PCR程序为94 °C预热5 min后，94 °C 50 s, 40。C30s, 72。Clmin， 30个循环，最后72 °C延伸10min。 PCR产 物用Wizard PCR片段回收试剂盒(Promega)回收纯化后，与pUCm-T (Sangon)
12载体连接，并按照Chung (Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86: 2172-2175)等人 的方法转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，并测序(TakaraBiotech),克隆质 粒命名为pUCm-T。
实施例4顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆
根据上述测序结果设计引物，分别为 5 ，-GCCATATGATGACTCGAACCAAGTTGATACT-3 ， (SEQ ID NO:4)和 5，-CCGGATCCTTAGTTGCTAATACCCAGAATTT-3， (SEQ ID NO:5)，下划线 部分分别为限制性内切酶位点7Vtfe I和5aw/ZI。以博德特氏菌BK-52基因组 DNA为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物，PCR扩增顺式环氧 琥珀酸水解酶基因的开;^文阅读框。其PCR程序为94 。C预热5 min后，94 。C 50 s, 57。C30s, 72。Clmin， 30个循环，最后72 。C延伸10min。 PCR产 物用Wizard PCR片l史回收试剂盒(Promega)回收纯化后，用AWe I和S^w// I 酶切，并与pET22b(+)的合适位点处连接，按照实施例3中的方法转化到大肠 杆菌BL21中，筛选阳性克隆，并进行PCR、双酶切和测序鉴定。
鉴定结果显示，顺式环氧琥珀酸水解酶基因以成功克隆到pET22b(+)载体 中，并将该表达载体命名为pET22b-ESH，该基因工程菌命名为五.co// BL21-pET22b-ESH。
实施例5顺式环氧琥珀酸水解酶基因的特征
DNAMEN软件(Lynnon Biosoft)分析显示，插入pET22b(+)载体的片段有 一个长度为885 bp的开放阅读框，是顺式环氧琥珀酸水解酶基因的编码DNA 序列(SEQIDNO:6)。顺式环氧琥珀酸水解酶基因共编码294个氨基酸，预测 的分子量为32.4779 kDa，其氨基酸序列见SEQ ID NO:7。实施例子2中的序 列对应SEQIDNO:7中1-12的氨基酸序列。
实施例6顺式环氧琥珀酸水解酶基因在大肠杆菌中的表达 含pET22b-ESH质粒的^杆菌BL21在含100吗/ml氨千青霉素的LB培养基
中37。C振荡培养过夜。以只含pET22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段
的;U^杆菌BL21为对照。
:換照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述含顺式环氧琥珀酸水解酶基因的工程菌酶
活力为25800 U/g。
实施例7利用本发明所述的五.co// BL21-pET22b-ESH工程菌制备D(-)-
酒石酸
BL21-pET22b-ESH工程菌在100 ml实施例6中的LB培养&(含100 ng/ml 氨卡青霉素)中37。C振荡培养8h后，接入1LLB培养基中，37 。C下通气培养 10 h。然后向培养液中加入10g顺式环氧琥珀酸二钠，经12h振荡培养和反 应后，加入CaCl2水溶液，过滤并水洗沉淀，获得13.5 g四水酒石酸钩，再 经硫酸酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干得到D(-)-酒石酸6.3 g。 经分析该D(-)-酒石酸的比旋光度为[a]2。。 =-12.1。，含量为99.7%。
实施例8利用K-卡拉月交包埋本发明所述的co// BL21-PET15b/ESH工 程菌细胞制备D(-)-酒石酸
将实施例7的培养液离心并收集工程菌细胞，用K-卡拉胶包埋得到固定 化细胞。耳又上述固定化细胞10 g》文入30 ml 1.0 M顺式环氧琥珀S吏二钠溶液中， 37。C反应24h后，过滤回收固定化细胞。过滤液中加入CaCl2水溶液，经充 分搅拌后过滤，洗涤沉淀，得4.6 g四水D(-)-酒石酸4丐。将该酒石酸钙加硫 酸酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干得到D(-)-酒石酸2.1g。
将回收的固定化细胞再放入30 ml 1.0 M顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，37 °C反应24 h后，过滤回收固定化细胞。过滤液中加入CaCl2水溶液，经充分 搅拌后过滤，洗涤沉淀，得4.9 g四水D(-)-酒石酸钩。将该酒石酸钙加硫酸 酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干得到D(-)-酒石酸2.4g。
该固定化细胞可以反复使用。
综上可知，本发明构建的基因工程菌具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解 为D(-)-酒石酸或其盐的特性。
实施例9顺式环氧琥珀酸水解酶的特征 1.温度对顺式环氧琥珀酸水解酶稳定和活性的影响 将实施例1中分离纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶，在不同温度下，按 照实施例1中快速酶活测定法，检测温度对该酶活性的影响。结果显示，顺式环氧琥珀酸水解酶在30-50 °C,优选为35-45 °C有较高的活力(最高酶活的 75%以上)。
将实施例1中分离纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶，在不同温度下保温 30min后，按照实施例1中快速酶活测定法，检测温度对该酶稳定性的影响。 结果显示，顺式环氧琥珀酸水解酶具有较强的温度稳定性，50。C保温30min 后仍剩70%以上的活力。
2. pH对顺式环氧琥珀酸水解酶稳定和活性的影响
将实施例1中分离纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶，在不同pH下，按 照实施例1中快速酶活测定法，；险测pH对该酶活性的影响。结果显示，顺 式环氧琥珀酸水解酶在pH6-8.5，优选为pH6-7之间有较高的活力(最高酶活 的70%以上)。
将实施例1中分离纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶，在不同pH下室温 静置30min后，按照实施例1中快速酶活测定法，检测pH对该酶稳定性的 影响。结果显示，顺式环氧琥珀酸水解酶在pH4.6-9.0,优选为pH5-8，更优 选为pH 6-7之间放置30 min后仍剩90%以上的活力。
3. 顺式环氧琥珀酸水解酶的动力学特征
取适量实施例1中纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶，通过不断增加底物(顺 式环氧琥珀酸钠)浓度(12 mmol/LJOO mmol/L)，在0.1 mol/L磷酸钾緩冲液(pH 6.5) 37°C反应20 min，通过Lineweaver-Burk图计算顺式环氧琥珀酸水解酶
的Km值和Vmax值。结果显示，顺式环氧琥珀酸水解酶具有米氏酶的典型特
征，并且Km值和Vmax值分别为18.67 mmol/L和94.34 mM/min/mg。
尽管已参照本发明的确定优选实例表示和描述了本发明，但本领域内的 普通技术人员将理解的是，可在不背离由所附权利要求书限定的本发明宗旨 和范围的前提下对本发明进行各种形式和细节上的修改。
15序列表
< 110〉杭州宝晶生物化工有限公司
<120>使用基闪i:程菌生产D(-)-酒石酸或其盐
<130> C08P0276 <160〉 7
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 12
<212>顺式环氧琥珀酸水解酶N末端
<213〉 博德特氏菌菌种CMGCC No. 2075
〈400〉 1
MTRTKL1LEA RI 12
<210> 2
<211〉 18
<212〉 DNA
〈213〉 引物
<400〉 2
atgacnygna cnaarxtn 18
其中，y代表a或c， r代表a或g, x代表t或c， n代表a、 c、 g、 t四种碱基的任何一个。
<40()> 3
ctagttgcta atacccag 18
<210〉 4
<211〉 31
<212〉 DNA
<213〉 引物
<400〉 4
gccatatgat gactcgaacc aagttgatac t 31
〈210〉 5
<211〉 31
<212> DNA
<213〉 引物
<400〉 5
ccggatcctt agttgctaat acccagaatt t 31
〈210〉 6 〈211〉 885
<210〉 <211〉 <212> 〈213〉
1<212〉 DN八 <213〉 引物
<400〉 6 atgactcgaa
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t卿cctggg gcgaccgcgt 咖tcggggt cctttatgga gcggcatccg tgccacccgg ctgctgctgc atccggaatt gtgcgatggg
<210> 7
<211〉 294
<212〉顺式环氧琥珀酸水解酶
<213〉 博德特氏菌菌种CMGCC No. 2075
<400〉 7
MTRTKLILEA RINEYMPRRG NPHVPWTPKE IGEAAAQARE YETYAESIRE IRARSDVLVH PTLGQITLGG RESRLAHIER IDRYDDVEKR YETGDRVYLN NIDTLQHFSK RLRELGVKPA VDDPAYLLFE LTDCGIRGGH PGTIRGLRAH TDFLPPGRQI EGGHVAIGLG DYLYPELGTP TNGEWQTVA NMARAMGREI
ggcacggg肪 cagccatgac tctagtacat
C3ttg3gCg3
tagc3cg肌c gtacttgaac taagcctgcg tatgggtttg cggtggacat acgacagatc ggccattgag gggtacaccc tcgtgagatt
AGASIVHFHA LCLDPALKPD FIAWTVPFTR QWTVCNKIGN ATPAETKEIL
RQADGSPSHD FAPVDLGSTN TLDAFMDMGL LFGPAAAAIE GISN
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 885
60 120 180 240 294
1权利要求
1. 一种顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其由来源于博德特氏菌(Bordetellasp.)的多核苷酸编码，其分子量约为32kDa。
2. 权利要求1的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其在pH 6.5、 40 。C的条 件下具有最高的酶活力，在pH 6.5-8.5、 30-50 。C条件下酶活力达到最高酶活 力的70%以上。
3. 权利要求1的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其通过一种重组微生物菌 抹的胞内表达而获得。
4. 权利要求1的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其中所述的重组微生物菌 才朱为一种细菌或真菌。
5. 权利要求1的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列与SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有50%以上的同源性。
6. 权利要求5的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有70%以上的同源性。
7. 权利要求6的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列与SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有90%以上的同源性。
8. 权利要求1的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于所述多肽包含 全部或部分SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且具有顺式环氧琥珀酸水解酶 活性。
9. 编码权利要求1-8中任一项的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的多核芬酸。
10. 权利要求9的多核香酸，其包含SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
11. 权利要求10的多核苷酸，其由SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成。
12. —种载体，其包含权利要求9-11中任一项的核苷酸序列，和任选的 一个或多个来源于同源或异源微生物的调控序列。
13. —种重组微生物菌林，其表达权利要求1-8中任一项的顺式环氧琥珀 酸水解酶多肽。
14. 权利要求13的重组微生物菌林，其表达的顺式环氧琥珀酸水解酶多 肽是由权利要求9-11中任一项的多核苷酸编码的。
15. 权利要求13-14中任一项的重组微生物菌株，其用权利要求12的载体转化。
16. —种生产D(-)-酒石酸或其盐的方法，其包括使用权利要求1-8任一 项所述的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽或由权利要求9-11中任一项的多核香酸编码的顺式环氧琥珀酸水解酶多肽与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。
17. —种生产D(-)-酒石酸或其盐的方法，其包括如下步骤(a) 在合适的培养基中培养权利要求13-15任一项的重组微生物菌林；(b) 将步骤(a)中得到的重组微生物菌林的细胞、细胞抽提物或无细胞抽 提物或由所述微生物菌抹纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶固定在固体支持物上 或包埋在固定载体中；(c) 将步骤(b)中得到的制备物与顺式环氧琥珀酸或其盐在适于水解的条 件下反应以生产D(-)-酒石酸或其盐；和(d) 任选地重复利用上述固定或包埋的酶和/或细胞。
全文摘要
本发明涉及一种来源于微生物的、用于编码一种顺式环氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，一种包含所述核苷酸序列的克隆载体，一种由所述核苷酸序列转化而得的重组宿主菌，由所述核苷酸序列编码并由所述重组宿主菌表达的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列。进一步的，本发明还涉及一种利用所述顺式环氧琥珀酸水解酶水解顺式环氧琥珀酸或其盐制备D(-)-酒石酸或其盐的方法。
文档编号C12N9/14GK101481681SQ20081007416
公开日2009年7月15日 申请日期2008年2月27日 优先权日2008年2月27日
发明者张建国, 潘海峰, 谢志鹏, 鲍文娜 申请人:杭州宝晶生物化工有限公司