专利名称：：微生物催化法生产亚氨基二乙酸及其菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物催化水解亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，及制备过程中所用的一林新菌林——粪产碱杆菌(j/Ca//ge"M/脏幽)ZJUTBIO。(二)
背景技术：
草甘膦，英文名Glyphosate,商品名农达、农民乐等，分子式C3H8N05P,分子量169.08，外观为白色固体，不溶于有机溶剂，属芽后内吸非选择性高效广谱灭生性除草剂，通过溶解杂草的叶直径表面蜡质层，药效迅速进入植物传导系统产生作用，使杂草枯竭死亡，具有广谱、低毒、无残留、内吸传导和优良的灭生性等特点，对植物无选择性，一般所有绿色植物，无论是作物还是杂草，着药后即被杀伤。近年来，草甘膦一直是全球产量最大的农药原药除草剂品种，占据世界农药销售额首位，且每年以20%左右的速度递增，预计2010年全^求需求量将达100万吨。目前，世界农药市场销售额高达300亿美元左右，全球除草剂共约有600个品种，其中草甘膦占全球除草剂总量高达30%,市场销售额约为150亿美元，占整个农药市场的50%。美国孟山都(Monsanto)化学公司于20世纪60年代筛选合成了草甘膦，由于该产品能杀死大多年生深根性难除杂草，低毒、无残留、在动物和水生物中不积累，入土后随微生物降解，不会造成土壤及地下水的污染等优异特点，因此一经问世即引起世界农业界的广泛关注。孟山都公司多年来将草甘膦当作主导产品之一，在美国、西欧、南美等地投入数十亿美元，建立了几套万吨级的原药生产厂，年产量20万吨以上，在世界许多地区相继建立了制剂调配厂。2001年孟山都草甘膦专利到期后，我国企业凭借自有技术迅速发展和数家万吨级草甘膦生产企业的优势，已占据世界草甘膦市场的20%左右份额。草甘膦的合成工艺路线很多，但归纳起来，目前国内外在工业生产上采用的合成路线主要是两条亚氨基二乙酸路线(IDA法)和甘氨酸路线。IDA法是用亚氨基二乙酸(IDA)在强酸环境下(31%盐酸)与亚磷酸、曱醛缩合反应生成双甘膦(PMIDA),PMIDA再氧化生成草甘膦。反应原理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>IDA法由于具有具有流程短、收率高和不产生污染等诸多优势，该法生产的草甘膦占世界草甘膦生产总量75%。应用IDA法的主要公司是美国孟山都公司。上世纪90年代中后期，孟山都专利到期后国内仿制出IDA路线，由于IDA法生产的草甘膦易于进入欧美市场，因此最近几年来国内新建企业几乎都是采用IDA路线。IDA法生产草甘膦的关键原料为亚氛基二乙酸，IDA的制备有4种方法氯乙酸法、二乙醇胺脱氬氧化法、氬氰酸法、亚氨基二乙腈化学水解法。1、氯乙酸法氯乙酸法是国内最早研究和投产的IDA生产方法，用氯乙酸和NH3、Ca(OH)2反应制得IDA钙盐，再用盐酸酸化即可得IDA。由于收率低(70%左右)，产品含量低，对环境污染大、劳动条件差、生产规模小。已遭淘汰。2、二乙醇胺法用二乙醇胺在高压、催化剂作用下与NaOH溶液反应脱氢，得到亚氨基二乙酸二钠盐(MSIDA),再用浓盐酸酸化制取IDA。反应原理如下,CH2CH2OHCH2COONaHNZ+2NaOH^HN\+4H2f\CH2CH20HCH2COOMaCH2COONaCH2COOHH<+2HC1~~H(+2NaClCH2COONaCH2COOH该工艺优点是IDA收率高，产品获国际认可，副产物H2可回收利用。缺点是原料二乙醇胺主要依赖进口，由于2004年底二乙醇胺反倾销后，成本大幅提升，导致此工艺盈利能力下降，价格高；需要高压反应釜，设备投资大，安全要求高，能耗大。3、氢氰酸法用HCN、0120和(CH2)6N4经过缩合、水解、酸化等反应，制得IDA。该工艺是HCN由天然氨和氯合成，浓度较低，HCN剧毒，操作难度大。氢氰酸法是国外主要采用的工艺，国内氢氰酸的原料来源存在问题，该法在我国未得到发展。4、亚氨基二乙腈化学水解法用NH(CH2CN)2经在催化剂作用下经NaOH碱解、浓盐酸酸化合成IDA。该工艺反应原理如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>亚氨基二乙腈化学水解法是近几年才发展起来的一种路线，与乙醇胺路线相比，成本低，亚氨基二乙腈廉价易得，所以亚氨基二乙腈法将逐渐成为国内合成IDA的主导工艺，目前亚氨基二乙腈法制备IDA都是采用化学水解法。但这种方法存在的问题是用化学水解法制备1吨亚氨基二乙酸用浓盐酸酸化至少产生废水6吨。而且废水中还含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等难处理的盐类。该法能耗高、反应条件苛刻，而且对i殳备要求高、生产成本高、对环境污染严重。采用微生物腈水解酶可能快速地将亚氨基二乙腈水解成亚氨基二乙酸。有望开发反应条件温和、高效、操作简便和对环境友好的生物催化法新工艺，克服化学水解法存在的缺点，在提高经济效益的同时，减小环境污染，降低能耗。目前国内外尚没有生物催化水解亚氨基二乙腈生产草甘膦中间体亚氨基二乙酸的报道。
发明内容为克服上述技术的缺陷，本发明提供了一种微生物催化水解亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，及制备过程中所用的一林新菌林——粪产碱杆菌(々ecato)ZJUTB10。本发明采用的技术方案是一种微生物催化水解亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亚氨基乙腈为底物、以粪产碱杆菌ZJUTBIO培养获得的腈水解酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0~9.0、1060°C下进行水解反应，得到所述亚氨基二乙酸。粪产碱杆菌ZJUTBIO可发酵得到腈水解酶，在通过腈水解酶生物催化水解亚氨基二乙腈得到产物亚氨基二乙酸，反应式如CH2CN月青zR解酷^CH2COOHHN、+4H20-^<+訓CH2CN、CH2COOH亚氨基二乙腈亚氨基二乙酸粪产碱杆菌(j/ca"ge"^/aecafc)ZJUTB10,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。该菌4朱由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。所述反应体系中底物亚氨基乙腈初始浓度为0.050.2mol/L。反应过程中，当底物浓度低于0.01M时，可以继续补入底物亚氨基乙腈至亚氨基乙腈浓度为0.05~0.2mol/L,以达到连续生产的效果。所述腈水解酶存在于菌体细胞中，具体制备时，可直接将发酵获得的含菌体细胞的发酵液作为催化剂参与反应，也可将菌体细胞分离后，作为催化剂参与反应。本发明中所述腈水解酶来自粪产碱杆菌ZJUTBIO培养获得的含酶细胞，每10ml反应体系添加所述含酶湿细胞量为0.10.5g(其酶活约为525U/g湿细胞)，反应体系中亚氨基乙腈的浓度为0.05~0.2M。酶活的定义lh转化亚氨基二乙腈生成1jaM亚氨基二乙酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。具体的，所述含酶细胞由如下方法制备得到粪产碱杆菌ZJUTBIO接种至适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，于2040。C下培养2496小时，并在培养开始o~6小时时间内加入终浓度为0.1%0.5%的诱导剂，所述诱导剂为下列之一正丁腈、异丁腈、己内酰胺，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得到所述含酶细胞。所述适用于用于本发明菌种粪产碱杆菌ZJUTB10的培养基，可以是一些含有可以被粪产碱杆菌利用营养物质的常规培养基，液体、固体均可，但是大量工业化生产时，液体培养基较为合适。培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有葡萄糖，醋酸铵，乙腈，乙酸，乳酸，柠檬酸钠；作为氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)；另可加有氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸等)、微生素(VBi、VB2、VB12、Vc、VE、烟酸等)、核酸类(如噪呤、嘧啶及其衍生物等)。用无机酸或有机酸、碱类调节培养基的pH值，还可加入适量的消泡剂，如泡敌等。本发明中，所述适用于粪产碱杆菌的发酵培养基组成如下醋酸铵0.5%~2.0%，酵母膏0.3%~0.8%,K2HP040.3%~0.8%，MgS040.01%~0.1%,FeSO40.001%~0.01%,NaCl0.05%0.5%,pH7.0~8.5。若没有特别说明，本发明中百分比浓度均是质量体积百分比浓度(w/v),某组分百分比浓度为1%是指lOOmL溶液中含有该组分lg。发酵培养可采用培养方式有静置培养、摇动培养、或通风搅拌培养等，大量培养菌体时宜采用深层通风搅拌培养。所述发酵培养可在摇瓶中进行，也可在发酵罐中进行。摇瓶培养在三角瓶中装入适量的发酵培养基(1070%,v/v),灭菌后用接种针挑入一定量的斜面菌种，在2040。C下，旋转式摇床(100300rpm)中进行发酵培养，在培养06h的过程中，力口入0.1~0.5%的诱导剂，经过2496小时的发酵培养，获得含腈水解酶的发酵液。发酵罐培养在种子罐中装入适量的发酵培养基(40~70%，v/v)，灭菌后接入一定量的菌种，在温度2040。C，搅拌转速100300rpm的条件下培养24~72小时，得到种子液，在50L20M3的发酵罐中装入适量的发酵罐发酵培养基(4070%,v/v),实罐消毒后接入210%(v/v)的种子液，在通气比0.1-1:1(每分钟内通过的空气体积与培养液体积之比)，搅拌转速100300rpm，温度2040°C的条件下进行发酵培养，在培养06h的过程中，加入0.1%0.5%的诱导剂，经过648小时的发酵培养，获得含腈水解酶的发酵液。诱导剂可以是正丁腈、异丁腈、己内酰胺。得到菌体培养液后可采用离心或过滤等方式分离出菌体细胞，利用该微生物细胞或固定化细胞或从该细胞中分离出的腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸。发酵液经过离心或膜过滤系统进行酶细胞菌体的收集，用湿菌体或其固定化细胞作为酶源，然后制备生物催化剂。发酵液在分离因素(离心机旋转起来，在离心机转鼓壁上进行分离的物料受到的离心加速度和地球重力加速度g的比值fe3000的条件下离心，弃去上清液，细胞用去离子水洗涤后在离心，收集浓缩的湿细胞；或者发酵液用膜过滤系统进行膜分离过滤，并加入2倍发酵液体积的去离子水洗涤，收集浓缩的湿细胞，收集的含酶细胞可以直接作为催化剂。其中的膜过滤系统可以是中空纤维膜或巻式膜或陶瓷膜或超滤膜。亚氨基二乙腈溶液的生物催化反应可在水或pH69的磷酸盐緩冲液或水-有机介质或微水有机反应介质中加入生物催化剂，加入底物亚氨基二乙腈进行反应，pH控制在6.0-9.0之间，反应温度控制在1060。C之间，搅拌速度控制在50500rpm之间。反应方式可以是批式反应或者连续式反应。在批式反应中底物可一次性加入，或者间歇分多次加入，或流加，在任何时刻都必须保证底物的加入量不会使反应液中的底物浓felM,反应时间根据反应的具体情况而定，反应结束时应保证底物浓度尽可能低，这可以通过停止加料后延长反应时间，或通过补加少量生物催化剂反应一段时间来达到这一要求，反应结束后通过离心或膜过滤系统分离得到反应清液；在连续反应中，底物可一次性加入，或间歇分多次加入，或流加，在任何时刻都必须保证底物的加入量不会使反应液中的底物浓度三1M,当产物浓度累积达到一定值20.09M(以亚氨基二乙酸计)时，可通过膜过滤系统一次性，或者分多次间歇地，或者连续地分流出反应清液，同时可一次性，或者间歇分多次地，或者连续地不加反应介质和底物，并根据反应情况，可一次性，或者间歇分多次地。或者连续性的补加新的生物催化剂，以保证反应可连续进行。具体的，所述应用方法如下(1)粪产碱杆菌ZJUTB10接种至种子培养基，30°C、200rpm下培养24小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下醋酸4妄1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%,MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,pH7.5;(2)发酵培养基以6%体积比接种量接种种子液，30。C下进行培养，于培养开始6小时时加入终浓度为0.3%的正丁腈，发酵培养总时间4896小时，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下醋酸铵1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%，MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%，pH7.5;(3)取发酵液，膜过滤分离得到的菌体细胞以去离子水洗涤，得到细胞液，取细胞液以去离子水稀释至细胞浓度为10~50g/L,加入底物亚氨基乙腈至亚氨基乙腈浓度为0.05~0.2mol/L,于2040°C、100300rpm下进行水解反应2472小时，水解反应结束后，于水解液中得到所述亚氨基二乙酸。本发明中产物的分析测定方法取0.1mL水解液，力。1mL0.5mol/L的NaHC03溶液、0.4mL1%的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液和lmL蒸馏水，在60。C下避光反应30min后，衍生化完后，再加7.5mL0.2mol/LpH为7的磷酸緩冲液。然后进行HPLC分析4全测，色谱柱EliteCl8色谱柱(250nmx4.6nm);流动相曱醇乙酸-乙酸钠水溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠水溶液体积比为55:45，乙酸、乙酸钠物质的量浓度均为0.05mol/L);流速1.0mL/min;-险测波长为365nm;柱温为30°C。本发明技术与现有的技术比较具有明显的优点1)废水产量少。用化学水解法制备1吨亚氨基二乙酸如果用浓硫酸酸化至少产生废水5吨，用浓盐酸酸化至少产生废水6吨。而且浓碌u酸酸化法废水中还含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等难处理的盐类。如果用腈水解酶生物催化法生产亚氨基二乙酸，废水中难处理的杂质含量少，更利于实现清洁生产。2)反应条件温和。化学水解法需要在100。C左右进行，必须配备加热和温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高。而生物催化法一般都是在常温下进行，反应条件温和设备成本相对较低。3)成本低。化学水解法的原料除了亚氨基二乙腈外还有NaOH浓溶液、浓^^酸或浓盐酸，所需原料多；生产成本高而生物催化法一:l殳只需亚氨基二乙腈作为原料和产腈水解酶细胞作为催化剂，转化率和产率都可达95%以上，原料简单易得，转化率高，成本低。本发明的有益效果主要体现在反应过程中废水产量少，污染少；反应条件温和、能耗低；成本低，转化率高、产率高，易于工业化生产。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:粪产碱杆菌(j/ca//gwes/aecafc)CCTCCNo:M208168的摇瓶发酵培养。分别配制摇瓶发酵培养基A、B、C、D，其培养基组成如下A:醋酸铵0.5%，酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%，用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH调节到7.0。B:醋酸铵1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的盐酸或2M的氬氧化钠将pH调节到7.5。C:醋酸铵2.0%,酵母膏0.5%，K2HPO40.8%,MgSO40.05%，FeS040.003%,NaCl0.03%,用2M的盐酸或2M的氪氧化钠将pH调节到8.0。D:醋酸铵2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%，FeS040.01%,NaC10.5%,用2M的盐酸或2M的氬氧化钠将pH调节到8.5。分别将以上配制好的培养基以lOOmL—份倒入4个250mL摇瓶中，121。C灭菌20分钟。冷却室温后分别接种粪产碱杆菌(爿/^//取"^1/^<^/&)CCTCCNo:M208168到各个培养基中，于30。C，200rpm转速下培养，在培养刚开始时加入0.3g的己内酰胺作为诱导剂，发酵培养48h结束。发酵培养结束后，分别收集发酵液，6000卬m离心收集菌体，分别称取O.lg湿菌体置于含有105mM亚氨基乙腈的10ml反应体系中，在30。C和200rpm的搅拌速度下反应4h，加入浓盐酸溶液终止反应，通过HPLC方法测定反应液中亚氨基二乙酸的量，计算出每克湿细胞中的酶活(U),得到的结果见表l:表l:摇瓶发酵液的湿细胞酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例2:粪产石成杆菌(v4/ca^gew&y/"ec"fc)CCTCCNo:M208168的发酵罐发酵培养配制种子培养基醋@吏铵1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgS040.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%，用2M的盐酸或2M的氬氧化钠将pH调节到7.5。分别配制发酵罐发酵培养基a、b、c、d,其发酵培养基组成如下a:醋酸铵0.5%,酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%,用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH调节到7.0。b:醋酸铵1%，酵母膏0.5%，K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的盐酸或2M的氬氧化钠将pH调节到7.5。c:醋酸铵2.0%,酵母膏0.5%,K2HPO40.8%,MgSO40.05%，FeS040,003%,NaC10.03%,用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH调节到8.0。d:醋酸铵2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%,FeS040.01%,NaCl0.5%,用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH调节到8.5。在5L种子罐中装入3L的种子培养基，灭菌后接入菌种，在温度30°C，搅拌转速200rpm的条件下培养24h，得到种子液；在50L的发酵罐中装入发酵培养基30L,实罐消毒后接入1.8L的种子液，在通气比0.3:1,搅拌转速150rpm,罐压0.05Mpa,温度30。C的条件下，在培养到6h时加入90g的正丁腈作为诱导剂，发酵培养过程中每隔24h分别收集发酵液，6000rpm离心收集湿菌体细胞测定酶活(测定方法同实施例l),结果见表2。表2.发酵罐发酵液湿细胞的酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3:发酵液离心或膜过滤取实施例2中b培养基发酵得到的发酵液2L,分别用低温高速离心机离心(在4。C，12000rpm转速下离心15min)、中空纤维膜过滤(流量150mL/min,压力0.8Kg/cm2)、巻式膜过滤(流量150mL/min,压力16Kg/cm2)、陶覺膜过滤(流量150mLZmir"压力4Kg/cm2)或平板超滤膜(Ultra-fla)过滤(流量150mL/min，压力3Kg/cm2)方法处理发酵液。然后用4L去离子水洗涤细胞，收集湿细胞测定酶活(测定方法同实施例1)，结果见表3。表3:发酵液处理后的湿细胞酶活发酵液的处理方法处理后的含酶湿细胞酶活U/g<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4:取实施例3低温高速离心处理方法得到的湿菌体分别加入lOOmL水中，使湿菌体的浓度为30g/L,加入不同量的底物亚氨基二乙腈，使亚氨基二乙腈的最终浓度分别为0.01M,0.05M，O.IM，0.15M，0.2M。于30。C和200rpm条件下反应24h，用HPLC测定方法测定反应液中亚氨基二乙酸的浓度。结果见表4:表4:浓缩细胞在不同底物浓度下的催化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例5:取实施例3低温高速离心处理方法得到的湿菌体3g,分别加入lOOmL水中，湿菌体的浓度为30g/L，，各加入底物终浓度为0.2M的亚氨基二乙腈，分别在20。C,30°C,40。C条件下，200rpm转速反应96h。用HPLC测定方法测定反应液中氨基二乙酸的浓度。结果见表5。表5:浓缩细胞在不同的温度条件下的催化活性温度(°c)反应结束后转化体系中亚氨基二乙酸的浓度(mM)201403019540180实施例6:取按照实施例3中空纤维膜过滤处理方法得到的浓缩细胞，用不同pH的磷酸盐緩冲液稀释至2L,湿细胞浓度约为30g/L,分别取50mL,各加入终浓度为0.1M的底物亚氨基二乙腈，于30。C和200rpm条件下反应48h,用HPLC测定方法测定反应液中亚氨基二乙酸的浓度。结果见表6。表6.浓缩细胞在不同的pH条件下的催化活性pH反应结束后转化体系中亚氨基二乙酸的浓度(mM)684799899971实施例7:取按照实施例3陶瓷膜过滤方法得到的含酶细胞40g,用2L水稀释，装入于3L的三口反应瓶中，加入底物亚氨基二乙腈的浓度为0.05M,于30°C和200rpm条件下反应，通过HPLC色语跟踪分析，当底物浓度低于O.OIM时，加入底物亚氨基二乙腈，使其终浓度达到0.05M;反应72小时，底物累计加入次数为9次，反应后HPLC色谱分析反应结果，底物亚氨基二乙腈残留浓度〈0.01M,终产物浓度0.4M，亚氨基二乙酸产率89.5%。权利要求1.一种微生物催化制备亚氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亚氨基乙腈为底物、以粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10培养获得的腈水解酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～9.0、10～60℃下进行水解反应，得到所述亚氨基二乙酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物亚氨基乙腈初始浓度为0.050.2mol/L。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于反应过程中底物亚氨基乙腈浓度低于0.01mol/L时，继续补入底物亚氨基乙腈至亚氨基乙腈浓度为0.050.2mol/L。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述腈水解酶来自粪产碱杆菌ZJUTB10培养获得的含酶细胞，所述含酶细胞添加量以含酶细胞湿重计为10~50g/L。5.如权利要求2所述的方法，其特征所述反应在水中或pH69的磷酸盐緩沖液中进行。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述含酶细胞由如下方法制备得到粪产碱杆菌ZJUTB10接种至适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，于2040。C下培养2496小时，并在培养开始06小时时间内加入终浓度为0.1%~0.5%的诱导剂，所述诱导剂为下列之一正丁腈、异丁腈、己内酰胺，培##到的发酵液经离心或膜分离，得到所述含酶细胞。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述适用于粪产碱杆菌的发酵培养基组成如下醋酸铵0.5%2.0%，酵母膏0.3%~0.8,K2HP040.3%0.8%,MgS040.01%~0.1%，FeS040.001%~0.01%，NaCl0.05%~0.5%,pH7.08.5。8.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)粪产碱杆菌ZJUTB10接种至种子培养基，30°C、200rpm下培养24小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下醋酸4妄1%，酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(2)发酵培养基以6%体积比接种量接种种子液，30。C下进行培养，于培养开始6小时时加入0.3°/。的正丁腈，发酵培养总时间4896小时，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下醋酸铵1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%，FeS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(3)取发酵液，膜过滤分离得到的菌体细胞以去离子水洗涤，得到细胞液，取细胞液以去离子水稀释至细胞浓度为10~50g/L，加入底物亚氨基乙腈至亚氨基乙腈浓度为0.05~0.2mol/L,于20~40°C、100~300rpm下进行水解反应2472小时，水解反应结束后，于水解液中得到所述亚氨基二乙酸。9.粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072,保藏编号CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。全文摘要本发明公开了一种生物催化生产草甘膦合成的关键中间体亚胺基二乙酸的方法及其过程中所用的新菌株，本方法以亚胺基二乙腈为原料，以通过发酵培养粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10而得到的具有腈水解酶活性的微生物酶为催化剂，在一定的条件下进行水解反应，得到产物亚胺基二乙酸。本发明的有益效果主要体现在反应过程中废水产量少，污染少；反应条件温和、能耗低；成本低，转化率高、产率高，易于工业化生产。文档编号C12P13/00GK101392276SQ20081012219公开日2009年3月25日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者徐建妙,柳志强,沈寅初,薛亚平,郑裕国申请人:浙江工业大学