专利名称：用于rna体外扩增的试剂及方法
技术领域：
本发明涉及到体外扩增RNA的试剂的设计和用于RNA特别是未知序列的RNA和RNA 混合物的体外扩增方法。
背景技术：
随着内源性产生的非编码的小核糖核酸(non-coding small RNA)被发现在机体的信号传 导、基因调控中的重要作用，对它们的检测和应用需求越来越大。但由f样本的来源及可能 的样品量有限，加上每个样本中的核酸种类数量太大而每个核酸的含量有限且相对含量相差 太大，在不知道发挥作用的核酸的具体序列时，来源有限的样本不仅使得能够开展的实验有 限而且也可能无法重复过去的重要实验。因此在研究起始阶段无法知道发挥作用的核酸的具 体序列时，怎样得到大量的全真核酸样本是一个重要的研究课题。
对于己知序列的RNA的扩增和合成技术已经比较成熟，同样己知序列的RNA如已知序 列的微小RNA (miRNA)的检测也有方法介绍(C. K. Raymond, etal.， 2005, 11, 1737-1744; C, Chen, etal., iVwc/e/c ^4c油2005, 33, el79; S. Ro, etal.，肠c/z艮5—一. / 饥Com聽". 2006, 351, 756-763)，但对于未知RNA和RNA混合物没有现成的方法进行全真的扩增或有效 的检测。如果利用常规PCR的引物设计原理和方法，当扩增对象(如miRNA、 piRNA等)的长 度较短时，如果引物不准确或最终不能准确切去引物必然会导致太多多余的或/和不确定的碱 基添加入扩增对象的核酸中，这样的结果可能完全改变扩增对象的核酸的性质，所以能全真 地扩增核酸的方法意义重大。
发明内容
本发明目的之一在于提供用于RNA体外扩增的试剂。
为达到上述目的，本发明采取了以下技术方案用于RNA体外扩增的试剂，包括以下组 分以下N与Nc为互补碱基，d,e，f,h,k，n^0' g，j,q^l' b，i，论2的整数;
A.连接物SL1:连接物SL1为3'脱氧或被封闭，5'磷酸化的RNA或DNA或DNA-RNA 杂合链，其通式为5，P-(^)b(N)d-3'，其中(。％为限制性内切酶的识别序列和酶切位点； 或连接物SL1为具有茎环(stem-loop)结构的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链， 其通式为5'P-(iY)b (N)e N(N)fNN(N)gNNc (Nc)fNc-3'，其中込[)b为使用的限制性内切B.C.D.
酵的识别序列和酶切位点，N(N)gN为Stem-Lo叩结构中Loop的碱基序列； 线性连接物LL]:为含有启动子相关序列的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通 式为5'-(N)h (NNN......NNN)-3'，其中，(NNN......NNN)为所用启动子的相关序列；
引物SLP1:是以SL1为基础设计的用丁 RT和PCR的DNA序列，其3'端含有限制性 内切酶的识别序列和内切酶位点，其5'端是游离的羟基或被磷酸化或连接有生物素； 线性引物LLP1:是以LLl为基础设计的用T PCR的DNA序歹ij，其5，端是游离的羟 基或被磷酸化或连接有生物素；
茎环(stem-loop)结构的连接物SL2:当切割点在5，端的时，3'粘性端部分或全部 与SLP1序列一致，其通式为5' -(N)i ^^(Nc),(N)k(SLPl)-3，，其中 一)川为形成 环的碱基序列，(N乂和(Ne),为形成环后互配的部分，5'磷酸化或不磷酸化；或当切割 点在3'端的时，5'粘性端部分或全部与SLP1序列互补，SL2的通式为5' -(cSLPl)
(N)ffl (N)n g^3(Nc)n -3'， 其中N(N)q^1为形成环的碱基序列，(N)n和(Nc)n为形成 环后互配的部分，所述cSLPI是SLP1的互补碱基序列；
F. 限制性内切酶；
G. 启动子和相应的RNA聚合酶。
优选地，所述SL1禾QLL1是DNA、 RNA或5，端为RNA的DNA-RNA杂合链。更优选 地，所述SL1禾QLL1是RNA。
所述启动子为T3、 T7、 SP6或其它启动子，优选地，所述启动子为T3、 T7、 SP6启动子。
所述RNA聚合酶为与T3、 T7、 SP6或其它启动子配合使用的聚合酶，优选地，T3 RNA 聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
所述识别序列的酶切位点在5'端时，使用的限制性内切酶为Tsp509 I、 Fat I、 BftiC I、 DpnH、 Mbol、 Sau3AI、 BssK I 、 StyD4 I、 MaeIII、 PspGl 、 Tsp45、 Alwl、 Bbs I、 Bbv I、 Bccl、 BceAI、 BfuAI、 Bsal、 BsmAI、 BsmB I、 BsmF I、 BspMI、 BspQI、 BtgZI、 Earl、 EcoP151、 Faul、 Fokl、 Hgal、 HpyAV、 Plel、 Sapl、 SfaNI、 Nb.BtsI、 Nb.BsrDI或Nt.CviPII。
所述识别序列的酶切位点在3'端时，使用的限制性内切酶为Tail、 MaIII、 Hpy991、 Acu I、 Bael、 Bcgl、 BciV 1、 Bmrl、 Bpml、 BpuEl、 BsaXI、 BseRI、 Bsg I、 Bsm I、 BspCN I、 Bsr I、 BsrD I、 Bts I、 EtsC I、 CspC I、 Eci I、 Hph I、 Mbo II、 Mme I、 Mnl I、 NmeAlII、 Topoisomerase I、 TspRI、 Nt.AlwI、 Nt.BstNB或Nt.BspQI。
许多的限制性内切酶的切割位点不在识别序列的两端而是在中间，因此对于已知序列的RNA,可以根据RNA的序列选择合适的限制性内切酶将RNA相应末端的序列设计入酶的识 别序列中去，这样使用的酶的范围更广。
本发明的另 一 目的是提供用于RNA体外扩增的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案 一种用于未知序列RNA体外扩增的方法， 包括以下步骤
A. 连接物SL1与去磷酸化的目标RNA连接；
B. 步骤A得到的产物磷酸化后与连接物LL1连接
C. 步骤B得到的产物以SLP1为引物逆转录为cDNA;
D. 所得cDNA以引物SLP1和引物LLP1进行PCR扩增后，分离得到DNA的两条单链；
E. 按照酶切位点在识别序列的5'端或3'端设计的连接物SL2，与步骤D中相应的DNA 单链连接后通过茎环结构构建了内切酶的唯一酶切位点，经酶切得切割产物；或当已 知序列的单个RNA样本中没有所用的内切酶识别序列和切割位点时，得到的PCR产 物直接进行酶t刀割，得切割产物；
F. 切割产物在启动子存在下和相应的RNA聚合酶作用下进行转录产生RNA序列；或 切割产物与包含目标RNA的cDNA链互配后由外切酶除去非互配的单链部分，所得 产物在启动子存在下和相应的RNA聚合酶作用下进行转录产生RNA序列；上述RNA 序列除了 5'端多一个G和少数3'端多一个A或C外与目标RNA序列完全一样。
优选地，所述歩骤D中SLP1和LLP1中有一个引物的5'端连接有生物素(或其它能够 用于有效识别和分离的官能团元素)，PCR扩增后利用生物素和Strepavidin/Avidin的结合将 DNA的两条链分离。
所述歩骤E中酶切位点在5'端时，可以利用DNA聚合酶包括但不限于大肠杆菌DNA聚 合酶的Klenow片段通过末端有限填补延长互补序列增加酶切位点的两翼碱基对数量以便于 酶的识别和切割。
如果被切割的DNA链就是要转录的链，所得切割产物在启动子存在下由相应的RNA聚 合酶作用进行转录产生RNA序列；如果被切割的DNA链的互补链是要转录的链，所得切割 产物与包含目标RNA的cDNA链互配后与被切割的DNA链互配后用单链DNA外切酶除去 非互配的单链部分，所得产物在启动子存在下由相应的RNA聚合酶作用进行转录产生RNA 序列。还可以优选地，在转录时，使用5'生物素或荧光素等标记的鸟嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或单磷酸核苷酸(GMP)作为转录起始核苷酸(B. Seeligand A. Jaschke,万/ocwy'wg^e C^w. 1999， 10, 371-378)，最终形成在5'端生物素或荧光素等标记的所需的目标RNA。
本发明可以适用于所有的RNA的体外扩增和检测，但特别适用于未知序列RNA和RNA 混合物的体外扩增和检测，所得产物除了 5'端多了一个鸟嘌呤核苷酸(G)和少数3'端多一个 A或C外与起始的核酸是完全一样的序列并保持其中各个核酸的相对含量一致，因此所得的 产物可以与原样本一样直接使用，而且可以有目的引入5'端生物素或荧光素等标记的目标 RNA可能比原RNA样本更方便使用。本发明可以应用到各种与RNA应用等相关的方面包括 一般性科研、医疗检测和法医鉴定。
图1是本发明RNA扩增过程中连接、逆转录和PCR流程；
图2是本发明中以3，端切割内切酶Nlain设计的RNA扩增过程中连接、茎环结构为基础 的限制性内切酶切割和转录流程；
图3是本发明中以5'端切割内切酶Dpn11设计的RNA扩增过程中连接、茎环结构为基础
的限制性内切酶切割和转录流程；
图4是对应于图1和图2的电泳结果
其中a) 15%， 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNAmarker, 2: miR122, 3: SL1, 4: PI (top);
b) 15%， 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNA marker; 2: I丄l; 3:磷酸化的P2 +未磷酸化 的Pl;4and5:P3 (top);
c) 15。/。，8M尿素变性PAGE胶1:单链DNA marker; 2: RT产物经RNaseH消化后(top: P4; middle: SU; bo加m: SLP1); 3: P3;
d) 8%，非变性PAGE胶1:双链DNAmarker; 2: P5; 3:免疫磁珠分离后(lower band: P6); 4:纯化后的P6;
e) 15%， 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNAmarker; 2: P6; 3: SL2; 4: P9(top);
f) 15%， 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNA marker; 2: P6; 3:皿ligated P9酶切(2nd band from top: P10); 4: SL2;
g) 8%,非变性PAGE胶1:双链DNAmarker; 2: P10; 3: T7启动子；4: P10与启动子互配; 5:Klenow催化延长(top: Pll);
h) 15%， 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNA marker; 2: Pll; 3:P11转录产物(bottom:target RNA); 4:转录产物用DNase I消化后；5: miR122; 6:启动子；
单链DNA marker:自上至下96, 70, 60, 50, 40， 30, 20 nt; 双链DNA marker:自上至下 满，90, 80, 70, 60， 50, 40， 30， 20, 10 bp;
图5是对应于图1和图3的电泳结果
其中a) 15%， 8M尿素变性PAGE胶l:单链DNAMarker; 2: miR122; 3: SL1: 4:P1 (top);
b) 15%, 8M尿素变性PAGE胶l:单链DNAMarker; 2:LL1: 3: PI; 4: P2 (top);
c) 10%，非变性PAGE胶1:双链DNAMarker; 2: P2的RT产物；
d) 15%, 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNA Marker; 2: P2; 3: P4 (top, P2的RT 产物经过RNase H消化后)；
e) 8%，非变性PAGE胶1:双链DNAMarker; 2: PCR产物P5;
f) 8%，非变性PAGE胶1:双链DNAMarker; 2: P5 (双链DNA); 3:分离后的P7;
g) 15%， 8M尿素变性PAGE胶h单链DNAMarker: 2: P7: 3: P12 (P7与SL2互配)； 4: P13 (top; P7与SL2互配后用DpnlI酶切割)；5: SL2;
h) 8%，非变性PAGE胶1:双链DNAMarker; 2: P13; 3: P13与P6互配产物；4: P14 (P13与P6互配产物经过外切酶exoVII酶切后产物)；
i) 15%, 8M尿素变性PAGE胶1:单链DNAMarker; 2: P14 (转录前)；3: P14转 录后；4:目标RNA (P14转录后DNasel消化后)；5: miR122。
具体实施例方式
以下设计除了具体的目的外，DNA或RNA或RNA-DNA杂合链的任何一条链的基本的 要求为(G+C)可以在0-100%范围。N与Nc为互补碱基。以下的连接物、引物、启动子 等编号与附图1、附图2和附图3中的标号是对应的，且其中的编号n,r，x》0;p^l;m》2， 所有编号都为整数。
本发明发明的连接物和引物中含有与以下式(I)所示的核酸内切酶识别序列和酶切位点 相关的序列
5，…XXXXX(N)v T(N)x…3' 3，...XXXXX(Nc)p ▲ (Nc)y ...5' (I) v，p, x,y2 0的整数。
由于内切酶识别序列和酶切位点信息可能被使用在我们设计的弓1物和连接物中，因此它 们决定了本发明中的连接流程和连接方式及酶切切割方式。内切酶的识别位点可以是或不是回文(palindrome)结构。内切酶的切割可以是缺刻酶为代表的单切割方式(切割点在T位置或 切割点在A位置)或双切割方式的限制性内切酶(切割点在T位置和切割点在A位置)。
1、 酶切割位点在3'端的酶选择和发明设计原则
1) 当x=0, v-p = y , 5，-(N)y-3，/3'-(Nc)y-5，为识别序列，切割位点在识别序列的3，端，式 (I)归结为式(n):
5'…XXXXX(N)p (N)yT…3， 3，…XXXXX(Nc)p毕c)y...5， (II) v，p,y20的整数。
2) 当x=0， v = p+y = r+t+y, 5'-(N》-3'/3'-(Nc)r-5，为识别序列，切割位点在识别序列之外的 3'端，式(I)归结为式(III):
5，...XXXXX(N)r(N)t (N)J…3' 3'…XXXXX (Nc)r(Nc)t ▲ (Nc》...5 ， (III) r，t,y>0的整数。
以T位置直接与目标RNA相应的DNA相连时，SL2连接形成茎环结构后延伸是不可能。 代表性的酶Nt.BstNBI、 Nt.AlwI、 Nt.BspQI、 Bsm I、 BsrD I、 BtsCI、 Ecil等；在T位置单切 割(如缺刻酶Nt.BstNBI、 NtBspQI)的切割方式可行，但在A位置切割的单切割方式是不可行的。
2、 酶切割位点在5'端的酶选择和发明设计原则
1) 当y-O, p-v=x, 3，-(N)x-5'/5'-(Nc)x-3'为识别序列，切割位点在识别序列的5'端，式(I) 归结为式(IV):
5'...XXXXX (N)v▼ (N)x...3' 3，...XXXXX(Nc)p-x(Nc)xA…5' (IV)
v,p,x^0的整数。
2) 当y=0, p = v+x = w+s+x, 5，-(N)w-3，/3'-(Nc)、v-5，为识别序列，切割位点在识别序列之外 的5'端，式(I)归结为式(V):
5'…XXXXX(N)w (N)s V(N)x…3' 3'…XXXXX(Nc)w (Nc)s (Nc)xA…5' (V) w,s,x^0的整数。
以A位置直接与目标RNA相应的DNA相连时，SL2连接形成茎环结构后延伸是可能的。 代表性的酶Nb.BsrD、Nb.BtsI、 Bbs I、 BsmAI、 Faul、 DPMI等;在A位置切割(Nb.BsrDI、Nb.BtsI等)的单切割方式可行，在T位置切割的单切割方式是不可行的。
有些酶特别是切割位点在识别序列内部的酶，对于己知序列的RNA的扩增也是可行的。
下面结合附图和实施例来详细说明本发明。
本发明的目的在于发明合适的试剂并应用这些试剂有效地对核糖核酸(RNA)进行全真的 体外扩增。为了体现本发明的可行性，本发明使用miR122作为目标RNA进行体外扩增，转 录形成的产物只比目标RNA在5'端增加一个碱基G(少数情况下3'端会多一个A或C)(J. F. Milligan， etal.，M/c/"'c ^c/血i 饥1987, 15, 8783-8798)。
虽然使用不同的酶相应的各种连接物、引物等不一样，在具体实施例中目标RNA的连接、 逆转录(RT)和PCR流程是一样的(见图1)。
实施例1:
限制性内切酶的酶切位点在识别序列的3'端的实验流程如下(见图l和图2)。本实施例
5'-CATGV-3'
使用限制性内切酶NlallP'-AGTA"'，电泳结果见图4。
A. 合适的SL1与目标RNA的连接，所得产物称为Pl 。
为了不会发生自身连接，首先需要将目标RNA进行5'端去磷酸化，然后在连接酶如T4 RNA连接酶的作用下使5'磷酸化的SL1(本发明的实施例中使用NlaIII，所以SL1的5'端含 有内切酶NlaI.II的位点)与去磷酸化的目标RNA相连。SL1可以是DNA也可以是RNA，或 者在5'端是RNA的DNA-RNA杂合链， 一般而言，RNA单链与DNA单链的连接效率比两 条RNA间连接效率要低。由于SL1的3'端被封闭或处于碱基配对中，只能连接单链RNA或 单链DNA的T4 RNA连接酶不能催化发生SL1自身连接。
B. 激酶催化下使Pl的5'端发生磷酸化得产物P2。
为了能够进行下一步连接，需要对Pl进行5'端磷酸化。5'端磷酸化的Pl称为P2。
C. P2与LL1连接的产物P3。 P2与LL1(两端均没有磷酸化)被连接酶(如T4 RNA连接酶)连接形成产物P3。同样由于
两条RNA间连接效率较高，所以LL1是RNA较好。LL1中有启动子相关的序列(本发明中 的实施例1和实施例2使用相同的序列)。
D. P3逆转录形成P4。
以SLP1为引物在逆转录酶作用下形成P3的cDNA，称为产物P4。E. 对P4进行PCR扩增，得到P5。
以5'端羟基或5'端磷酸化的SLP1和5'端连接有生物素的LLP1为引物对P4进行PCR 扩增，得到产物P5。 LLP1中有启动子相关的序列(本发明中的实施例1和实施例2使用相同 的序列)。
引物也可以设计为SLP1 5'端为游离羟基，LLP15'端被磷酸化，这样PCR结束后使用入 噬菌体核酸外切酶(lexo)(这种酶催化双链DNA分子从5'-P末端进行逐步的水解释放出5'-单 核苷酸，但不能降解5'-OH末端)，这样无需经过步骤F就可以使P6直接游离出来(Little， J. W. / 5zo/. Cfe附.1967, 2W, 679-686)。
F. 利用其中一条链的5'端的生物素对P5的两条链分离。
生物素可以特异地与Streptavidin或Avidin结合，所以利用含有Streptavidin或Avidin的 磁珠与生物素结合后对P5的两条链分离(使用Biotin-Streptavidin的参考文献T. Hul加an， etal.， M^/e/c^c/^y if饥1989， /7, 4937-4946; N. Pourmand， etal., jVwc/e/c j"'<* W" 2002,邓，e31; M. Uhlen,A^wre, 1989， W0， 733-734)。含有生物素的DNA链称为P7，另一条称为P6。
G. P6的5'端磷酸化得到P8
利用激酶使P6的5'端发生磷酸化以便下一步的连接实验。如果第H步中P8与SL2很好 互配形成唯一内切酶位点后直接用内切酶切割，本歩骤可以省略。
H. P8与SL2互配和DNA连接酶连接形成具有唯一限制性内切酶识别序列和酶切位点的产 物P9。
通过SL2的5'端与P8的3'端互补的特征使SL2与P8互配，然后利用DNA连接酶将其 连接形成了限制性内切酶识别序列和酶切位点唯一的茎环结构。当互配的碱基对数量足够多 时，使用DNA连接酶填补缺口 (nick)的必要性不大。
I. 限制性内切酶在唯一识别序列和酶切位点切割形成PIO。 限制性内切酶在酶切位点的3'端进行切割形成了产物P10(Nla III对切割位点任一端没有
侧翼碱基时的切割能力较弱，需要较长的切割时间)，P10的5'端开始就是目标RNA的cDNA 序列。
J.转录形成产物RNA序列。
形成的P10在T7启动子(T7启动子的基木序列为5'-TAATAC GAC TCA CTA TAG-3')的 存在下经转录酶(T7 RNA聚合酶)的催化作用从启动子的3'端后开始转录(J. F. Milligan, etal., 7Vwc/e,'c^c/^W". 1987,15,8783-8798)。为了提高转录效率和便于区分新产生的条带，具体实 验时先将启动子与P10互配后再使用Klenow片段催化延长补齐后得产物Pll再转录，转录形成的产物只比目标RNA在5，端增加一个碱基G (少数情况下3，端会多一个A或C)。如果 需要，可以使用5'生物素或荧光素等标记的鸟嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或单磷酸核苷酸 (GMP)作为转录起始核苷酸(B. Seelig and A. Jaschke, Cfe附.1999， 10,
371-378)，最终形成在5'端生物素或荧光素等标记的所需的目标RNA。
实施例2:
限制性内切酶的酶切位点在识别序列的5'端的实验流程如下(见图l和图3)。本实施例
使用限制性内切酶DPNII,其酶切位点为—3'-CTAGA-3 。电泳结果见图5。
除SLI的3'端含有内切酶DPNII的位点外，步骤A-D与实施例1步骤相同。
E. 对P4进行PCR，得至lJP5。
以5'端为游离羟基的SLP1和5'端连接有生物素的LLP1为引物或5，端连接有生物素的 SLP1和5'端游离羟基的LLP1对P4进行PCR扩增，得到产物P5。 LLP1中有启动子相关的 序列。
F. 利用其中一条链的5'端的生物素对P5的两条链分离。
生物素可以特异地与Streptavidin或Avidin结合，所以利用含有Str印tavidin或Avidin的 磁珠与生物素结合后对P5的两条链分离(使用Biotin的参考文献T. Hultman, etal., M/c/e/c 1989, 〃， 4937-4946; N. Po醒and, etal.， Jc,'A. L 2002，贝e31; M. Uhlen，
Wa加e, 1989， W0， 733-734)，含有生物素的DNA链称为P7，另一条称为P6。(如果使用的引 物为5'端连有生物素的SLP1和5，端游离羟基的LLP1，那么最后分离后得到的P6被固相结 合，P7游离于上清液中。)
G. P7与SL2互配和DNA连接酶连接形成具有唯一内切酶识别序列和酶切位点的产物P12。 通过SL2的3'端与P7的5'端互补的特征使SL2与P7互配，然后利用DNA连接酶将其
连接形成了内切酶识别序列和酶切位点唯一的茎环结构。当互配的碱基对数量足够多时，使 用DNA连接酶填补缺口 (nick)的必要性不大。
H. 限制性内切酶在唯一识别序列和酶切位点切割形成P13。
限制性内切酶在酶切位点的5'端对P12进行切割形成了产物P13， P13的3'端开始就是 目标RNA相关的序列。
在不知道目标RNA的具体序列或RNA混合物中各个序列的末端不一样时，设计可以形 成限制性内切酶的识别序列和切割位点的合适兼容的连接物比较困难，尤其对于那些需要在 其切割位点的两侧有一定数量碱基的内切酶的连接物等的设计更难。如果在此步限制性内切酶切割有困难时，本发明通过以粘性端为模板以3，-OH为引物进行有限的末端填补实现延长 从而可能增加酶切位点的两翼碱基对数量以便于酶的识别和切割。有限的末端填补的一般方 式如下每轮填补最多只加入3种脱氧核苷酸(dNTP)，这样第n轮至少延长n-l个碱基； 为了延长实验后不形成第二个内切酶的识别序列和切割位点，如本实验中为了不形成新的 5'-GATC-3'序列，所以第一轮不加dGTP，第二轮不加dATP，第三轮不加dTTP，第四轮不加 dCTP，最终在第四轮时至少延长了三个碱基但不会产生新的5'-GATC-3，序列，这样的操作既 保证长度的延长又保证没有产生新的所使用的内切酶识别序列和酶切位点。本实验使用的 DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段。
I. P6与P13进行互配，并用单链DNA外切酶水解形成平端DNA双链P14。
形成的P13与P6互配后，链P6的5'端单链在只能切割单链DNA的外切酶exoVII(丄W.
Chase and C. C. Richardson / C7 e肌1974, 249, 4545~4552; J. W. Chase and C. C.
Richardson / S/o/. Cfe肌1974, 249, 4553一561)作用下水解成平端DNA双链P14。
J.转录形成产物RNA序列。
形成的平端双链DNA在转录酶(T7 RNA聚合酶)的作用下从启动子的3'端后开始转录(J.
F. Milligan， etd., iVwc/e/c /4atfa 1987, 15， 8783-8798)，转录形成的产物只比目标RNA在5，
端增加一个碱基G (少数情况下3，端会多一个A或C)。如果需要，可以使用5'生物素或荧
光素等标记的鸟嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或单磷酸核苷酸(GMP)作为转录起始核苷酸(B.
Seelig and A. Jaschke, SZocw/Mga/e C/zem. 1999， 10, 371-378)，最终形成在5'端生物素或荧光
素等标记的所需的目标RNA。
权利要求
1. 一种用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于主要包括以下组份以下N与Nc为互补碱基，d，e，f，h，k，m≥0，g，j，q≥1，b，i，n≥2的整数；A. 连接物SL1连接物SL1为3′脱氧或被封闭，5’磷酸化的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5’P-((<u>N</u>)b(N)d-3′，其中((<u>N</u>)b为限制性内切酶的识别序列和酶切位点；或连接物SL1为具有Stem-loop结构的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5’P-(<u>N</u>)b0(N)eN(N)fNN(N)gNNc(Nc)fNc-3′，其中(<u>N</u>)b为使用的限制性内切酶的识别序列和酶切位点，N(N)gN为Stem-Loop结构中Loop的碱基序列；B. 线性连接物LL1为含有启动子相关序列的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5′-(N)h(NNN......NNN)-3′，其中，(NNN......NNN)为所用启动子的相关序列；C. 引物SLP1是以SL1为基础设计的用于RT和PCR的DNA序列，其3’端含有限制性内切酶的识别序列和内切酶位点，其5’端是游离的羟基或被磷酸化或连接有生物素；D. 线性引物LLP1是以LL1为基础设计的用于PCR的DNA序列，其5’端是游离的羟基或被磷酸化或连接有生物素；E. 连接物SL2为茎环结构，当切割点在5’端的时，连接物SL2的3’粘性端部分或全部与SLP1序列一致，其通式为其中为形成环的碱基序列，(N)i和(Nc)i为形成环后互配的部分，5’磷酸化或不磷酸化；或连接物SL2为茎环结构，当切割点在3’端的时，连接物SL2的5’粘性端部分或全部与SLP1序列互补，其通式为其中为形成环的碱基序列，(N)n和(Nc)n为形成环后互配的部分，所述cSLP1是SLP1的互补碱基序列；或当已知序列的单个RNA样本中没有所用的内切酶识别序列和切割位点时，所述连接物SL2是线性结构，其碱基组成是或包含引物SLP1或互补于引物SLP1；F. 限制性内切酶；G. 启动子和相应的RNA聚合酶。
2. 根据权利要求1所述的用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于所述引物SLP15'端为游 离羟基或5'端被磷酸化和引物LLP15'端连接有生物素；或引物SLP1 5'端为游离羟基和引 物LLP1 5'端被磷酸化。
3. 根据权利要求1所述的用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于所述启动子为T3、 T7 或SP6启动子。
4. 根据权利要求所述的用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于连接物SL1和线性连接 物LL1为RNA。
5. 根据权利要求1所述的用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于酶切位点在识别序列的 5'端时，使用的限制性内切酶为Tsp5091、 Fatl、 BfuC I、 Dpn II、 Mbo I、 Sau3AI、 BssK I 、 StyD41、 MaeIII、 PspGl、 Tsp45、 Alwl、 Bbs I、 Bbv I、 Bcc I、 BceAI、 BfuAI、 Bsa I、 BsmAI、 BsmBI、 BsmF I、 BspM I、 BspQI、 BtgZ I、 Earl、 EcoP15 I、 Faul、 Fok I、 Hgal、 HpyAV、 Ple I、 Sap I、 SfaN I、 Nb.BtsI、 Nb.BsrDI或Nt.CviPII;或酶切位点在识 别序列的3，端时，使用的限制性内切酶为Tail、 NlaIII、 Hpy991、 Acu I、 Bae I、 Bcg I、 BciVI、 Bmrl、 Bpm I、 BpuE I、 BsaX I、 BseRI、 Bsgl、 Bsm I、 BspCN I、 Bsrl、 BsrD I、 Btsl、 BtsCI、 CspCI、 Ecil、 Hphl、 Mbo II、 Mme I、 Mnl I、 NmeAIII、 Topoisomerase I、 TspRI、 Nt.AlwI、 Nt.BstNB或NtBspQI
6. —种用于RNA体外扩增的方法，其特征在于使用权利要求1所述的用于RNA体外扩 增的试剂，包括以下步骤-A. 连接物SL1与去磷酸化的目标RNA连接；B. 步骤A得到的产物磷酸化后与线性连接物LL1连接；C. 步骤B得到的产物以SLP1为引物逆转录为cDNA;D. 所得cDNA以引物SLP1和线性引物LLP1进行PCR扩增后，分离得到DNA的两条 单链；E. 按照酶切位点在识别序列的5'端或3'端设计的连接物SL2，与步骤D中相应的DNA 单链连接后通过茎环结构构建了内切酶的唯一酶切位点，经酶切得切割产物；或当己 知序列的单个RNA样本屮没有所用的内切酶识别序列和切割位点时，得到的PCR产 物直接进行酶切割，得切割产物；F. 切割产物在启动子和相应的RNA聚合酶作用下进行转录产生RNA序列；或切割产 物与包含目标RNA的cDNA链互配后由外切酶除去非互配的单链部分，所得产物在 启动子存在下和相应的RNA聚合酶作用下进行转录产生所需的RNA序列。
7. 根据权利要求6所述的用于RNA体外扩增的方法，其特征在于所述步骤D中引物SLP1 和引物LLP1中至少有一个引物的5'端连接有生物素，PCR扩增后利用生物素和 Strepavidin/Avidin的结合将DNA的两条链分离。
8. 根据权利要求6所述的用于RNA体外扩增的方法，其特征在于所述步骤D还包括将分 离得到的不含生物素的单链DNA的5'端磷酸化。
9. 根据权利要求6所述的用于RNA体外扩增的方法，其特征在于所述步骤E中酶切位点 在识别序列的5'端时，利用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段通过末端有限填补延长互补序列增加酶切位点的两翼碱基数量以便于酶的识别和切割。
10.根据权利要求6 — 9任一项所述的用于RNA体外扩增的方法，其特征在于步骤F中， 转录时，使用5'生物素或荧光素标记的鸟嘌呤二磷酸核苷酸或单磷酸核苷酸作为转录起 始核苷酸，最终形成在5'端生物素或荧光素等标记的所需的RNA。
全文摘要
本发明公开了用于RNA体外扩增的试剂及方法，包括连接物、引物、启动子和限制性内切酶等，达到了体外扩增RNA的目的。本发明中目标RNA经过与连接物连接，在引物存在下进行RT-PCR后得到扩增，再使用了茎环的结构形成了限制性内切酶的唯一位点，酶切所得产物在启动子启动下经过转录后可以得到除了5’端多一个G和少数3’端多一个A或C外与目标RNA样本完全一样的序列，所得的RNA产物与原样本RNA一样可以直接使用。本发明可以应用到各种与核糖核酸应用等相关的方面包括一般性科研、医疗检测和法医鉴定。
文档编号C12N15/10GK101445797SQ20081021976
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者万军庭, 周国春, 浩 成, 杨方义 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院