用于病毒纯化用连续超速离心的糖溶液配方的制作方法

专利名称：：用于病毒纯化用连续超速离心的糖溶液配方的制作方法
技术领域：
：本发明涉及病毒纯化领域。
背景技术：
：病毒，无论是自然出现的还是其重组体，皆可用于疫苗接种和基因治疗领域。许多病毒或类病毒粒子可以安全并有效地在寄主细胞中增殖。有数种公开出版物描述了从寄主细胞中提纯病毒的技术，主要集中于特异性的层析基质的应用，用于由寄主细胞裂解物纯化病毒(参见，例如，美国专利No.6,008,036)。描述的其他方法，例如，在美国专利No.6,048,537中描述的方法使用了连续式庶糖梯度离心，其提供的产品具有较小的抗原纯度，并且要求进一步通过离心提纯的步骤。这些方法也还遭受抗原聚集之患，这可以导致病毒抗原的损失，或者抑制病毒失活步骤。病毒聚集还可能会抑制层析工艺的产率，其时间和成本要求高，难以适合于大规模生产。因此，本发明的目标在于提供一种纯化病毒、尤其是从寄主细胞样本中纯化病毒的方法，其比较简单，但仍能以高纯度提供全病毒抗原组分，同时减少病毒抗原聚集。图1:用普通的超速离心工艺(图la)和本发明的超速离心工艺(图lb)纯化的PMVHs的显微照片。
发明内容本发明提供一种用于提纯病毒或病毒抗原的方法，其包括提供病毒制品并在糖梯度中离心所述病毒制品，其中该糖梯度是由在缓冲水溶液中的浓度为蔗糖当量34%至50%(w/w%)的第一糖层A和浓度为蔗糖当量50。/。至65%(w/w%)的第二糖层B所建立的，缓冲水溶液中的一种缓冲剂成分是pKa值为6.0~9.4的缓冲剂成分；以及从离心液中收集所述病毒或病毒抗原，即，离心方法的产物。本发明的一个方面在于提供一种提纯病毒或病毒抗原的方法。该方法涉及到提供包含糖梯度的溶液，所述糖梯度是通过离心至少一种第一缓冲糖溶液和至少一种第二缓冲糖溶液而建立的。在第一缓冲糖溶液中的糖浓度具有35%至50%(w/w%)的蔗糖当量；在特定的实施方式中，蔗糖当量为34%至46%(w/w%)。在第二缓冲糖溶液中的糖浓度具有50%至65%(w/w%)的蔗糖当量；在特定的实施方式中，蔗糖当量为50%至60%(w/w%)。一旦建立起糖梯度，就将病毒制品加至该糖梯度。然后将病毒制品和糖梯度离心以得到波峰汇集液(peakpool)，并且萃取波峰汇集液以得到病毒或病毒抗原。具体实施例方式在病毒或病毒抗原提纯期间，通过离心浓縮病毒或病毒抗原，从而使其与细胞培养基成分和/或寄主细胞和寄主细胞成分相分离。本发明的方法能够在提纯的离心步骤中使病毒聚集和病毒损失最小化。在本发明的方法中，通常将生理学缓冲液中的第一糖溶液垂直地加载入连续超速离心装置，从而形成水平的糖溶液层A;然后将在相同或不同的生理学缓冲液中的更高浓度的第二糖溶液加载入该装置，从而形成水平的糖溶液层B。然后启动该装置，形成糖梯度。最大浓度在装置的外壁，并且浓度朝向装置的中心逐渐变小。然后将来自细胞培养物的包含病毒的收获液加载入装置中，并且病毒颗粒会迁移到糖梯度中的位置，在该位置它们的密度与梯度密度相等。当糖是蔗糖时，出现该平衡的典型密度范围是36%-48%(Ww%)蔗糖。一旦装置停止，该梯度会向水平位置移动，并且该包含病毒颗粒的梯度部分(或者"波峰汇集液)"将从装置中被抽出。本发明的一个方面是一个令人惊奇的发现，与惯常的利用单一浓度蔗糖水溶液从而形成蔗糖梯度的方法相比，其通过利用双层溶液的方法，能够增加波峰汇集液的体积。即使使用蔗糖、并且梯度中的最大蔗糖浓度与在常规方法中使用的相同，也能得到这一令人惊奇的效果。通过优化两个蔗糖溶液层A和B的浓度和含量，能够增加波峰汇集液体积，例如，增加两倍。通过减小全病毒颗粒或抗原各自的浓度，该增加的波峰汇集液体积可减少它们的聚集。连续超速离心工艺对于病毒制品的提纯是有用的。高浓度的糖(例如，蔗糖或山梨糖醇)或者盐(例如CsCl2或NaBr)的溶液能够被用于通过超速离心法产生梯度。然而，不含任何添加剂的糖溶液具有低浓度的电解质并且没有缓冲能力。因此，本发明的一个方面是获得如下认识糖溶液比如蔗糖溶液中的病毒制品，取决于病毒颗粒的浓度，6其具有较强的形成聚集体的倾向，这会在用于疫苗生产的进一步加工中造成问题。通过使用糖溶液(例如，55%w/w的蔗糖溶液)外加生理学浓度的盐(例如，约4-8g/kg的NaCl)以及外加缓冲液(例如，大约10-20mmol/kg的Tris，接着调节pH)、从而在梯度中获得生理学的电解质以及pH条件，本发明的方法能够有效地使这些问题最小化。在特定的实施方式中，不同的糖溶液被应用以在超速离心机中构造梯度。作为实施例，将200mL的55%w/w溶液和800mL的42%w/w溶液加载至超速离心机。较小量的较高浓度的蔗糖溶液可确保在超速离心的未尾，最大蔗糖浓度保持在高于45%;并且大量的42%蔗糖可得到在约40%的范围内更平缓的梯度，在该处会典型地出现病毒波峰最大值。通过本发明的这些方法，能够增加波峰汇集液的体积，并且因此将病毒颗粒悬浮液稀释并导致较少的聚集。而且，通过使用这样的蔗糖配方，分子或颗粒在加载至超速离心机的上清液与梯度之间的扩散被改进。举例来说，使用在20mmol/kgTris-缓冲液中大约42%和55%(w/w%)的蔗糖溶液形成的密度梯度被发现对于流感病毒是特别有用，但还可以容易地适用于其他病毒。对于pH为6.5至9.7的范围，Tris(三羟甲基氨基甲烷)是有用的缓冲剂。虽然在本发明的具体实施方式中的这一特别的实施例中使用蔗糖，但可以使用适合于梯度离心的其他糖。另外，可以使用其他的缓冲化合物、尤其是有机缓冲化合物比如胺类。优选缓冲液的pKa值高于6、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0，并且低于9.4、9.2、9.0、8.8、8.6、8.4或8.2。合适的缓冲剂包含例如HEPES(4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸)、二-tris-甲烷或-丙烷、CAPS(N-环己基-3.氨基丙垸磺酸)或CAPSO、PIPES(哌嗪-N，N'-二(2-乙基磺酸))、磷酸盐缓冲剂、或者任何其他在生物化学领域中使用的缓冲剂。该缓冲剂优选对于生物分子是化学惰性的。该离心方法能够产生波峰汇集液组分，其中在就电解质和pH条件而言的生理条件下，病毒颗粒被分散。在波峰汇集液组分中全病毒抗原的浓度能够通过加入不同量的高浓度和低浓度糖溶液而改变，以便限定梯度并因此限定波峰组分的体积。另外，通过单独添加盐和合适的缓冲液(例如，Tris-缓冲盐水(TBS))也可增加波峰组分的体积，导致抗原和蛋白质的明显更高的产率。这一效果或许应归因于预料不到的提高的蛋白质和病毒抗原进入包含生理学浓度的盐和生理学pH的糖梯度的流动性。不同的超速离心条件(例如，有和没有预澄清器以及不同的重力荷载)清楚地显示，通过蔗糖梯度的这些改变，能够实现显著的产率提高和病毒颗粒聚集的减少。7优选添加的电解质大于50mOsm/kg、100mOsm/kg、150mOsm/kg、200mOsm/kg或250mOsm/kg，并且小于500mOsm/kg、450mOsm/kg、400mOsm/kg或350mOsm/kg，优选约300mOsm/kg。应注意，在不进行范霍夫斯(van'tHoffs)因子矫正的情况下，将电解质含量计算转换为等效的水溶液渗透压。另外，梯度形成物质(例如，蔗糖)的贡献未被用于计算。例如，来自电解质的渗透压计算如下8gNaCl/kg/58.44g/mo1=136.9mmol/kgx2(个离子/mol)=273.8mOsm/kg+20mM/kgTRISx2个离子/mol=40mOsm/kg;总计(NaCl+TRIS)313.8mOsm/kg)。pH值能够在生理学范围内，优选在5.5和9.5之间；更优选在5.5和8.5之间；尤其优选高于5.5、6、6.5或7并且低于9.5、9.0、8.5、8或7.5;尤其优选在7.0和7.5之间或者在7.0和7.4之间。在尤其优选的实施方式中，用于产生密度梯度的糖是蔗糖。然而，本发明预期还可使用其他糖，包括醇类糖在内。其非限制性的实施例是山梨糖醇。另外，本发明预期可使用氢化糖、线性糖、改性糖或任何其他糖，只要该糖的水溶性足以产生具有在此限定的密度的溶液即可。在相同层或不同层中的糖的组合(即，两种以上的糖)也可以被用于产生在此描述的梯度，只要组成那些层的对应的糖溶液具有在此限定的密度即可。在优选的实施方式中，梯度形成制品的体积相对于超速离心转子或对样本施加离心力的装置的有效体积的比率是在5%至100%之间，优选高于5%、10%、15%、20%、25%、30%、32°/。、35%、40%、45%或50%,或低于100%、90%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、48%、45%、40%、35%、30%或25%。在其他实施方式中，梯度形成制品的体积相对于超速离心转子或对样本施加离心力的装置的有效体积的比率是在1%至75%之间。在优选的实施方式中，包含梯度形成材料的转子的加载以连续地或者间断地重复方式进行(即，或者连续超速离心，或者分批超速离心)，其中加载体积优选是高于转子的空体积(总体积减去梯度体积)，优选大于1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍或低于300倍、250倍、200倍、150倍、120倍、100倍、80倍。在特定的优选实施方式中，使用连续超速离心。在尤其优选的实施方式中，加载体积是在20L至50L/每600mL至1000mL空体积(1600mL转子体积减去600mL至1000mL空体积)之间，为约20倍至80倍的比率。在另一个实施方式中，加载体积是在40L至100L/每1200mL至2000mL空体积(3200mL转子体积减去1200mL至2000mL空体积)之间，为约20倍至80倍的比率。8在离心期间，糖的连续梯度被建立。在另一个实施方式中，一小部分离心液被收集，该部分的蔗糖浓度高于24%(相当于约1.10kg/L)、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%或46%(w/w%)(相当于约1.22kg/L)，并且小于66%(相当于约1.32kg/L)、63%、60%、58%、56%、54%、52%、50%、48%、46%、44%或者42%(w/w%)(相当于约1.19kg/L)。一般来讲，病毒产物累积在该范围内。优选一小部分离心液被收集，其蔗糖浓度在约30%和54%(w/w%)之间，更优选在36%和48。/。(w/w。/。)蔗糖之间。从由其他糖形成的梯度中收集的组分可以具有不同的浓度(w/w%)、但具有等效的密度。收集的组分的密度可以高于1.10kg/L、1.12kg/L、1.14kg/L、1.16kg/L或1.18kg/L、1.20kg/L、1.22kg/L，并且低于1.32kg/L、1.30kg/L、1.28kg/L、1.26kg/L、1.24kg/L、1.22kg/L或1.20kg/L。在尤其优选的实施方式中，密度可以在1.13禾口1.25kg/L之间，更优选在1.16禾Q1.22kg/L之间。在特定的实施方式中，缓冲液或缓冲剂成分(例如，Tris缓冲液盐水)的浓度是2mmol/kg至50mmol/kg，优选5mmol/kg至40mmol/kg、10mmol/kg至40mmol/kg，更优选在10mmol/kg至30mmol/kg之间，更优选在18mmol/kg至25mmol/kg之间，并且最优选是20mmol/kg。该缓冲液优选是水溶液，具有小于5%的可与水混溶的有机溶剂，更优选小于2%的有机溶剂，并且最优选不含有机溶剂。缓冲液的浓度高于2mmol/kg、5mmol/kg、10mmol/kg、12mmol/kg、14mmol/kg、15mmol/kg、17mmol/kg、18mmol/kg、19mmol/kg或20mmol/kg，或低于50mmol/kg、40mmol/kg、35mmol/kg、30mmol/kg、25mmol/kg、23mmol/kg或21mmol/kg。优选离心能够以至少20,000g、更优选30,000g、更优选50,000g、更优选70,000g、最优选90,000g的离心力进行。但是在其他的实施方式中，离心力小于200,000g、小于150,000g、小于120,000g、小于100,000g、或小于90,000g。在特别优选的实施方式中，初始层A对初始层B(g卩，在施加病毒制品之前)的体积比是在20:1至1:1之间、优选在10:1至1.5:1之间、更优选在8:1至2:1之间、进一步优选在6:1至3:1之间，并且最优选4:1。该比率可以小于20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、4:1、3:1，或者大于1:2、1:1、1.5:1、2:1、3:1或4:1。在尤其优选的实施方式中，含糖离心液是双层的(即，在病毒制品添加之前，包含不同浓度的糖层A和B，在超速离心中在液体填充层的下面)。当然，在离心期间，可以形成新的浓度梯度或密度梯度。然而，本发明还预期离心液体具有超过两个层。例如，在特定的非限制性实施方式中，离心液体由3、4、5、6、7甚至8个不同的层组成。每一个层都可以具有与其它层相同的缓冲液，或者每个层的缓冲液都可以独立地选择。在尤其优选的实施方式中，制备方法不包含预澄清步骤。然而，如需要，可以在超速离心法装置的预澄清腔室中进行预澄清。在另一种实施方式中，层A包含在40。/。至44。/。(w/w%)之间的蔗糖、优选41%至43%(w/w%)的蔗糖。蔗糖浓度可以高于35%(相当于约1.15kg/L)、36%、37°/。、38%、39%、40%、41%或42%(w/w%)(相当于约1.19kg/L)，或者低于50%(相当于约1.23kg/L)、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%或42%(w/w%)(相当于约1.19kg/L)。由另一种糖形成的层A可以具有基于重量/重量单位的不同的浓度，但是该层A的密度落入在此限定的密度范围内。在特定的实施方式中，层B包含的蔗糖溶液的浓度在50%至65%(w/w%)之间，优选在52%至58%(w/w%)之间，并且更优选在54%至56%(w/w%)之间。蔗糖浓度(w/w%)可以高于50%(相当于约1.23kg/L)、51%、52%、53%、54%或55%(相当于约1.26kg/L)，或者低于66%(相当于约1.32kg/L)、64%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%或55%(相当于约1.26kg/L)。由其他的糖形成的层B可以具有基于重量/重量单位的不同的浓度，但是该层B的密度落入在此限定的密度范围内。在本发明的一种优选实施方式中，病毒是正粘病毒，特别是流感病毒，优选选自下组甲型流感和乙型流感。本发明预期的其他非限制性的病毒的例子包括选自于由RNA病毒家族所构成的组的病毒，比如呼肠孤病毒(Reoviridae)、小RNA病毒(Picornaviridae)、环状病毒(Caliciviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、沙粒病毒(Arenaviridae)、反转录病毒(Retroviridae)、黄病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、畐U禾占病毒(Paramyxoviridae)、本雅病毒(Bunyaviridae)、弹状病毒(Rhabdoviridae)、纤丝病毒(Filoviridae)、冠状病毒(Coronaviridae)、星形病毒(Astroviridae)、波纳病毒(Bornaviridae);以及选自于由DNA病毒家族所构成的组的病毒，比如腺病毒(Adenoviridae)、乳多空病毒(P叩ovaviridae)、细小病毒(Parvoviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒(Poxviridae)、肝DNA病毒(Hepadnaviridae)。在特定的优选实施方式中，病毒选自下组甲型流感/Panama(巴拿马)/2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新喀里多尼亚)/20/99、以及乙型流感/Shangdong(商东)/7/97。在本发明的一些实施方式中，病毒收获物是由用病毒接种的细胞制备而来的。能够在任何适合病毒产生的细胞中制备出病毒。优选细胞是动物细胞培养物或细胞系。这样的细胞可以来自特定的组织或胚细胞，比如胚卵。动物优选是哺乳动物或鸟。在本发明的各种实施方式中，细胞是鸟类的、犬科的、啮齿动物的、或者灵长类动物的细胞。在特定的实施方式中，细胞是上皮细胞，尤其优选肾上皮细胞，比如非洲绿猴的Vero细胞。施加于超速离心装置的病毒收获物可以是全细胞培养物、或者在将细胞和/或其部分与细胞培养物分离后获得的细胞培养上清液。在本发明的一些实施方式中，在回收细胞培养上清液之前，允许细胞培养物中的细胞置于培养容器中。在本发明的其他实施方式中，细胞可以通过化学方法或者机械方法裂解，所述方法的非限制性的例子包括低渗或高渗溶菌、洗涤剂处理、超声处理、以及机械破碎。优选病毒在离心之前或之后被失活或破碎(例如，如WO05/11800所述)。另外，病毒疫苗可以通过本
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已知的方法制备。疫苗是抗原物质的免疫原性的组合物，即(未感染)病毒、其外壳、颗粒或其抗原。该抗原物质被用于免疫动物，例如，哺乳动物比如人类，或者鸟。以下通过实施例进一步阐明本发明，但并不限制本发明。实施例在流感病毒抗原的纯化期间，通过超速离心法浓縮单价的收获物(MVH)。以通过使用50%(w/w%)蔗糖水溶液而形成的蔗糖梯度为基础，连续流动离心工艺能够被用于培育病毒疫苗的Vero细胞培养物的制造。使用的离心转子模型安装有预澄清器。许多发酵优化方法，比如通过补充大豆水解物或者在流感病毒复制早期阶段升高温度条件而改变Vero细胞培养基，会导致更耐用的工艺以及提高的抗原产率。因此，其结果是，由于抗原结合能力的限制，50%(Ww%)蔗糖/水的梯度不可能获得期望的回收率。另外，病毒菌株NewCaledonia(新喀里多尼亚)、Panama(巴拿马)禾t]Shangdong(商东)的PMVHs(纯化的MVH)在该特定的生产步骤显示出预料不到的抗原聚集性。人们尝试了数种方法来使离心步骤中的病毒聚集和病毒损失最小化。TRIS缓冲盐水被用于代替水来溶解用于梯度物质的蔗糖。另外，引入通过使用两种具有不同密度的梯度形成溶液而进行的改变，以便增加波峰汇集液体积。另外，在没有预澄清器、但是增加惯性力(g-force)的情况下进行超速离心，证明是用于提高产量的有价值的手段。为了证明这些思想，评估在标准条件(水中50%蔗糖，在20,000rpn^90,000g下具有预澄清器)和新的条件(42%和55%蔗糖(w/w%)、20mmol/kgTRIS、8g/kgNaCl，在35,000rpm=90,000g下没有预澄清器，使用来自48。/。-36。/。蔗糖组分的PMVH收获物)下上述纯化所带来的结果。实施例l:材料和方法使用具有C40CTS转子(转子体积1,600mL)的连续流式超速离心机CC40S或具有等效转子的AlfaWassermann超速离心机RK6。将蔗糖梯度溶液加载至转子，然后加速至20,000至35,000rpm的转速。在连续加载失活收获物后，用缓冲液冲洗转子以便除去尚未进入梯度的残余蛋白质。在冲洗后，转子被减速，并且停止超速离心，使得梯度从转子径向移至轴向。根据蔗糖浓度进行洗脱和分级分离。Coriolis型密度探测部件和紫外线254nm探测部件被用于监控蔗糖和蛋白质浓度。通过ELISA，根据标准化工艺测量纯化后的失活收获物样本的总蛋白浓度、HA-SRD和Vero抗原，从而定量来自超速离心实验的产率和纯度。实施例2:使用TBS-蔗糖梯度的初始实验用甲型流感/Panama/2007/99单价病毒收获物进行的许多小规模纯化表明，由50%w/w蔗糖与50%w/wTris缓冲液盐水(20mmol/kgTRIS、8g/kgNaCl)(终浓度为10mmol/kgTRIS、4g/kgNaCl)的混合物产生的蔗糖梯度的应用相对于标准的蔗糖/水体系具有数个优点。使用实验室超速离心机模型RK-6来在不同的条件下纯化25升和50升MVH等分。在表1中给出了使用蔗糖/水和蔗糖/TBS体系的纯化操作的参数设置和结果的概要。表1:甲型流感/Panama/2007/99抗原产率和PMVH外观的对比。来自在30,000g下具有预澄清器的超速离心实验的经蔗糖梯度纯化的病毒。纯化操作条件/设置MVH加载(升)HA-SRD/蛋白质比率(mg/mg)波峰汇集液体积(mL)抗原产率(mg抗原/升收获物)PMVH(外观)1蔗糖/水800mL250.513331.2聚集2蔗糖/TBS800mL250.344402.0聚集减少3蔗糖/TBS800mL500.264921.4聚集减少从表1中可以得出结论，在TBS中的蔗糖梯度与标准的在蔗糖/水体系中的梯度相比具有数个优点。对于纯化操作l,能够获得1.2mg抗原/升(L)收获物的产率，抗原组分(PMVH)显示出预料不到的病毒聚集。使用在TBS中蔗糖的纯化实验(操作2)获得了与参照操作1相比增加的抗原产率。对于TBS制品，能够观察到聚集体组分的明显减少。尽管TBS蔗糖梯度与标准体系(蔗糖/水)相比具有数个优点，但在该梯度的更高加载量(50升相比25升)(操作3)下，观察到抗原产率损失。在使用TBS代替水的两种情况中，波峰汇集液体积增加，这表明在加载的收获物和包含缓冲物质及其他电解质的梯度之间的更多扩散。实施例3:两步蔗糖/TBS梯度的开发该实施例显示了一种示例性的实施方式，其中蔗糖梯度被改进，以便在不改变对于分级分离的限制的情况下增加波峰汇集液组分的体积。使用具有降低的浓度42%(w/w%)的蔗糖梯度，导致由超速离心洗脱的较小急剧升降的蔗糖梯度。为了确保在梯度中足够高的蔗糖浓度，在42%(w/w%)溶液之后加载浓度更高的50%(w/w%)蔗糖/TBS溶液。结果，作为更高浓度的溶液，形成了"缓冲"，从而防止抗原沉积在转子器壁上。表2显示了使用这样的两步梯度的纯化操作，该两步梯度使用卯0mL较低浓度的蔗糖/TBS溶液(42。/。w/w蔗糖，U.7mmol/kgTRIS，4.7g/kgNaCl)和100mL更高浓度的蔗糖/TBS溶液(50%w/w，10mmol/kgTRIS，4g/kgNaCl)，将该两步梯度的纯化操作与使用加载不同体积(即，600、800、以及1000mL)的仅用50。/。蔗糖/TBS溶液形成的梯度的纯化操作进行了对比。在20,000rpm(RCF约为30,000g)下采用预澄清器，进行测试。通过采用不同量和浓度的蔗糖/TBS溶液，材料的产率和纯度受到的影响不明显。然而，通过42%/50%(w/w%)蔗糖/TBS的混合物构造的两步梯度的应用导致波峰汇集液体积的显著增加，这会通过降低抗原浓度以避免波峰汇集液组分的过载而导致更好的纯化条件。表2:使用不同量蔗糖/TBS50%(w/w%)的通过超速离心进行纯化的甲型流感/Panama/2007/99失活收获物的产品产率和抗原纯度与采用两步蔗糖/TBS梯度(50%/42%(w/w%))的对比。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例4:在没有预澄清器的情况下更高相对离心力的实施研究了用于超速离心的更高相对离心力，以便提高抗原产率。然而在这样的条件下不得不考虑在预澄清器中的材料损失。超速离心转子能够在有或没有预澄清器的情况下运行，因此，对使用预澄清器的20,000rpm(约为30,000g)与在两步蔗糖/TBS梯度(100mL的50%w/w蔗糖，终浓度10mmol/kgTRIS，4g/kgNaCl;和900mL的39%w/w蔗糖，终浓度12.2mmol/kgTRIS，4.9g/kgNaCl)中的35,000rpm(约为90,000g)进行对比。为了评估潜在的抗原损失，用缓冲液抽吸预澄清器和转子器壁，并且分析抗原损失。该实验结果如表3所示。抗原产率能够从1.7mgHA-SRD/L收获物提高到2.8mgHA-SRD/L收获物，提高了60%以上。遗漏的抗原的主要部分能够从预澄清器中被抽吸出来，而在超速离心机的转子器壁上仅损失了约5%的抗原。通过在将收获物加载到蔗糖/TBS梯度上之前省略预澄清步骤，SRD/蛋白质比率仅略微地降低。表3:在有和没有预澄清器的情况下，使用不同的相对离心力，通过超速离心甲型流感/Panama/2007/99的失活收获物进行产品产率和损失以及抗原纯度的对比。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例5:在蔗糖梯度中TRIS和NaCl浓度的改进通过将50%(重量)庶糖与50%(重量)TBS缓冲液(20mmol/kgTRIS，8g/kgNaCl)混合来制备50%w/w蔗糖/TBS梯度，得到10mmo/kgTRIS和4g/kgNaCl的终浓度，形成初始配方。接着，用更高含量的TBS制备较低浓度的配方42y。-39W蔗糖/TBS溶液，得到更低浓度的蔗糖、但是相对更高浓度的TRIS和NaCl(参见在前实施例)。更高浓度的溶液，比如，例如在TBS中55%(w/w)蔗糖因此具有更低浓度的TRIS和NaCl。为了标准化在这样的制品中的TRIS和NaCl的浓度，设计新的配方，其中将42wt%-55wt。/。的蔗糖加至混合容器，加入20mmol/kg(2.42g/kg)TRIS和8g/kgNaCl并且用水补加至100wt%。则这样的制品具有与在前述实施例中使用的配方相比明显更高(约2倍)浓度的TRIS和NaCl。而且，由于更小的水含量，这样的配方的折射计测量值导致折射结果高出约2。(1°-3°)Brix(白利糖度)。其中，在补加至最终100wt。/。之前水被添加的TRIS替代。在实验中，将两个不同版本的两步蔗糖/TBS梯度进行比较。在用800mL的42。/。蔗糖/TBS加载之后，通过加入200mL更高浓度的蔗糖/TBS溶液来构造梯度，从而在梯度中产生更耐用的高密度蔗糖缓冲。在超速离心实验中不同的蔗糖/TBS制品的结果如表4所示。当使用不同的TRIS和NaCl浓度时，就产率或纯度而言，没有观察到显著差异。表4:使用具有不同TRIS和NaCl浓度的不同蔗糖/TBS制品，通过超速离心甲型流感/Panama/2007/99的失活收获物进行产品产率和抗原纯度的对比。纯化操作条件/设置HA-SRD/蛋白质比率(mg/mg)抗原产率(mg抗原/升收获物)1TBS(12.2mmo1/kgTRIS/4.9g/kgNaCl)中42%蔗糖TBS(8.9mmo1/kgTRISS/3.6g/kgNaCl)中55%蔗糖0.425.02TBS(20mmo1/kgTRIS/8g/kgNaCl)中42%蔗糖TBS(20mmo1/kgTRIS/8g/kgNaCl)中55%蔗糖0.394.8实施例6:转子加载量和加载流速的研究研究三个不同菌株的不同收获物体积，评估优化超速离心工艺的容量，并且研究当更大的收获物体积必须应用于超速离心工艺时在制造中潜在的放大结果。在1600mL转子上加载15-17L和45-51L的失活收获物。在该实验中，按照前述实施例5的方法，使用相同的改进型两步蔗糖/TBS梯度。首先，高密度溶液的浓度被增加到55。/。w/w，并且在加载800mL的42M蔗糖/TBS以后，使用更大体积的200mL以便在梯度中产生更耐用的高密度蔗糖缓冲。在两种蔗糖/TBS溶液中，梯度中最终的TRIS浓度被增加到20mmol/kg，并且最终的NaCl浓度被增加到8g/kg。超速离心条件是在没有预澄清器的情况下为35,000rpm(90,000g)，并且在48%至36%蔗糖之间进行分级分离。15加载量实验的结果如表5所示。在没有预澄清器的情况下使用本发明的梯度和更高的离心力，在不同的收获物加载体积下仅能够观察到较小的约3%至6%的产率差异。这与实施例2或表1中有限的加载量相反，后者中对于菌株甲型流感/Panama/2007/99，收获物体积从25升提高到50升，导致产率降低约30%。该提高的产率可以解释如下提高的相对离心力、和由于两步庶糖/TBS梯度导致的梯度分布以及波峰汇集液体积的改进。表5:使用不同的加载体积通过超速离心进行的产品产率和抗原纯度的对比。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例7:本发明的超速离心工艺与普通的超速离心工艺的对比组合使用下述条件a)在没有预澄清器的情况下90，000g(35,000rpm)(代替使用预澄清器的30,000g(20,000rpm))b)在TBS中的蔗糖梯度(代替在水中的蔗糖)，终浓度为20mmol/kgTRIS和8g/kgNaClc)形成这样一种梯度具有两个不同的蔗糖浓度(200mL55°/。+800mL42%)以提高波峰汇集液组分体积(代替800mL的50%蔗糖)，将其与在前的普通超速离心工艺相比较(表6)。表6:在标准条件(在水中50%蔗糖)和新条件下制造规模和小规模纯化单元操作的条件和设置(按1:2比例縮小)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*未使用预澄清器使用2002/2003菌株(即，甲型流感/NewCaledonia/20/99、甲型流感/Panama/2007/99和乙型流感/Shangdong/7/97)进行三个比较实验。对于这些操作的波峰汇集液分级分离限制被限定为48%至36%(w/w%)蔗糖。结果显示在实施例8至实施例10中。基于产率和产品质量参数，将来自在标准条件(50%庶糖/水)和改进条件(蔗糖/TBS梯度)下使用流感NewCaledonia、Panama和Shangdong的纯化操作的结果进行比较。实施例8:流感菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99的纯化使用NewCaledoniaMVH，采用根据标准方法和根据表6的新的蔗糖/TBS梯度参数的条件进行纯化实验。在表7中给出了来自纯化操作的结果的对比。表7:甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原产率、HA/蛋白质比率和Vero-蛋白质杂质的对比。采用普通的2001/2002方法比对改进的TBS梯度的蔗糖梯度纯化的病毒。纯化操作抗原产率(mg抗原/升收获物)HA/总蛋白质比率Vero-蛋白质/HA比率标准2.70.410.06新的(TBS梯度)3.40.600.07从表7中数据中可得出如下结论对于流感菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99，采用新的蔗糖/TBS梯度纯化条件取得了显著的工艺改进。对于该特定的菌株，显示出病毒产率从2.7到3.4mg抗原/每升MVH的显著提高。作为HA/总蛋白比率和Vero-蛋白质/HA比率测量的病毒抗原质量显示，剂量/每升的提高不会损害抗原质量。采用新的蔗糖梯度条件，取得了HA/总蛋白从0.41到0.60的轻微提高。对于寄主细胞蛋白质/HA比率，未能检测到显著差异。在蔗糖/TBS梯度条件下，对于PMVH生产，略微地降低了菌株甲型流感/NewCaledonia/20/99的聚集。可以通过显微镜观察证实该效果(参见，例如，图1A和图1B)。在400倍放大增强时，当使用前述蔗糖/水梯度时，清楚可见聚集体的形成(图1A)。反之，不论产率提高与否，由优化的超速离心工艺得到的波峰汇集液组分表现为明显更均一(图1B)。实施例9:流感菌株甲型流感/Panama/2007/99的纯化17使用PanamaMVH，采用根据标准方法和根据表6的新的蔗糖/TBS梯度参数的条件进行纯化实验。在表8中给出了来自纯化操作的结果的对比。表8:甲型流感/Panama/2007/99抗原产率、HA/蛋白质比率和Vero-蛋白质杂质的对比。采用标准方法比对本发明TBS梯度方法的蔗糖梯度纯化的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表8中的数据可得出如下结论对于流感菌株Panama,采用新的蔗糖/TBS梯度纯化条件取得了显著的工艺改进。对于该特定的菌株，通过使用新的蔗糖/TBS梯度条件，显示出病毒产率由2.0至5.5mg抗原/每升MVH的显著提高。取得了0.77的HA/总蛋白比率。反之，对于在标准条件下产生的PMVH，计算出的比率是1.47。对于使用两种工艺产生的PMVH的Vero-蛋白质/HA比率，由于未能看出显著差异，故可以推测，Panama抗原(如PanamaPMVH的显微照片(未图示)对比所示)的聚集可能是HA/总蛋白比率为异常的1.47的原因。对于两种纯化工艺，作为HA/总蛋白比率和Vero-蛋白质/HA比率测量的病毒抗原质量是可接受的。但是，在TBS蔗糖梯度条件下，对于PMVH生产，通过使用蔗糖/TBS梯度，菌株Panama的聚集能被明显降低。实施例10:菌株乙型流感/Shangdong/7/97的纯化使用ShangdorigMVH，采用根据标准方法和根据表6的新的蔗糖/TBS梯度参数的条件进行纯化实验。在表9中给出了来自纯化操作的结果的对比。表9:乙型流感/Shangdong/7/97抗原产率、HA/蛋白质比率和Vero-蛋白质杂质的对比。采用标准方法比对新的TBS梯度方法的蔗糖梯度纯化的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>从表9中的数据可得出如下结论对于流感菌株乙型流感/Shangdong/7/97，采用本发明的蔗糖/TBS梯度纯化条件取得了显著的工艺改进。对于该特定的菌株，显示出病毒产率从2.2到5.1mg抗原/每升MVH的显著提高。对于蔗糖/TBS纯化的MVH，下降的HA/总蛋白比率0.34在流感PMVH规定范围之内。另外，乙型流感/Shangdong/7/97病毒复制阶段的改进允许通过改变胰蛋白酶剂量分布型而建立更一致的生产工艺。在TBS蔗糖梯度条件下，对于PMVH生产，乙型流感/Shangdong/7/97菌株的聚集被明显降低，如同被采用标准条件比对TBS条件进行纯化的ShangdongPMVHs显微照片(未图示)证实的那样。在此处提供的示例性的大规模和小规模实验中，证实了本发明的蔗糖梯度允许有效加载单价的收获物。使用在此描述的本发明方法有许多优点，包括1)病毒产率提高至少25%;2)取决于菌株的HA/总蛋白的比率由0.34提高至0.77;3)取决于菌株的寄主细胞蛋白质含量由2%提高至7%;以及4)最小化在蔗糖波峰汇集液中的病毒(PMVH)聚集。权利要求1.一种用于病毒或病毒抗原纯化的方法，其包括通过离心至少一种第一缓冲糖溶液和至少一种第二缓冲糖溶液，提供包含糖梯度的梯度形成溶液，其中，所述第一缓冲糖溶液的糖浓度具有35％至50％(w/w％)的蔗糖当量，所述第二缓冲糖溶液中的糖浓度具有50％至65％(w/w％)的蔗糖当量，且所述第二缓冲糖溶液的密度高于所述第一缓冲糖溶液；将病毒制品加至糖梯度；将病毒制品和糖梯度离心，以得到波峰汇集液；以及萃取所述波峰汇集液，以得到病毒或病毒抗原。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述梯度形成溶液的体积占超速离心转子的体积的5%至100%。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述波峰汇集液的密度在1.13kg/L和1.25kg/L之间。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，收集的所述波峰汇集液的蔗糖当量在30%和54%(w/w%)蔗糖之间。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种所述缓冲液的浓度在5mM和50mM之间。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述至少一种所述缓冲液的浓度在15mM和30mM之间。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述至少一种所述缓冲液的浓度在18mM和25mM之间。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将病毒制品离心的步骤采用至少20,000g的相对离心力进行。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述相对离心力是至少30,000g。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述相对离心力是至少90,000g。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲糖溶液对所述至少一种第二缓冲糖溶液的所述体积比是20:1至1:1。12.如权利要求ll所述的方法，其特征在于，所述体积比是10:1至1.5:1。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述体积比是8:1至2:1。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述体积比是6:1至3:1。15.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述包含糖梯度的溶液包含两层。16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制品不包含预澄清剂。17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种第一缓冲糖溶液包含浓度范围为40%至44%(w/w%)蔗糖当量的糖。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一种第一缓冲糖溶液包含浓度范围为41%至43%(w/w%)蔗糖当量的糖。19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种第二缓冲糖溶液包含浓度范围为52%至58%(w/w%)蔗糖当量的糖。20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述至少一种第二缓冲糖溶液包含蔗糖当量为54%至56%的糖。21.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒制品包含用病毒接种的细胞。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述细胞来自动物细胞培养物或者细胞系。25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述细胞是上皮细胞。26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞是肾上皮细胞。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述细胞是Vero细胞。28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被失活。29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒被破碎。30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂成分是胺类。31.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂成分是TRIS。32.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是TRIS-缓冲盐水。33.—种制备抗病毒或病毒抗原的疫苗的方法，其特征在于，通过使用如权利要求1所述的方法得到所述病毒或病毒抗原。34.—种用于病毒或病毒抗原纯化的方法，其包括通过离心至少一种第一缓冲糖溶液和至少一种第二缓冲糖溶液，提供包含糖梯度的梯度形成溶液，其中，所述第一缓冲糖溶液的密度是1.15kg/L至1.23kg/L，所述第二缓冲糖溶液的密度是1.23kg/L至1.32kg/L，且所述第二缓冲糖溶液的密度高于所述第一缓冲糖溶液；将病毒制品加至糖梯度；将病毒制品和糖梯度离心，以得到波峰汇集液；以及萃取所述波峰汇集液，以得到病毒或病毒抗原。全文摘要本发明提供了一种用于纯化病毒或病毒抗原的方法，其包括提供病毒制品；以及在通过添加两种以上不同浓度的缓冲糖层而建立的蔗糖梯度中离心所述病毒制品。该方法通过提高波峰汇集液的体积而导致较高的产率，并且降低不希望有的病毒或病毒抗原的聚集。文档编号C12Q1/70GK101688187SQ200880021203公开日2010年3月31日申请日期2008年4月30日优先权日2007年5月4日发明者利奥波德·格里伯格,曼弗雷德·赖特,沃尔夫冈·蒙特,阿图尔·米特雷尔,霍斯特·沙夫豪泽申请人:巴克斯特国际公司;巴克斯特保健股份有限公司