专利名称：：磷脂酶和其生产方法
技术领域：
：本发明涉及水解磷脂的方法，生产磷脂酶的方法，制作干酪(cheese)的方法，和磷脂酶。
背景技术：
：Soragni,E.等(2001)EMBOJ.20:5079-5090公开了来自Tuberborchii的磷脂酶(TbSPl)和编码它的基因的cDNA核苷酸序列。下面的肽序列发表在所示的资源中，来源于所示的生物体COGEME植物致病(Phytopathogenic)真菌和OomyceteEST数据库，UnisequenceID:VD0100C34，大丽花轮支孢(Verticilliumdahliae)。NCBI蛋白质数据库，gi:18307435，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)NCBI蛋白质数据库，gi:16519372，Helicosporumsp.HN1WO0056762,序列号5954，米曲霉(Aspergillusoryzae)TREMBL蛋白质数据库，EAA28927，粗糙脉孢菌美国6399121公开了磷脂酶在干酪制造中的应用。发明概述发明者们分析了真菌组XIII磷脂酶A2的已知的序列资料，并且从发表的序列资料或者通过筛选自然资源中相关序列，他们鉴定了额外的序列。通过在合适的宿主体内表达编码真菌组XIII磷脂酶A2，他们发现表达的序列包括在N-末端或C-末端或两侧偶联了肽序列的核心肽，并且在合适的宿主体内表达基因可以导致表达的肽断裂以获得核心肽，此核心肽在N-末端或C-末端没有任何肽延长。他们进一步发现没有任何肽延长的核心肽比连接有肽延长者具有明显更高的磷脂酶活性。最后，他们发现用此方法发现的核心肽在长度和序列上与//e/z'co^oWwm(Wakatsuki,S.etal.(2001)Biochim.Biophys.Acta1522:74-81)的未知功能的已知成熟肽相似，也和缺乏肽延长(extension)而不是分泌信号的细菌组XIII磷脂酶A2相似(Sugiyama，M.etal.(2002)J.Biol.Chem.277:20051-20058)。发明者们也发现与真菌组XIII磷脂酶A2有活性位点序列相似性和其半胱氨酸残基保守性的磷脂酶在干酪制造中是有用的。此外，发明者从镶片镰孢A3/5中发现并分离了编码新磷脂酶的基因，镰孑包属菌种A3/5最4刀寸呆藏为禾本牙+镰孑包(F"S(3"w附gn3m/"earwm)ATCC20334，最近被重新分类为镰孢霉菌，被Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80;和O，Do鬆ll等，1998,FungalGeneticsandBiology23:57-67。磷脂酶属于真菌/细菌组XIIIPLA2,其由Soragni等定义Soragnietal.，TheEMBOJournal,20(2001),5079-5090。发明者也将新的磷脂酶编码基因克隆到大肠杆菌株，并用克隆的基因制备在米曲霉中表达镰孢属(Fusarium)磷脂酶基因的构建体。发明者将米曲霉用此构建体转化，并从曲霉属(Aspergillus)细胞中分离磷脂酶。因此，发明提供生产磷脂酶的方法，其包括加工(processing)表达的真菌肽以从C-末端和/或从N-末端裂解掉肽以获得核心肽(cornpeptide),其中核心肽包才舌a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153,SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与任何这些氨基酸序列等同的序歹寸；禾pb)位于a)给出的序列的N-末端一侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端一侧的至少两个半胱氨酸残基。发明也提供用本发明的磷脂酶水解磷脂的方法。而且发明提供通过将干酪用乳(cheesemilk)或干酪用乳的成分(fraction)与磷脂酶接触并从干酪用乳(cheesemilk)生产干酪的方法。最后，发明提供磷脂酶，其是与某些特定序列具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽。具体地，本发明涉及如下方面(1)生产磷脂酶的方法，其包括加工被表达的真菌肽以从C-末端裂解肽和/或从N-末端裂解肽以获得有磷脂酶活性的核心肽，其中核心肽包括a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94,或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与这些氨基酸序列任何一个相同的序列；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的至少两个半胱氨酸残基。(2)(l)的方法，其中被表达的肽在用编码被表达肽的DNA转化的丝状真菌宿主细胞中表达。(3)(2)的方法，其中宿主细胞是曲霉属，镰孢属或木霉属，特别是米曲霉，黑曲霉，镶片镰孢或里氏木霉。(4)(2)的方法，其中表达的肽被宿主细胞在体内加工。(5)(1)-(4)的方法，其中核心肽长度为100-150个氨基酸。(6)(1)-(5)的方法，其中磷脂酶具有特定的磷脂酶活性，其是表达的肽加工前活性的至少2倍。(7)(1H6)的方法，其中被表达的肽源自块菌属(Tuber)，轮枝孢属，脉孑包菌属，曲霉属,或Helicosporum,4争另ll是T.borchii，T.albidum，大丽花轮支孑包,V.tenerum，粗糙脉孢菌，米曲霉或HelicosporiumspHN1。(8)(1)-(7)的方法，其中当完全表达的肽序列与SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，被表达的肽在与SEQIDNO:1氨基酸97-101比对的序列的N-末端侧0-18氨基酸内裂解。(9)(1)-(8)的方法，其中当完全表达的肽序列与SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，被表达的肽在与SEQIDNO:1氨基酸204-209比对的序列的C-末端侧0-11氨基酸内裂解。(10)(1)-(9)的方法，其中被表达的肽的裂解在Kex2加工位点的10个氨基酸内或FG序列的11个氨基酸内或两者。(11)水解磷脂的方法，其包括将磷脂与(1)-(10)的方法生产的磷脂酶接触。(12)生产干酪的方法，其包括将干酪用乳或干酪用乳的成分与磷脂酶接触，其中磷脂酶包括a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与任何这些氨基酸序列等同的序列；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的至少两个半胱氨酸残基。(13)生产干酪的方法，其包括将干酪用乳或干酪用乳的成分与(I)-(IO)的方法生产的磷脂酶接触。(14)磷脂酶，其是具有与下列序列至少有80%同一性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:10(T.albidum)中的氨基酸91-210，SEQIDNO:1(T.borchii)中的氨基酸92-211,SEQIDNO:12(V.tenerum)中的氨基酸30-137,SEQIDNO:3(大丽花轮支孢)中的氨基酸38-145，SEQIDNO:4(粗糙脉孢菌)中的氨基酸44-151,SEQIDNO:7(米曲霉)中的氨基酸37-157，或者SEQIDNO:8(粗糙脉孢菌)中的氨基酸58-168。(15)磷脂酶，其包括a)由克隆到质粒中的DNA序列的编码磷脂酶部分编码的多肽，其中质粒在保藏号DSM15442的大肠杆菌中；或b)多肽，其包括SEQIDNO:16的氨基酸29-149的氨基酸序列，或包括可以将其通过取代，缺失，和/或插入一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列；或c)(a)或(b)定义的多肽的类似物，其i)与该肽具有至少80%同源性，或ii)与抗该纯化形式的多肽的抗体发生免疫反应，或iii)是该多肽的等位基因变体；或d)由核酸序列编码的多肽，该核酸序列在低严谨条件下与编码成熟多肽的SEQIDNO:15核酸133-495的核酸序列的互补链杂交，或者其具有至少100个核苷酸的亚序列。(16)(15)的磷脂酶，其是天然的镰孢属的菌抹，特别是镶片镰孢。(17)核酸序列，其包括编码(15)或(16)的磷脂酶的核酸序列。(18)核酸序列，其包括7a)克隆到DSM15442大肠才干菌中质4立上的编码成熟的4，脂酶的部分DNA序列，b)SEQIDNO:15核酸133-495的编码成熟磷脂酶的部分DNA序列，c)(a)或(b)定义的序列的类似物，其编码磷脂酶并且i)与所述DNA序列具有至少80%同源性，或ii)与所述DNA序列的互补链高严谨杂交或其具有至少100个核苷酸的亚序列，iii)是它们的等位基因变体；或d)a),b)或c)的互补链。(19)核酸构建体，其包括(17)或(18)的核酸序列，其可操作性地连接于在合适表达宿主内能够指导磷脂酶表达的一个或多个控制序列。(20)重组表达载体，其包括(19)的核酸构建体，启动子，和转录和翻译终止信号。(21)包括(20)的核酸构建体的重组宿主细胞。(22)生产磷脂酶的方法，其包括在利于磷脂酶产生的条件下培养(21)的宿主细胞，和回收磷脂酶。(23)制备面团或从面团制作烘烤的产品的方法，其包括向面团中加入(15)的磷脂酶。(24)包括(1"的磷脂酶的面团组合物。(25)包括表面活性剂和(15)的磷脂酶的去污剂组合物。(26)减少植物油中磷含量的方法，其包括在水存在的情况下将油与(15)的磷脂酶接触，和然后从油中分离水相。(27)生产干酪的方法，其包括用磷脂酶处理乳组合物，和从乳组合物生产干酪，其中磷脂酶是(15)的磷脂酶。(28)生产干酪的方法，其包括用磷脂酶处理乳组合物，和从乳组合物生产干酪，其中磷脂酶选自真菌的/细菌的组XfflPLA2磷脂酶。发明详述表达的肽发明使用表达的真菌肽其属于由活性位点序列相似性所定义的组，并且在Somgni，E.，etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090给出的组"真菌/细菌组xm磷脂酶A2"定义中使用半胱氨酸残基保守性。肽是真菌的，例如源自Tuber，轮枝孢属(Verticillium)，脉孑包菌属(Neurospora),Helicosporum，或曲霉属，特别是T.borchii，T.albidum,大丽花轮支孢(V.dahliae),V.tenerum,粗糙脉孑包菌(N.crassa)，Helicosporiumsp.HN1或米曲霉。肽可以具有磷脂酶活性，例如磷脂酶A活性，例如磷脂酶Al和/或磷脂酶A2活性。一些具体地例子是具有下面序列表中列出的氨基酸序列的已知肽。也说明了源生物体和参考文献SEQIDNO:1.Tuberborchii.Soragni,E.,etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090SEQINNO:3.大丽花轮支孢，COGEME植物致病真菌和OomyceteEST数据库，UnisequenceID:VD0100C34.SEQIDNO:4.粗糙脉孢菌，NCBI蛋白质数据库，gi:18307435。SEQIDNO:5.Helicosporumsp.HN1.NCBI蛋白质数据库，gi:16519372。SEQIDNO:7.米曲霉，WO0056762,SEQIDNO:5954。SEQIDNO:8.粗糙脉孢菌，TREMBL蛋白质数据库，EAA28927。进一步，发明者从天然来源分离具有所示序列的下面的真菌磷脂酶，这些天然来源购自公共保藏库或保藏在所示的国家和年代SEQIDNO:10.Tuberalbidum.购自CentraalbureauvoorSchimmel-cultures，Utrecht,荷兰，分离CBS272.72SEQIDNO:12.Verticilliumtenemm.爱尔兰，1996发明者将从T.albidum(SEQIDNO:9)来的基因插入大肠杆菌中并按照布达佩斯条约(BudapestTreaty)于2003年2月12日保藏克隆。在德国DeutsceSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig进4亍〗呆藏，并i己录为寸呆藏物号DSM154化发明的一个实施方案中提供磷脂酶，其是与以下氨基酸序列具有至少80%，例如85%,优选90%,更优选至少95%氨基酸序列同一性的多肽与SEQIDNO:10(T.albidum)中的氨基酸91-210，SEQIDNO:1(T.borchii)中的氨基酸92-211，SEQIDNO:12(V.tenerum)中的氨基酸30-137，SEQIDNO:3(大丽花轮支孢)中的氨基酸38-145，SEQIDNO:4(粗糙脉孢菌)中的氨基酸44-151,SEQIDNO:7(米曲霉)中的氨基酸37-157，或者SEQIDNO:8(粗糙脉孢菌)中的氨基酸58-168。肽加工通过分析序列表中的磷脂酶序列，发明者发现每个表达的氨基酸序列由下述组成，信号肽，核心肽，和附加在核心肽C-或N-末端，或两端的功能未知的额外肽序列。核心肽核心肽特点是相同的活性位点序列相似性和半胱氨酸残基保守性，其由Soragni，E.,etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090在真菌的/细菌的组XIII磷脂酶A2观察到。在发明的优选实施方案中核心肽包括a)下列给出的序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153,SEQIDNO:3的氨基酸87-94,或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸与这些氨基酸序列任何一个相同的序列；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的两个半胱氨酸残基。位于a)给出的序列的N-末端侧的半胱氨酸残基之一可以与a)给出的序列相隔例如0-5个氨基酸，例如0-3个氨基酸，优选0-2个氨基酸，甚至更优选1个氨基酸。位于a)给出的序列的N-末端一侧的另一个半胱氨酸残基可以与a)给出的序列相隔例如14-20个氨基酸，例如15-19个氨基酸，优选16-18个氨基酸，甚至更优选17个氨基酸。位于a)给出的序列的C-末端侧的半胱氨酸残基之一可以与a)给出的序列相隔例如22-29个氨基酸，例如23-28个氨基酸，优选24-27个氨基酸，甚至更优选25-26个氨基酸。位于a)给出的序列的C-末端一侧的另一个半胱氨酸残基可以与a)给出的序列相隔例如27-49个氨基酸，例如29-46个氨基酸，优选30-43个氨基酸，甚至更优选32-42个氨基酸，且最优选35-40个氨基酸。在一个优选实施方案中核心肽包括四个半胱氨酸残基，当完整表达的磷脂酶序列与SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12给出的序列同时比对(aglin)时，四个半胱氨酸残基分别与SEQIDNO:l氨基酸128，144，180,和194的半胱氨酸残基比对(aligning)。按照本发明，将表达的多肽裂解以从附加肽上分离核心肽。裂解可以通过将其在合适的丝状真菌宿主内表达而在体内进行，或者在体外，例如通过用合适的蛋白酶如Kex2处理。可以在FG序列的11个氨基酸里或Kex2位点序列的10个氨基酸里发现断裂点。Kex2位点是例如RR,KR，KK或RK。在一个实施方案中核心肽长度100-150氨基酸，例如110-140个氨基酸,115-133个氨基酸，118-129个氨基酸，或118-126个氨基酸。在发明的一个实施方案中，当完整表达的磷脂酶序列与SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，将表达的磷脂酶在与SEQIDNO:1的氨基酸97-101比对的序列的N-末端侧0-18氨基酸中裂解，例如3-16氨基酸，优选5-14氨基酸。在优选实施方案中，当完整表达的磷脂酶序列与SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10,和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，将表达的磷脂酶在与SEQIDNO:1的氨基酸204-209比对的序列的C-末端侧0-11氨基酸内裂解，例如0-9氨基酸，优选0-7氨基酸。在优选的实施方案中，加工后的磷脂酶具有特异的磷脂酶活性，其比表达肽加工前的活性高，例如，在一个实施方案中特异的磷脂酶活性至少是表达肽加工前的特异磷脂酶活性的2倍，更优选至少5倍，最优选至少10倍。在发明的一个实施方案中表达的肽在加工前没有测定到磷脂酶活性。磷脂酶活性例如可以用在pH8.0和40°C水解大豆卵磷脂(L-a-磷脂酰胆碱)2分钟的LEU实验来测定。磷脂酶活性表示为相对于标准，保持恒定的pH必需的滴定消耗(0.1MNaOH)速度。在丝状真菌宿主细胞中表达丝状真菌宿主细胞可以是例如下列的细胞支顶孢霉属(Acremonium),曲霉属，镰孢属(Fusarium)，腐殖霉属(Humicola)，毁丝霉属(Myceliophthora),脉孢菌属(Neurospora),青霉属(Penicillium)，才艮毛霉属(Rhizomucor),嗜热霉属(Thermomyces)，梭孢壳属(Thielavia)，弯颈霉属(Tolypocladium)，或木霉属(Trichoderma),特别是泡盛曲霉(A.awamori),臭曲霉(A.foetidus)，曰本曲霉(A.japonicus),构巢曲霉(A.nidulans),黑曲霉(A.niger)，米曲霉，杆孑包状镰孑包(F.bactridioides),禾谷镰孑包(F.cerealis)，库威镰孑包(F,crookwellense)，大刀镰孑包(F.culmorum),禾谷镰孑包(F.gramineamm)，禾赤镰孑包(F.graminum)，异孢镰孢(Rheterosporum),合欢木镰孢(F.negundi)，尖镰孢(F.oxyspor腿)，多枝镰孢(Rreticulatum)，玫瑰色镰孢(F.roseum),接骨木镰孢(F.sambucinum),月夫色錄孑包(F.sarcochroum),扣乂分斗支孑包镰孑包(F.sporotrichioides),硫色镰孢(Rsulphureum)，圓镰孢(F.torulosum),拟丝孢镰孢(F.trichothecioides)，镶片镰孢，特异腐质霉(H.insolens),嗜热毁丝霉(M.therm叩hila),粗糙脉孢菌(N.crassa),产紫青霉(P.purpurogenum)，曼赫根毛霉(R.miehei),细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)，土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum),康亍木霉(Trichodermakoningii),长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)，里氏木霉(Trichodermareesei),绿色木霉(Trichodermaviride)。在优选实施方案中宿主生物体是曲霉属，镰孢霉属，或木霉属的菌抹，特别是黑曲霉，米曲霉，镶片镰孢，接骨木曲霉或Rcerealis。可以通过传统的方法进行转化，培养，表达，回收，例如通过EP238023，EP305216,WO9600787,EP244234或T.Christensenetal.,BioTechnology，第6巻，1988年12月，1419-22描述的一般方法。磷脂酶多肽和DNA在一个实施方案中，本发明涉及有磷脂酶活性的多肽，并且其中多肽包括，优选由与SEQIDNO:16(即成熟多肽)的氨基酸29-149有一定程度同一性的氨基酸序列组成，该同一性程度至少80%,例如至少85%,甚至更优选至少卯％,最优选至少95%,例如至少96。/。，例如至少97%，甚至最〈尤选至少98%,例如至少99%。优选地，多肽包括SEQIDNO:16的氨基酸序列；它们的等位基因变体；或具有磷脂酶活性的它们的片段。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽包括SEQIDNO:16的氨基酸29-149。在进一步优选的实施方案中，多肽由SEQIDNO:16的氨基酸29-149组成。本发明也涉及多核苷酸其包括，优选由与SEQIDNO:15的核苷酸133-495至少80%同源的核苦酸序列组成。优选地，核苷酸序列与SEQIDNO:15的核苦酸133-495具有至少85%同源性，例如至少90%同源性，甚至更优选至少95%同源性，例如至少96%同源性，例如至少97%同源性，甚至最优选至少98%同源性，例如至少99%同源性。优选地，核苷酸序列编码具有磷脂酶活性的多肽。在本申请中使用以DNA序列为基础设计的探针，磷脂酶可以源自镰孢霉属的菌林，特别是镶片镰孢。在一个实施方案中磷脂酶具有磷脂酶A的活性。磷脂酶的生产可以通过用编码磷脂酶的DNA序列转化合适的宿主细胞，在允许酶产生的条件下培养转化的微生物，并从培养物中回收酶。宿主微生物优选是真核细胞，特别是真菌细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，例如下列菌属的菌抹曲霉属，镰孢霉属，木霉属或酵母属，特别是黑曲霉，米曲霉，镶片镰孢，接骨木曲霉，F.cerealis或酿酒酵母，例如黑曲霉的产生葡萄糖淀粉酶的菌抹，例如US3677902中描述的那些或它们的变体。在这样宿主生物体中磷脂酶的生产可以通过EP238,023(NovoNordisk)，WO96/00787(NovoNordisk)或EP244,234(Alko)描述的一般方法进行。发明的表达载体通常包括作为启动子功能的控制序列，翻译起始信号，和，可选择地包括筛选标记，转录终止子，阻遏基因或各种激活基因。载体可以是自主复制载体，或者它可以被整合到宿主基因组中。序列比对和同源性核苦酸序列的比对可以使用VectorNT1ProgramSuite7.0的AlignX应用软件进行，使用默认设置，其使用改良的ClustalW运算法则(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,andGibsonT丄(1994)Nuc.AcidRes.22:4673-4680),swgapdnarnt4寻分(score)矩阵,空"f立开》文罚分(gapopeningpenalty)15和空^[立延伸罚分(gapextensionpenalty)6.66。氨基酸序列的比对可以使用VectorNT1ProgramSuitev8的AlignX应用软件进行，使用默认设置，其使用改良的ClustalW运算法则(Thompson,J.D.,Higgins，D,G"andGibsonT.J.1994)，blosum62mt2得分矩阵，空位开放罚分15和空位延伸罚分0.1。在发明的一个实施方案中，序列的比对和同源性得分的计算使用Lipman陽Pearson方法进行(Lipman，D丄andW.R.Pearson(1985)Rapidandsensitiveproteinsimilaritysearches.Science227:1435-1441)，使用PAM250残基weighttable(Dayhoff,M.O.,R.M.Schwartz,andB.C.Orcutt(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins.InDayhoff，M.O.(ed.)，AtlasofProteinSequenceandStructure.NationalBiomedicalResearchFoundation.Washington,D.C.Vol5.Suppl.3:pp.345-358)并用Lasergene软件包中MegAlign程序v4.03的默认设置(DNASTARInc.,1228SouthParkStreet,Madison,Wisconsin53715)。默认设置是K-tuple为2,空位罚分(gappenalty)为4,和空位长度罚分(gaplengthpenulty)为12。磷脂水解可以将发明用于任何磷脂例如卵磷脂，脑磷脂或inositide的水解。通过替换磷脂酶，可以将发明用作类似于以前的现有技术的方法和加工领域中，例如用于烘烤产品(WO0032758，W09953769)和蛋黄酱(GB1525929,US4034124)的生产，或植物油的处理(US5264367)。磷脂酶的应用可以将发明的磷脂酶用于磷脂酶的各种工业应用，例如下面所描述的。用于烘烤可以将发明的磷脂酶用于面团，面包和蛋糕的制备，例如改善面包或蛋糕的弹性。因此，可以将磷脂酶用在制作面包的过程中，包括向面团成分中添加磷脂酶，捏制面团和将面团烘烤以制成面包。这可以按类似于US4567056或WO99/53769进行。用于去污剂中可以将变体用作去污剂的添加物，例如以每克去污剂中0.001-10(例如0.01-l)mg的浓度(表示为纯的酶蛋白)，或每升洗涤液中0.001-100(例如0.01-10)mg的浓度。可以将发明的去污剂组合物配制成例如手洗或机洗去污剂组合物，其包括适于染色织物预处理的洗衣添加剂组合物和加有织物软化剂(softener)组合物的漂洗剂，或配制成用于普通家用硬表面清洗操作的去污剂组合物。在洗衣去污剂中，变体对去除脂肪渍，保持白色和污渍清除是有效的。洗衣去污剂组合物可以按照GB2247025，WO9901531或WO9903962描述的配制。作，例如按照GB2,247,025(Unilever)或WO99/01531(Procter&Gamble)描述的。在餐具洗涤(dishwashing)组合物中，变体对下列可能是有效的去除油污/油渍，防止餐具和洗碗机的塑料成分被高度着色成分染色或脱色，和避免钙皂在餐具上的沉积。其他应用可以将发明的磷脂酶用于改善水溶液或糖浆的过滤性，其通过将水溶液或糖浆用磷脂酶处理。这特别适用于含有淀粉水解物的浆液，尤其是小麦淀粉水解物，因为它往往是难以过滤并使滤过物混法。处理可以按类似于EP219,269(CPC国际的)进行。进一步，可以将发明的磷脂酶用于磷脂，优选卵磷脂的部分水解，以获得改善的磷脂乳化剂。这一应用在Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry(Publisher:VCHWeinheim(1996))，日本专利2794574,和JP-B6-087751中有进一步描述。进一步，可以将发明的磷脂酶用于动物饲料生产的加工，其包括将磷脂酶与伺料原料和至少一种磷脂混合。这可以按类似于EP743017进行。甚至进一步可以将发明的磷脂酶用于减少食用油中磷脂成分的加工，包括用磷脂酶处理油以水解大部分磷脂，并从油中分离含有水解的磷脂的水相。该过程适用于任何含有磷脂的食用油的纯化，例如植物油如大豆油，油菜籽油和向日葵油。可以将磷脂酶用于例如JP-A2-153997和US5264367描述的加工过程。生产干酪的方法可以将发明的磷脂酶按类似于US6399121给出的方法用于生产干酪。在发明的一个优选实施方案中，干酪的生产通过将干酪用乳或干酪用乳的成分与发明的磷脂酶接触并从干酪用乳生产干酪。在进一步的优选实施方案中，干酪的生产通过将干酪用乳或干酪用乳的成分与磷脂酶接触，其中磷脂酶包括a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或其除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与这些氨基酸序列任何一个相同的序列，；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的至少两个半胱氨酸残基。在发明全文中短语干酪用乳意思是包括用于干酪生产的任何以乳为基础的组合物。干酪用乳的成分可以是干酪用乳的任何部分，例如奶油，脱脂乳，牛奶，酪乳，黄油或乳脂肪。在优选实施方案中将干酪用乳或干酪用乳的成分与足量的发明的磷脂酶才妄触，该量足以减少干酪中去油效应和/或增加干酪产量。去油效应(oiling-off)是干酪在贮存和/或融化时形成游离油的倾向。发明的一个方面涉及生产干酪的加工过程，其包括用发明的磷脂酶处理乳制品组合物并从乳制品组合物生产干酪。发明的另一个方面涉及生产干酪的加工过程其包括用磷脂酶处理乳制品组合物并从乳制品组合物生产干酪，其中磷脂酶选自真菌/细菌组XIIIPLA2磷脂酶。在发明的优选实施方案中真菌/细菌组XinPLA2来自真菌，更优选来自属于(Ascomycetes)的真菌。属于真菌/细菌组XI11PLA2的磷脂酶可以是Y壬何属于Soragnietal.,TheEMBOJournal,20(2001),5079-5090所定义的该组的磷脂酶，并且可以是例如从以下菌属Tuber属，例如T.borchii,《连霉菌属，例如S,coelicor,轮枝孑包属(Verticillium)，例如大丽花轮枝孢(v.danhliae)，曲霉属，例如米曲霉，脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌，或Helicosporum。按照发明的乳制品组合物可以是任何包含乳成分的组合物。乳成分可以是乳的任何组分，例如乳脂肪，乳蛋白，酪蛋白，乳清蛋白质，和乳糖。乳级分(fraction)可以是乳的任何级分例如脱脂乳，黄油乳，乳清，奶油，奶粉，全脂奶粉，脱脂奶粉。在发明的优选实施方案中乳制品组合物包括乳，脱脂乳，黄油乳，全乳乳清，奶油，或它们的任何组合。在更优选的实施方案中乳制品组合物由乳，例如脱脂乳，全乳，奶油，黄油，或它们的任4可组合组成。16发明的加工过程中酶处理的进行可以通过将磷脂酶分散在乳制品组合物中，并允许酶反应发生在合适的温度并保持合适的时间。用磷脂酶处理可以在按照本领域熟知原则选择的适合所选用酶的条件下完成。可以在任何合适的pH进行酶反应，例如在2-10的范围，例如在pH4-9或5-7。在一个实施方案中磷脂酶处理在3-60。C进行，例如在25-45。C(例如至少5分钟，例如至少10分钟或至少30分钟，例如5-120分钟)。将磷脂酶以合适的量加入以生产具有目的特性的干酪。优选地，将磷脂酶以有效减少干酪去油效应和/或增加干酪产量的量加入。磷脂酶的合适剂量通常在每克乳脂肪中0.001-0.5mg酶蛋白的范围，优选每克乳脂肪中0.01-0.3mg酶蛋白，更优选地，每克乳脂肪中0.02-0.1mg酶蛋白。按本发明方法生产的干酪包括所有种类的干酪，例如Campesino，Chester,Danbo，Drabant,Herregard，Manchego,Provolone,SaintPaulin專欠干酪(Softcheese),Svecia,Taleggio，白干酪(whitecheese),包4舌通过干酪凝块的凝乳酶凝固(rennet-coagulation)生产的凝乳酶凝干酪；成熟干酪例如Cheddar,Colby,Edam,Muenster,Gruyere，Emmenthal,Camembert,Parmesan牙口Romano;青纟丈奶酪(bluecheese),例长口丹麦青纟丈4巧酪(Danishbluecheese);新鲜干酪例如Feta;酸凝干酪例如奶油干酪，Neufchatel,Quarg，CottageCheese,和QuesoBlanco。在优选实施方案中发明涉及生产pastafilata干酪例如Mozzarella和Pizza干酪的方法。通过在热水中新鲜凝块的独特的塑型和捏制处理，Pastafilata或stretched凝乳，干酪通常是不一^:的，该处理赋予成品干酪特有的纤维结构和融化和延伸特性，参考例如PaulS.Kindstedt的"MozzarellaandPizzacheese，，,Cheese:Chemistry,physicsandmicrobiology,第2巻MajorCheesegroups,第2版,337-341页，Chapman&Hall。序列表和微生物保藏本申请包含序列表中的信息，其附属于本申请并且也随本申请以数据载体提交。此外，本申请提及保藏的微生物。数据载体的内容和保藏的微生物在此全部引入以作参考。生物材料的保藏下列生物材并+已经4妄照Budapest条约保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德国，并给出下列保藏号保藏物保藏号大肠杆菌DSM15441大肠杆菌DSM15442保藏曰2003年2月12日2003年2月12日材料与方法培养基YP+2%G培养基10g酵母提取物20g蛋白胨加水至1升于121。C高压灭菌20分钟加入100ml20%无菌葡萄糖溶液RA孢子形成培养基50g琥珀酸12.1g硝酸钠lg葡萄糖20ml50xVogel，s盐(Davis,R.H.andF.J.deSerres(1970),Meth.Enzymol.17A:79-143)将成分在1升蒸馏水中混匀并过滤除菌BrittonRobinson緩冲液0.023M磷酸0.023M乙酸0.023M硼酸用NaOH或HC1滴定到目的pH方法磷脂酶活性(XEU)将卵磷脂在恒定pH和温度下水解，磷脂酶活性测定为中和游离脂肪酸过程中滴定(0.1NNaOH)消耗的速度。底物是大豆卵磷脂(L-a-磷脂酰胆碱)，条件是pH8.00，40.0°C,反应时间2分钟。单位是相对于标准来定义的。实施例实施例1:米曲霉中源于Tuberalbidum的磷脂酶A2表达将Soragni等(出处同上)公开的DNA序列用于设计从基因组DNA进行TbSPlPCR扩增的引物，向引物末端加入适当的限制性位点以利于PCR产物(SEQIDNO:13和14)的克隆。从CBS(CentraalbureauvoorSchi匪el-cultures,Utecht，荷兰)获得Tuberalbidum株，CBS272.72,并按CBS培养物表1996上建议的于20。C培养在X-琼脂上。从板的表面去除菌丝体，并按照生产商的说明4吏用FastDNASpinKit(BIO101,Inc.,Vista,CA)分离总DNA。用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(ABgene,Surrey,U.K.)按照生产商的说明进行PCR扩增，并在最初5个循环使用52。C的退火温度，后面25个循环使用62。C退火。获得了单一PCR产物，并且将序列进行测定并表示为SEQID9，其排除了添加的合成的限制性位点。基因组序列与E.Soragni等提交的cDNA序列对比显示有单个内含子。当将内含子去除，从T.albidumCBS272.72来的核苷酸序列与E.Soragni等使用的菌抹T.borchiiATCC96540的序列92.5%同一性。从T.albidumCBS272.72基因序列预测的相应的肽与Soragni等报道的肽序列93.8%同一性。使用标准技术将PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉属表达载体pMStr57中。表达载体pMStr57含有与pCaHj483(WO98/00529)相同的元件，具有对曲霉属NA2启动子的最少^畛饰，并有用于在大肠杆菌中筛选和繁殖的序列，和用于在曲霉属中筛选和表达的序列。具体地，通过构巢曲霉的amdS基因使在曲霉属中筛选变得容易，其允许使用乙酰胺作为唯一的氮源。在曲霉属菌种中的表达由来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导，该启动子被融合到来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5'前导序列，并且终止子来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶的编码基因。将所得到曲霉属菌种表达构建体pMStr57的磷脂酶A2编码基因测序，并将序列与以前测定的未克隆的PCR片段SEQID9对比。发现在终止密码的下游52bp处一个T突变成C。使用Christensen,T.etal.,(1988),Biotechnology6,1419-1422描述的标准技术，用pMStr57转化米曲霉。将转化体在YP+2°/。G培养基中于30°C，振荡275RPM培养，并用SDS-PAGE监测Tuber磷脂酶A2，TbPLA2的表达。蛋白鉴定SDS-PAGE显示大约分子量为25和16kDa的两条带。将上清在SP-琼脂糖柱上用离子交换层析纯化,柱用50mM乙酸盐緩冲液平衡，用1MNaClpH5.0洗脱。两种蛋白质洗脱在两个不同的组分中。用Roche的ProteinAssayESL测定蛋白质的浓度。用LEU实验测定活性。分子量kDa浓度mg/ml活性LEU/ml比活性LEU/mgPool123-251.326146Pool2160.42272648将蛋白质进行N-末端测序。发现Pool1(23-25kDa带)的N-末端序列相应于SEQIDNO:10的氨基酸32-50。Pool2(16kDa带)的印迹显示具有N陽末端序列分别相应于氨基酸86-98和91-103的两条带。两条带的质谱分析显示质量分别为13934和14348Da，分别与SEQIDNO:10的氨基酸86-210和91-210序列的计算值相差5Da以内。实施例2:在米曲霉中表达的两种形式的T.albidiumPLA2的纯化方法在实施例1描述的产生T.albidumPLA2的米曲霉转化体的大多数发酵物纯化过程中^r测到两种类型的酶。一种类型在SDS-PAGE中电泳在22-23kDa并相应于Somgni等(出处同上)才艮道的肽。此外，^^测到一种新类型，其电泳在SDS-PAGE的16-17kDa并具有高度比活性和高等电点。22-23kDa肽的纯化将来自在米曲霉中表达的含有源于T.albidium的磷脂酶的(实施例1中制备的)发酵上清过滤除菌，其使用购自SeitzSchenkBadKreuznach,Bettringerstrasse42，GermanyD-73550,Waldstetten的EKS滤器。然后调节无菌过滤的上清至pH8和离子强度在4mSi以下。阴离子交换层析纯化的第一步使用购自AmershamPharmacia的50mlFastflowqTm球脂糖柱上阴离子交换层析进行。将柱用50mMTris乙酸盐緩冲液pH8预平衡。然后将无菌过滤的发酵液加在柱上，并将柱用同样緩沖液洗涤直至所有未结合物质被洗掉。将结合的蛋白质用含有1M氯化钠pH8的相同緩冲液以5ml/min的流速洗脱，并且最终体积达500ml总緩冲液。以每5ml—个级分用级分收集器收集，所有级分含有的磷脂酶活性使用购自Sigma产品号P-5638的L-a-磷脂酰胆碱以卵磷脂作为底物定性测定，并且测定活性使用购自德国WakoChemicalsGmbH，NissanStrasse2,41468Neuss的NEFAC试剂盒。详细的测定描述如下。用不同緩冲液制备含有10mg/ml卵磷脂底物的底物溶液，例如用含有购自Flukachemicals的2mMCaCb和0.1%TritonX-100的50mM乙酸盐pH5或50mMHepespH7或50mMTris乙酸盐pH9作为緩沖液。通过搅拌并加温成5CTC使底物乳化，然后冷却至4(TC并用作底物。活性的测定如下进行用300n1底物乳化剂与25p1酶级分在40。C保温20分钟，然后将30jul测定混合物转移至按生产商描述制备的300julNEFAC显色试剂A，并于37。C保温10分钟，向混合物加入600jul显色试剂NEFACB溶液并再保温10分钟。然后将所形成的蓝色在分光光度计上于505nm测定。蛋白鉴定然后将含有活性的级分混合，并用SDS-PAGE电泳分析分子量特征，电泳叶吏用购自美国InvitrogenLifeTechnologies,CarlsbadCA92008的NovexPrecastedgels4-20%Tris匿甘氨酸凝胶。才企测和印迹了22-23kDa的蛋白质并用AppliedBiosystem测序4义进行N-末端分析。测定了N-末端的前19个氨基酸残基并发现具有SEQIDNO:10的氨基酸32-50序列。16-17kDa肽的纯4匕将来自表达在米曲霉中T.albidium的过滤除菌发酵上清调节至pH4.7并将离子强度调节至4mSi以下。阳离子交换层析SP-sepharoseTMfastflow购自AmershamPharmacia。》真装50ml的柱并用50mM乙酸盐緩冲液pH4.7平衡，然后将发酵上清加在柱上，并将未结合物质用同样緩沖液洗去。将具有高等电点的结合蛋白质用含有IM氯化钠的pH4.7的50mM乙酸盐緩沖液进行线性盐梯度洗脱。级分和流速与用于低等电点类型磷脂酶的相同。在级分中的磷脂酶活性按照上面用NEFA试剂盒定性测定。将含有磷脂酶活性的级分混合并按照上面描述的进行SDS-PAGE。观察16-17kDa蛋白质其具有高等电点，在9以上。蛋白质印迹后使用AppliedBiosystem测序仪进行蛋白质的N-末端分析，其显示出完全不同于Soragni等(出处同上)发表的N-末端。因此，发现T.albidumPLA2具有两种类型，其源自不同的N-末端加工，具有分别相应于SEQIDNO:10氨基酸86-105和91-110的N-末端序列。实施例3:用T.albidum磷脂酶的干酪制作使用巴氏杀菌的，非均质奶油(北卡罗来纳州大学乳品厂(NorthCarolinaStateUniversityDairyPlant)将五百克巴氏杀菌的，非均质脱脂乳(北卡罗来纳州大学乳品厂)标准化为3.5。/。脂肪因此生产全脂mozzarella干酪。将每个实验用的干酪用乳或者用按照实施例2制备的16-17kDaT.albidum磷脂酶，或者用商业磷脂酶Lecitase10L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,丹麦)处理，并放置在35。C水浴中直至平衡至该温度。测量干酪用乳的起始pH并加入0.01。/。(w/w)引子培养物。监测pH直至pH达到6.4。将250jli1凝乳酶(rennet)(Novozym89L)用去离子水稀释至9ml总溶液，将1ml该溶液加入干酪用乳中并用力搅拌干酪用乳3分钟。取出搅拌子并允许凝乳酶凝的乳品放置于35°C。上面的处理之后，当将抹刀(spatula)插入可以看见明显的边界时则凝乳准备好进行切割。干酪的切割通过把刀压下并且当触到烧杯时快速反转刀具(cutter)并最后将刀拔出进行。允许凝乳放置5分钟然后用匙轻轻搅动。温度升至41。C伴随间断的轻轻搅动-45分钟或直至pH降至6.0-5.9。将凝乳用干酪用粗棉布沥干然后放回烧杯中并保持在4rc水浴中，根据需要倒出乳清。当凝乳达到pH5.3时，将盛有凝乳的不锈钢碗在69。C水浴中浸泡(flood)5分钟然后用手拉伸。将凝乳在冷的冰水中处理(temper)30分钟。将干酪凝乳用纸巾干燥，称重并冷藏过夜。除了不加磷脂酶，对照干酪制作实验用同一批号乳品按照同样程序进行。实际干酪产量计算为相对于干酪用乳总重量拉伸(stretch)后干酪的重量。调节过湿度的干酪产量表示为调节至标准恒定湿度水平的实际产量。调节过湿度的产量通过实际产量乘以实际湿度对标准湿度比来计算，并按照下面/>式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中Yad」=调节过湿度的干酪产量，Yaet=实际干酪产量，Maet=实际湿度分数&Mstd=标准湿度分数(0.48)所有实验组和对照组的调节过湿度的干酪产量如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例4:源于Fusariumvenenatum的磷脂酶(FvPLA2)在米曲霉中克隆和表达将镶片镰孢A3/5的细胞(最初保藏为禾谷镰孢ATCC20334,最近被重新分类为Fusariumvenenatum:被Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80;和O，Donnell等，1998，FungalGeneticsandBiology23:57-67.)在Vogel，s最低限度培养基(Davis,R.H.andF.J.deSerres(1970),Meth.Enzymol.17A:79-143)中于28。C震荡培养生长两天，用无菌Miracloth(Calbiochem，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)过滤，并转移至"RA孢子形成培养基，，中，将其于28。C再摇动培养保温24小时。离心收集细胞和孢子并裂解，4是取RNA并转录成cDNA，将该cDNA按WO00/56762描述的方法克隆到pZErO-2中。扩增前此文库中独立克隆的数目是2.5x105，其中92%含有插入序列，其大小从550-2500bp不等。对大约1000个随机选择克隆进行局部DNA测序测定，并将序列按照WO00/56762描述的方法存储在计算机中。E.Soragni等2001年报道了编码一种Tuberborchii的磷脂酶A2-TbSPl的cDNA核苷酸序列，和相应翻i,的肽。用TFASTXY程序，3.3t08版(Pearsonetal.,1997)将该翻译的肽与Fusariumvenenatum部分cDNA序列的翻i奪产物对比。镶片镰孢序列的一个翻译产物与TbSPl具有125个氨基酸重叠的42%同源性。测定相应克隆FM0700的cDNA插入子全序列，并用SEQIDNO:15显示，从此序列翻译的肽，FvPLA2用SEQIDNO:16显示。将此序列用作设计从FM0700PCR扩增编码FvPLA2的基因的引物FvPLAl和FvPLA2.2，其有加于引物末端的合适的限制性位点以利于PCR产物的亚克隆。FvPLAl:CTGGGATCCTCAAGATGAAGTTCAGCGFvPLA2.2:GACCTCGAGACCCGCCATTTAAGATT4吏用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(AB-gene,Surrey,U.K.)4会照生产商的说明进行PCR扩增，并使用52。C的退火温度和60。C的延伸温度进行20个〗盾环。使用标准技术将PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉属表达载体pMStr57中。表达载体pMStr57含有与pCaHj483(WO98/00529)相同的元件，并如WO01/12794中对载体pMT2188所描述的具有对曲霉属NA2启动子的最少修饰，并有在大肠杆菌中筛选和繁殖的序列，和在曲霉属中筛选和表达的序列。具体地，通过构巢曲霉的amdS基因使在曲霉属中筛选变得容易，其允许使用乙酰胺作为唯一的氮源。在曲霉属(Aspergillus)中的表达由来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导，该启动子被融合到来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5，前导序列，并且终止子来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶的编码基因。将所得到曲霉属表达构建体pMStr77的磷脂酶编码基因测序，序列与以前测定的FM0700的插入子完全一致。使用标准技术(Christensen,T.etal.,1988)用pMStr57转化米曲霉菌抹BECh2(WO00/39322)。将转化体在YP+2%G培养基中于30°C,275RPM摇动培养，并用SDS-PAGE监测FvPLA2的表达。发明者将含有从镶片镰孢来的磷脂酶编码基因的大肠杆菌(Eschericiacoli)菌株才姿照Budapest条约的条款保藏，DeutsceSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德国，贮存日期为2003年2月12日，登录号为DSM15442。实施例5:FvPLA2的纯化和序列比对将从实施例4发酵物的FvPLA2在SP-琼脂糖柱上用离子交换层析纯化，其中柱用50mM乙酸盐缓冲液pH4.7平tf并用lMNaClpH4.7洗脱。级分用SDS-PAGE分析，将含有14kDa蛋白质的级分混合。纯的蛋白质的同一性通过测定N-末端序列来确认，其与SEQIDNO:16的氨基酸(aa)29-40序列相同。此外，由于从SDS-PAGE估计的表观大小，14kDa,小于通过加工SEQIDNO:16中理i仑肽而预测的肽的大小，所以用质谱分析判断肽的质量。发现纯化的，激活的FvPLA2质量为13336kDa。此分子质量意味着在C-末端的另外的加工，并与SEQIDNO:16中氨基酸149和150间的断裂一致，因为从氨基酸29到149的肽序列具有理论质量13335,66Da。加工成熟的肽(SEQIDNO:16的氨基酸29-149)与已知序列的比对显示最接近的本领域的以前序列是从UnisequenceID:VD0100C34翻译的大丽花4仑支孢的磷脂酶，其中UnisequenceID:VD0100C34属于COGEME植物致病真菌和OomyceteEST数据库版本1.2(http:〃cogeme.ex.ac.uk/)(Soanesetal.(2002)Genomicsofphytopathogenicfungiandthedevelopmentofbioinformaticresources.MolPlantMicrobeInteract.15(5):421-7)。通过与发现的FvPLA2加工对比估计从大丽花轮支孢序列预测的部分肽的加工。计算SEQIDNO:16的氨基酸29-149与大丽花^"支孢磷脂酶成熟肽的估计序列的同源性为77%。实施例6:FvPLA2的物理特性催化活性对实施例4的FvPLA2用LEU实验来测定作为酶浓度函数的磷脂酶活性。结果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>温度模式测定浓度5.3Mg/ml酶溶液的作为温度函数的酶活性。其他条件同LEU实验。结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>pH稳定性将酶在30°C，特定pH用BrittonRobinson缓冲液稀释30分钟。进一步用水稀释后用LEU实验测定催化活性。结果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>热稳定性将酶在pH3和10时分别用BrittonRobinson緩沖液稀释，在pH7时用30%山梨醇稀释。在特定温度保温30分钟后，将溶液冷却至反应温度并用LEU实验测定。结果如表4所示；活性表示为相对于最高测定的活性。表4.作为PH和温度函数的相对活性(％)__<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例7:用FvPLA2制作干酪用巴氏杀菌的，非均质奶油(北卡罗来纳州大学乳品厂)将五百克巴氏杀菌的，非均质脱脂乳(北卡罗来纳州大学乳品厂)标准化为3.5%脂肪因此生产全月旨mozzarella干酪。将每个实验用的干酪用乳或者用按照实施例5制备的镶片镰孢磷脂酶(FvPLA2),或者用商业磷脂酶Lecitase⑧10L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,丹麦)处理，并放置在35。C水浴中直至平衡至该温度。测量干酪用乳的起始pH并加入0.0P/o(w/w)引子培养物。监测pH直至pH达到6.4。将250ju1凝乳酶(Novozym89L)用去离子水稀释至9ml总溶液，将lml该溶液加入干酪用乳中并用力搅拌干酪用乳3分钟。取出搅拌子并允许凝乳酶凝的乳品放置于35°C。上面的处理之后，当将抹刀插入可以看见明显的边界时则凝乳准备好被切割。干酪的切割通过^l巴刀压下并且当触到杯(beaker)时快速转刀具并最后将刀拔出进行。允许凝乳放置5分钟然后用匙轻轻搅动。温度升至4rc伴随间断的轻轻搅动~45分钟或直至pH降至60,5.9。将凝乳用干酪用粗棉布沥干然后放回杯中并保持在41°C水浴中，根据需要倒出乳清。当凝乳达到pH5.3时，将盛有凝乳的不锈钢^5宛在69。C水浴中浸泡5分钟然后用手4i伸(handstretched)。将凝乳在冷的冰水中回火30分钟。将干酪凝乳用纸巾干燥，称重并冷藏过夜。除了不加磷脂酶，对照干酪制作实验用同一批号乳品按照同样程序进行。实际干酪产量计算为拉伸后干酪的重量相对于干酪用乳总重量。湿度调节过的干酪产量表示为调节至标准恒定湿度水平的实际产量。调节过湿度的产量通过实际产量乘以实际湿度对标准湿度比来计算，并按照下面/^式Yadj=Yactx(l-Mact)/(l-Mstd)其中Yadj"周节过湿度的干酪产量，Yaet-实际干酪产量，Mact=实际湿度分数&Mstd=标准湿度分数((U8)所有实验和对照的调节过湿度的干酪产量如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例8:用FvPLA2制作干酪将乳于72。C巴氏杀菌15秒，然后冷却至l(TC以下。将乳用奶油标准化至2.4°/。脂肪。标准化后将乳在热交换仪中于34.5。C的成熟前温度预加热。每个干酪缸中倒入150克乳并加入15克培养物(F-DVSST-M6)。将实施例5的^#脂酶以5LEU/g脂肪的剂量加入，并且将乳于34.5。C保温1小时。加入凝乳酶(Chy-MaxPlus,200IMCU)并继续搅动不超过4分钟。大约60分钟后，当断定凝固物好了时将其用10mm刀切割。将搅拌子放回缸内并在10分钟后通过在30分钟内升温至4rC起动热燹(scalding)。-当达到4rC后继续搅拌大约20分钟直至达到0.15-0.16%的可滴定酸度。允许凝块^:置在缸中，沥干乳清。将凝块切成均匀一致的块，并将块反转(tum)并堆成2个一组。随后，每间隔10分钟，将凝块反转并堆成2个一组。在pH大约5.15-5.20时，将凝块在碾磨机(millingmachine)上打磨。凝块中加入2%盐(重量/重量)。打磨后将所有凝块加入含有70L预热至74。C水的stretcher中。将大约20L热水转移到上面格子(chamber)中并加入干酪。当凝块温度达到62。C时，终止拉伸并将凝块移至挤压机。将干酪挤压成8-9个干酪块，每个2.3kg，并在5-7。C水中冷却20分钟。将冷却的干酪移至饱和盐水中并在5-6'C腌渍1.5小时。盐水的制作通过混合120公斤水，加入盐至22Be,750克CaCl2(34。/。溶液)并调节至pH5.1。腌渍后将每块干酪干燥大约30分钟，并于真空包装前称重。在冷藏室贮存大约l周后，进行样品的pH和成分分析(湿度，盐，脂肪和蛋白质)。将实际产量(AY)调节成干酪中湿度为48%。调节的产量(AdjYield)=AYxnOO—。/。湿度)100—48表6<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>实施例9:在米曲霉中米曲霉PLA2(AoPLA2)的it^达培养基llgMgS04.7H20lgKH2P042g柠檬酸，一水化物30g麦芽糊精6gK3P04.3H200.5g酵母提取物0.5ml痕量金属溶液lmlPluronicPE6100(BASF,Ludwigshafen，德国)将各成分混合于1升蒸馏水中并分装在烧瓶中，每150ml部分加入250mgCaCO3。将培养基高压灭菌。冷却后向1升培养基中加入下列物质23ml50%w/v(NH4)2HP04，过滤除菌33ml20。/。乳酸，过滤除菌疾量^4溶濕6.8gZnCl22.5gCuS045H200.24gNiCl26H2013.9gFeS047H208.45gMnS04H203g柠檬酸，一水化物将各成分混合在1升蒸馏水中。编码米曲霉磷脂酶A2的cDNA的克隆和局部测序描述于WO00/56762。克隆，AS3812的全长序列，列于SEQIDNO:6。将此序列用于设计引物AoPLAl，其在从AS3812进行PLA2编码基因的PCR扩增中与载体引物pYESrev—起使用，其有加于引物末端的合适的限制性位点以利于PCR产物的亚克隆。AoPLAl:TGAGGATCCATCATGAAGAACATCTTCGFvPLA2.2:gggcgtgaatgtaagcgtgac30使用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(AB-gene，Surrey,U.K.)4要照生产商的说明进行PCR扩增，并在前5个循环中使用52X:的退火温度，后25个循环4吏用62。C的退火温度，延伸时间1.5分^t。使用标准技术将PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉属表达载体pMStr57中(实施例1中描述的)。将所得到曲霉属表达构建体pMStr71的磷脂酶编码基因测序，序列与以前测定的AS3812的插入子完全一致。使用标准技术(T.Christensen,etal,，1988)用pMStr71转化米曲霉菌抹BECh2(WO00/39322)。将转化体在DAP2C-1培养基中于37°C,270RPM摇动培养，并且用SDS-PAGE监测磷脂酶的表达。实施例10:加工肽的纯化和测定将来自实施例9发酵物的米曲霉磷脂酶用购自Pall公司(PallSeitzSchenkFiltersystemsGmbHPianigerStr.137D-55543BadKreuznach,Germany)的0.22nm除菌滤器Seitz-EKS过滤除菌。然后用稀乙酸调节无菌过滤的溶液至pH4.7。然后调节发酵物上清的离子强度以使盐浓度降低并且离子强度在4mSi以下。使用购自AmershamPharmaciaSP-sepharoseTMfastflow,通过阳离子交换层析获得目的PLA2蛋白的纯化。用50mM乙酸盐緩冲液pH4.7(緩冲液A)将阳离子交换基质在购自AmershamPharmacia的XK26柱上填装、洗涤和预平衡。然后将调节了pH和离子强度的含有目的PLA2的发酵物上清加在柱上。将未结合物质用緩冲液A洗去，直至所有吸收UV物质被洗去，其用附加于级分收集器装置的紫外光检测仪监测。然后将结合的蛋白质用缓冲液B线性盐梯度洗脱，其中緩冲液B为在pH4.7的50mM乙酸盐緩冲液含有1M氯化钠的盐。线性梯度达到1M盐浓度的总体积大约是500ml(10倍柱体积)。在洗脱中每10ml收集为一个级分。用购自Sigmachemicals的卯磷脂作底物测定所有级分的磷脂酶活性。与磷脂酶保温时从卵磷脂释放的脂肪酸用购自Wacochemicals的NEFAC试剂盒检测。用标准SDS-PAGE技术检查含有磷脂酶活性级分的蛋白质纯度。将含有显示出分子量大约16kDa单一条带的目的PLA2的级分混合，其中分子量的测定通过与购自Amersham-Pharmacia的分子量标准对比。纯的蛋白质的同一性通过测定N-末端序列来确认，其中与SEQIDNO:7的氨基酸(aa)37-45序列相同。此外，用质谱分析判断肽的质量。纯的活化的曲霉属PLA2有两种质量，14114和14242Da。这些分子质量意味着在C-末端的另外的加工，并与SEQIDNO:7中氨基酸121和122间的断裂一致，因为从氨基酸37到121的肽序列具有理i仑质量14114.11Da，和在氨基酸122和123间断裂，预计从氨基酸37-123的肽序列理论质量为14242.29Da。实施例11:源于米曲霉和Fusariumvenenatum不完全加工的磷脂酶的表达米曲霉PLA2(AoPLA2)和镶片镰孢PLA2(FvPLA2)在N-和C-末端两端的加工发生在单个或多个基本残基上(赖氨酸或精氨酸)，是经常负责前肽加工的Kexin-样成熟酶的典型断裂位点(Jalving,R.，etal.(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:363-368)。为了测定加工对AoPLA2和FvPLA2活性的影响，将酶在Kexin缺陷米曲霉株中表达。然后用SDS-PAGE评价加工，测定野生型和Kexin缺陷型本底(background)表达AoPLA2和FvPLA2的菌株培养物的磷脂酶活性。通过本领域建立的方法，例如WO98/12300和US6013452描述的破坏米曲霉的kexB基因(EMBL:AB056727)构建Kexin缺陷的米曲霉菌抹(kexB—)。KexB的破坏通过Southern印迹分析和通过监测已知由kexB负责其成熟的肽的表达确认。将KexB—菌抹用实施例9描述的AoPLA2表达构建体和实施例4描述的FvPLA2表达构建体转化。将这些菌才朱，连同实施例9和4描述的kexB+的AoPLA2和FvPLA2表达菌抹在YP+2%G中于3(TC发酵，并用未转化的菌抹作为对照。将AoPLA2表达菌株于200RPM摇动培养4天，而将FvPLA2表达菌抹摇动275RPM培养3天。用SDS-PAGE评价磷脂酶的表达和加工。SDS-PAGE分析中，分辨出AoPLA2在kexB+和kexB—的菌林中都为清晰的单一条带。当表达在kexB+菌株时，AoPLA2电泳在ca.l6kDa处，与前面观察到的完全加工的AoPLA2(实施例10)迁移一致，而在kexB—菌抹，AoPLA2电泳在ca.27-28kDa处，与缺乏加工或不完全加工的一致。当表达在kexB+菌株时，分辨出FvPLA2为表观分子量17kDa和14kDa的两条带。14kDa条带相应于完全加工的肽(实施例5)，而17kDa肽是部分加工的形式。当表达在kexB—菌抹时，FvPLA2泳在ca.l8-19kDa的单一条带，大小与不完全加工的一致。来自未转化的菌抹的任何对照样品未观察到相似条带。相对的条带强度表明AoPLA2在kexB-菌林中的表达是其在kexB+菌抹表达水平的1/5至1/10，而FvPLA2在kexB—菌抹中的表达与其在kexB+菌抹表达水平相同至1/2。用LEU实验判断每种菌株产生的磷脂酶的活性并表示于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><110>诺维信公司(NovozyraesA/S)<120>磷脂酶表达<130>10342.504-W0<騰16<170>Patentlnversion3.2序列表<210><211〉<212><213>1211PRTTuberborchii<■〉ValMet1LysAlaAlaAlalieAlaAlalielieLeuLeuMetGlylieLeuAlaAsn51015lie20SerAsnAlaGluVallieAlaGlu35ThrGinlieThrGluProThr5055ProValSerGluProAlaAlaLeuAsnLysArgGlyAspValProAspPheAsn45AspArgGlyAspValAlaGin40Pro25ThrAspGluThrAsnLeuSerThrAsplie6570GlyAspGluGlyGlyValPro75AspPheAspValGluThrGluAlaArgGly60Ala80SerPheAlaAlaSerSerValSerAlaAlaLeuSerProVal8590Ser95LysSerAspArgAla105AspThrAspArgLeuLeuTyrSerThrAlaMetProAlaPheLeuThrAla100105110CysCysAsn115LysAsnProGlyAsnLeuAspTrp120SerAsp125LysSerProAspArgProAlaGlyPheAsn130135PheLeu140Leu110AspAspGlySerCysLys145ArgHisAspPhe■ThrGluAlaAsnGly150Arg165LysTyrAsnGluCysAlaLysCys180TyrArgTyrArgAsnTyrLysLysGinHisArg155lieAspAspAsnPheLys170SerGlyLeuGluSerTrpPhe160LysAspLeu175Gly185Lys190GlyValAlaCysArgLyslieAlaAsnThrTyrTyrAsp195200GlyTrpLeu210AlaVal205ArgThrPhe〈210〉2〈211〉588<212>DNA〈213〉大丽花轮枝孢(Verticilliuffldahliae)<220>〈221>misc_feature<222>(25〉..(26)〈223>n为a，c，g,或t〈220><221>CDS〈222〉(72).,(587)<400〉2cagtttgaagtcccagcccctgctnntcctcctgcttctccccgtccagtctttgggatt60ttcctctcatcatgaagttcaacgcaattetcctggccetcgtgcctgcc110MetLysPheAsnAlalieLeuLeuAlaLeuValProAla1510gccctggetctgcccaccaccgacgaggcgcagacccccaagetcgccAlaLeuAlaLeuProThrThrAspGluAlaGinThrProLysLeuAla152025158gcgAla30cgcArgcagGinageSeratelieacgThr35gccAlagtcValThrgacAspagectgSerLeu40tecSerttcPhetecSerctgLeu45206acgThrctgLeucctProcagGinttcPhe50ThracgThrcgcArgcgcArgAsn55aaccgcAsnArgAsnProgccAla60254AsnetcgactggagetecgacggctgcacaacgtctcctgacaacccattcLeuAspTrpSerSerAspGlyCysThrThrSerProAspAsnProPhe657075302ggattcccctttgtgccggcctgccaccgccacgac"tttggctaccac350GlyPheProPheValProAlaCysHisArgHisAspPheGlyTyrHis808590aacttccgcgcccagacccgcttcaccgagageaacaagetccgcate398AsnPheArgAlaGinThrArgPheThrGluSerAsnLysLeuArglie95100105gacaaccagttcaggaccgatctgaggttccagtgccagtcttegage446AspAsnGinPheArgThrAspLeuArgPheGinCysGinSerSerSer110115120125gtgcgcggcgtgtgcaacgccctggcggacgtctactactctgccgtc494ValArgGlyValCysAsnAlaLeuAlaAspValTyrTyrSerAlaVal130135140egggcgUcggcggtgacgacgccacccccggcaagagggacgagcac542ArgAlaPheGlyGlyAspAspAlaThrProGlyLysArgAspGiuHis145150155tcggaaetcgtcggcatetacgacgagaaggtcggcatetacgata588SerGluLeuValGlylieTyrAspGluLysValGlylieTyrAsp160165170<210〉3<211〉172<212〉PRT<213〉大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)〈400〉3MetLysPheAsnAlalieLeuLeuAlaLeuValProAlaAlaLeuAla151015LeuProThrThrAspGluAlaGinThrProLysLeuAlaAlaArgGin202530SerlieThrAlaValThrAspSerLeuSerPheSerLeuThrLeuPro354045GinPheThrThrArgArgAsnAsnArgAsnProAlaAsnLeuAspTrp505560SerSerAspGlyCysThrThrSerProAspAsnProPheGlyPhePro65707580PheValProAlaCysHisArgHisAspPheGlyTyrHisAsnPheArg859095AlaGinThrArgPheThrGluSerAsnLysLeuArglieA印AsnGin100105110PheArgThrAspLeuArgPheGinCysGinSerSerSerValArgGly115120125ValCysAsnAlaLeuAlaAspValTyrTyrSerAlaValArgAlaPhe130135140GlyGlyAspAspAlaThrProGlyLysArgAspGluHisSerGluLeu145150155160ValGlylieTyrAspGluLysValGlylieTyrA印165170<210>4<211>185<212>PRT<213>粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)<400>4MetLysPhePheSerAlaLeuAlaLeuSerSerLeuLeuProThrAla151015AlaTrpAlaTrpThrGlySerGluSerAspSerThrGlyAlaAspSer202530LeuPheArgArgAlaGluThrlieGinGinThrThrAspArgTyrLeu354045PheArglieThrLeuProGinPheThrAlaTyrArgAsnAlaArgSer505560ProAlaThrLeuAspTrpSerSerAspSerCysSerTyrSerProAsp65707580AsnProLeuGlyPheProPheSerProAlaCysAsnArgHisAspPhe859095GlyTyrArgAsnTyrLysAlaGinSerArgPheThrAspAsnAsnLys100105110LeuLyslieAspGlyAsnPheLysThrAspLeuTyrTyrGinCysAsp115120125ThrHisGlyTyrGlySerThrCysHisAlaLeuAlaAsnValTyrTyr130135140AlaAlaValArgGluPheGlyArgThrLysGlyGluLeuGinGluGlu145150155160TyrAspLeuLeuLeuAlaHisTyrAsnGluLeuValAlaGluAlalie165170175AlaLysGlyGluAspProLeuTyrTyr180185<210〉5<211〉169<212>PRT<213>Helicosporiumsp.<400>5Met1AlaAla10Ser15LysSerPheThrPheValValLeuAlaLeuLeuProPheSerSer5LeuThrlieProPhe20GluGlu35GlyThrLeuThrPheHisArg25AspThrLeu40GlyGlylieAlaSerArgAla30LeuPheSerThrProlieAla45GinPheGluAlaAlaArg50Ser65SerAspGlyPheLeuSerSerLysGinPheLysAsnArg100ThrAsp115AsnAlaGin55AsnProSerThrLeuAspTrp60AspCysSerSerSerProAspAspProPheGlyPhe70Asp75CysHisArgHisAspPheGly8590PheThrMetTyrThrArgAlaAlaCysLys130AlaProAsn105AsnGinCys120AlaValAla135TyrLysAlaArgAsnThrGluArglieSer125Asp80AsnTyrLys95AspThrAsn110AsnliePheAsplieTyrTyrGluAlaVal140145ThrPheGlySerLys150LysArgAlaAlaGluAlaLeuAlaAla155GinMetGluGluAsnValAlaLysAla165160<210〉6<211〉942<212〉隨<213>米曲霉(Aspergillusoryzae)<220〉<221>CDS〈222〉(61).,(726)〈400〉6cgcaagcatcacatctacttcttattgcctattctgtccgagtgctagccacttatcatcatgMet1LysAsn￡ttClieUcPhe5gttgccAlasetThrttgLeuGly10ctgLeuUcPhegccAlagC3AlagttVal15tcgSer60薦tctSergccAlattgLeuPro20t3caca3CCTyrThrThrcctProgtcVal25AsngacAspProa_tclie30tctSergetAla156LeuGingcaAla35cgcArggcgAlaThrThrtgcCys40tcgSergccAla33gLysgccAlaacgThr45gatAspAsnetcLeu204atettcaaggtctecatgaagaccttccagaaggcgcgcaaggccaag252liePheLysValSerMetLysThrPheGinLysAlaArgLysAlaLys505560aacccctecaagtgcaactggteateggacaactgctecaagteaccc300AsnProSerLysCysAsnTrpSerSerAspAsnCysSerLysSerPro65707580gataagcccgatggatacaacttcatecccagetgccaaagacacgat348AspLysProAspGlyTyrAsnPhelieProSerCysGinArgHisAsp859095ttcggctaceggaacacgaagaagcagaagcgcttcacaaaggccatg396PheGlyTyrArgAsnThrLysLysGinLysArgPheThrLysAlaMet100105110a^gaagcgcattgacgac犯cttcaagaaggatetctacaagtactgc444LysLysArglieAspAspAsnPheLysLysAspLeuTyrLysTyrCys115120125agecaaUctegggctggageteatggaagggagtggagtgccgtcgc492SerGinPheSerGlyTrpSerSerTrpLysGlyValGluCysArgArg130135140cttgcggatgtctactatactgetgtccgccactttggcaagcgtgat540LeuAiaAspValTyrTyrThrA〗aVa〗ArgHisPheGlyLysArgAsp145lbo155160gaagcgcUgagtttgaccctgaggttgagUcgagaagcgtgatgag588GluAlaLeuGluPheAspProGluValGluPheGluLysArgAspGlu165170175gtggccgatgtccagcctgacgaatttgataac"tttgacggttctgaa636ValAlaAspValGinProAspGluPheAspAsnPheAspGlySerGlu180185190gttgaccctgatategagggccaggtcattcccgaagttcttgaaga/t684ValAspProAsplieGluGlyGinVallieProGluValLeuGluAsp195200205gatggagtggatgtggagaacetcgacgatattgaaaacctg726AspGlyValAspValGluAsnLeuAspAsplieGluAsnLeu210215220taggttttcggcattggctctacactttgcaaatgggtcgtcataatccattggaagccg786gaggaggagggaaatcaaggcatcttttggttg"tcagtaactttgagtgcctagtttgtg846aattgttttttgaggttctatttgaattctgcttttgttcaatcttatagcttcctacgt906tgttgtcatttaaaaatggacaggagtatctgtgag942〈210〉7<211>222〈212>PRT<213>米曲霉(Aspergillusoryzae)<400〉7MetLysAsnliePheValAlaThrLeuGlyLeuPheAlaAlaValSer151015SerAlaLeuProTyrThrThrProValAsnAspAsnProlieSerAla202530LeuGinAlaArgAlaThrThrCysSerAlaLysAlaThrAspAsnLeu354045liePheLysValSerMetLysThrPhe5055GinLysAlaArgLysAlaLys60AsnProSerLysCysAsnTrpSerSerAspAsnCysSerLysSerPro65707580AspPheLeu145GlyLysProAspGlyTyrAsnPhelieProSerCysGinArgHisAsp859095TyrArgAsnThrLysL>ysGin100105ArglieAspAsp115AsnPheLys120SerGinPheSerGlyTrpSerSerTrp130135ThrAlaValAlaAspValTyrTyr150LysArgPheThrLysAlaMet110LysAspLeuTyrLysTyrCys125LysGlyValGluCysArgArg140ArgHisPheGlyLysArgAsp155160GluAlaLeuGluPheAspProGluVal165GluPheGluLysArgAspGlu170175ValAlaAspValGinProAsp180ValAspProAsplieGluGly195GluGin200PheAspAsnPheAspGlySerGlu185190VallieProGluValLeuGluAsp205AspGlyValAspValGluAsnLeuAsp210215AsplieGluAsnLeu220〈210〉8〈211〉249<212〉PRT<213>粗糙链孢霉(Neurosporacrassa〉〈400>8MetLysProPhePheLeulieSerLeuLeuValThrValPheMetSer151015LeuMetLeuAlaThrThrAlaGinProSerLeuProLeuAsnAsnArg202530ArgGluLeuAlaGluHisProProValLysGlyAsnProProAsnThr354045GlyTyrAlaLeuAspTrpCysLysTyrThrAlaGlyMetLeuPheGin505560TrpAspLeuProThrPhelieLysHisArgGluAlaAsnPheSerLeu65707580GlyArgLeuThrTrpAspTrpSerSerAspGlyCysThrHisValPro859095AspAsnProVaiGlyPheProPheLysProAlaCysGinArgHisAsp100105110PheGlyTyrArgAsnTyrGinValGinPheHisPheThrProArgAla115120125ArgTrpLyslieAspGluAsnPheLeuLysGluMet匕ysPheGinCys130135140lieGlyHisAsnliePheAsnAlaCysHisPheMetAlaHisValTyr145HisSerSerAsnLeu225TrpGluAspPro210AlaGlyProVal195TyrArgValArg165SerHis180PheAspLeuSerTyrAsn150ThrPheLysMetGlyMetGluGlu215LysCys230TyrMetAsp200LysValLysAsp185AlaThrGluGly170ThrAspLysGlu155HisGluGinTyrMetValAlaGluAlaGluAla235Tyr220MetArg205TyrAlaArg175160GluSer190GluSerAspAlaLeuAspGinArgGlyAlalie240AspLeuGinLysTyr245TrpAlaAlaPhe<210〉〈211〉<212>〈213〉9832DNATuberalbidum<220〉<221〉CDS<222〉(2)..(426)<220>〈221>CDS<222>(476)..(680)<400>aatgMet19gtcaagattgetgccattgtcetcetaatgggaattetagccaatValLyslieAlaAlalieValLeuLeuMetGlylieLeuAlaAsn5101549getgccgccatecctgtcagegagccagcagccctggcgaagcgtggaAlaAlaAlalieProValSerGluProAlaAlaLeuAlaLysArgGly20253097aacgetgaggtcattgetgaacaaactggtgatgtcccggatttcaacAsnAlaGluVallieAlaGluGinThrGlyAspValProAspPheAsn354045145actcaaattacaga_gccaactggggagggagaccgtggggatgtggtcThrGinlieThrGluProThrGlyGluGlyAspArgGlyAspValVal505560193gacgaaaccgatttgtecacggatattgtcccagagaccgaggetgetAspGluThrAspLeuSerThrAsplieValProGluThrGluAlaAla65707580241tecSerttcPhegccAlagetAlaagtSer85teaSerValtctSergcaAlagccAla90teaSerProgcaAlatctSergacAsp95Thr289gacAspaggArgcttLeuetcLeu100tacTyrteaSerThrtecSerMet105ProgccAlattcPhettgLeuactThr110getAla卿337cgcArgAsn朋gLys115AsnProggcGlyAsnttgLeu120g3CAsptggTrpageSergatAspAsp125ggaGlytgcCysageSer385aactecccggacaggcctgcagggtttaacttccttgactc426AsnSerProAspArgProAlaGlyPheAsnPheLeuAspSer130135140gtaagtcctccttcatttatgctatctacattcacta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AlaAspValTyrPheAlaAlaValArgAlaPheGlyGlyAsp130135140AspAlaThrProGlyLysArgAspGluAlaLeuValLysGluTyrGlu145150155160LysLysValGluValTyrAsnLysLeuValGluGluAlaGinLysLys165170175GlyAspLeuProArgLeuAsp180权利要求1.生产磷脂酶的方法，其包括加工被表达的真菌肽以从C-末端裂解肽和/或从N-末端裂解肽以获得有磷脂酶活性的核心肽，其中核心肽包括a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO1的氨基酸146-153，SEQIDNO3的氨基酸87-94，或SEQIDNO12的氨基酸79-86；或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与这些氨基酸序列任何一个相同的序列；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的至少两个半胱氨酸残基。2.权利要求1的方法，其中被表达的肽在用编码被表达肽的DNA转化的丝状真菌宿主细胞中表达。3.权利要求2的方法，其中宿主细胞是曲霉属，镰孢属或木霉属，特别是米曲霉，黑曲霉，镶片镰孢或里氏木霉。4.权利要求2的方法，其中表达的肽被宿主细胞在体内加工。5.权利要求l-4任一项的方法，其中核心肽长度为100-150个氨基酸。6.权利要求1-5任一项的方法，其中磷脂酶具有特定的磷脂酶活性，其是表达的肽加工前活性的至少2倍。7.权利要求l-6任一项的方法，其中被表达的肽源自Tuber,轮枝孢属，脉孢菌属，曲霉属，或Helicospomm,特别是T.borchii,T.albidum，大丽花轮支孢，V,tenerum,粗糙脉孢菌，米曲霉或Helicosporiumsp.HN1。8.权利要求1-7任一项的方法，其中当完全表达的肽序列与SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:IO,和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，一皮表达的肽在与SEQIDNO:1氨基酸97-101比对的序列的N-末端侧0-18氨基酸内裂解。9.权利要求1-8任一项的方法，其中当完全表达的肽序列与SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10,和SEQIDNO:12给出的序列同时比对时，被表达的肽在与SEQIDNO:1氨基酸204-209比对的序列的C-末端侧0-11氨基酸内裂解。10.权利要求l-9任一项的方法，其中被表达的肽的裂解在Kex2加工位点的10个氨基酸内或FG序列的ll个氨基酸内或两者。11.水解磷脂的方法，其包括将磷脂与权利要求l-10任一项方法生产的磷脂酶接触。12.生产干酪的方法，其包括将干酪用乳或干酪用乳的成分与磷脂酶接触，其中磷脂酶包括a)下列给出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94,或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一个氨基酸取代单个氨基酸外与任何这些氨基酸序列等同的序列；和b)位于a)给出的序列的N-末端侧的至少两个半胱氨酸残基；和c)位于a)给出的序列的C-末端侧的至少两个半胱氨酸残基。13.生产干酪的方法，其包括将干酪用乳或干酪用乳的成分与权利要求l-10任一项方法生产的磷脂酶接触。全文摘要本发明涉及通过加工表达的真菌肽生产磷脂酶的方法和某些特定的磷脂酶。而且本发明提供用磷脂酶生产干酪的方法。文档编号C12R1/645GK101319204SQ20081010875公开日2008年12月10日申请日期2004年4月23日优先权日2003年4月28日发明者沙姆坎特·A·帕特卡,玛丽·A·斯特林格,蒂恩·M·法塔姆申请人:诺维信公司;克尔.汉森公司