专利名称：蛋白激酶pftk1单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及蛋白激酶PFTK1单克隆抗体及其制备方法，属于免疫化学领域。
背景技术：
细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-d印endant Kinase, CDK)是一类细胞周期调 控蛋白激酶的总称，这类蛋白激酶与相关周期蛋白结合后发挥生理生化功能。CDK1 (又名 Cdc2)是这个家族中的重要成员。PFTK1是一种⑶K1相关蛋白激酶，最近的研究发现它的 相关周期蛋白是cyclinD3，由于这类蛋白激酶与癌症的发生发展密切相关，因此它的生理 学作用引起人们广泛的关注。单抗作为PFTK1的重要检测工具，对揭示与PFTK1功能具有 重要意义。但目前国内外尚无商品化的PFTK1单抗，因此制备PFTK1单抗对科研及临床应 用具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，首先本发明提供了一种PFTK1多肽序列，其是人工合成的多肽 片段，命名为P，可作为半抗原，该多肽序列包含SPSSPTSPKFGKADSYEKLEKL的保留序列。本发明同时还提供了上述半抗原与常规蛋白载体偶联后得到的免疫抗原和检测 抗原。将半抗原P分别与小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联，得 到KLH-P和BSA-P，以KLH-P做免疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检 测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。本发明还提供了一株能稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为 4E7。本发明目的还在于提供一种鼠源性抗PH(T1单克隆抗体。其优选采用单克隆抗体 制备方法，并以人工合成的多肽P与血蓝蛋白KLH偶联物为免疫抗原制备而得。具有灵敏 性高、特异性强、实用性好的特点。本发明还提供了抗PFTK1某段抗原表位的单克隆抗体的制备方法。其包括如下步 骤1)制备免疫原将人工合成的1条多肽片段分别与KLH和BSA偶联，以KLH-P做 免疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血 清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。2)免疫采用常规方法，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳 化，皮下和腹腔混合方式免疫BALB/c小鼠；之后以不完全佐剂与免疫抗原乳化，腹腔注射 小鼠，免疫剂量与初次免疫相同，融合前，腹腔注射无佐剂抗原。3)筛选用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清。4)细胞融合、筛选及克隆化选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外 融合，经亚克隆获得稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体细胞株。
5)单克隆抗体的提取与纯化采用体外制备腹水法，提取单克隆抗体，将克隆化 的细胞株体外扩大培养后，打入经产小鼠腹腔，产生大量腹水，采用优球蛋白沉淀法纯化单 克隆抗体。以上述方法人工合成肽段与大分子蛋白偶联物作为免疫原，制备得到抗PFTK1表 位的单抗，特异性强、灵敏性高，为科学研究提供检测工具，为开发免疫检测试剂盒奠定基 石出。另一方面，本发明还提供了一种蛋白激酶PFTK1的免疫检测试剂盒。其优选含有 上述检测抗原利/或鼠源性抗PH(T1单克隆抗体的。可优选是ELISA检测试剂盒。
附图1SDS-PAGE法鉴定人工抗原合成结果附图2杂交瘤4E7分泌的抗体亚类亚型鉴定结果附图3抗体特异性检测附图4小鼠腹水纯化电泳图
具体实施例方式1 材料PFTK1的120-141位的氨基酸序列，Hysbio Ltd公司提供；KLH、BSA、HRP-羊抗 小鼠IgG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT，Sigma公司；抗体亚型鉴定试剂盒， Southernbiotech公司；胎牛血清，PAA公司；DMEM培养基，Invitrogen公司；骨髓瘤sp2/0， 北京协和医院；酶标板，Corning公司；细胞培养板，Nunc公司；实验动物为6_8周龄的 balb/c雌性小鼠，维通利华有限公司。重组GST-PFTK1(1-139肽段)，英国MRC提供。2 方法2. 1人工抗原的合成免疫抗原的合成称取15mg KLH溶于lmL 0. 01mol/L的PBS(pH7. 4)中，再准确称 取10mg半抗原，溶于lmL 0. 01mol/L的PBS(pH7. 8)中，将多肽逐滴加入KLH中，磁力搅拌 下，充分混勻。在冰水浴条件下，缓缓加入戊二醛溶液(终浓度达到0.5%)，于黑暗中 室温反应2个小时，然后将上述溶液用G-25凝胶层析柱洗脱除盐。检测抗原的合成将免疫抗原合成中的15mg KLH换为10mg BSA,以下方法同免疫 抗原的合成。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹 水的抗体效价。2. 2动物免疫初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳化，皮下和腹腔混合方式注 射雌性BALB/c小鼠5只，每只剂量为50 u g ；之后每隔2周，以不完全佐剂与免疫抗原乳化， 腹腔注射小鼠，免疫剂量与初次免疫相同。第3次免疫7d后采血，用间接ELISA法检测动物 血清效价，取血清效价高的小鼠脾细胞进行融合，融合前3d，腹腔注射无佐剂抗原50 y g。2. 3杂交瘤细胞株的建立取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾细胞，骨髓瘤与脾细胞的比例为1 5，采用PEG法进行细胞融合，在96孔板筛选，培养，克隆。阳性孔经有限稀秆法连续克 隆3次后扩大培养，用于制备腹水。2. 4单克隆抗体的扩大制备采用8-10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，每只0. 5ml, 1周后每只 小鼠腹腔注射1 x 106个杂交瘤细胞悬液，7-9d后采集腹水。2. 5单克隆抗体鉴定2. 5. 1单克隆抗体亚型的鉴定采用southernbiotech公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分析其亚类亚型。2. 5. 2特异性的测定采用Western-Blot法鉴定，方法参照沈关心的《抗体技术试验指南》。3结果与讨论3. 1 SDS-PAGE电泳法鉴定人工抗原合成结果载体蛋白与多肽(P)发生偶联后，其分子量必然会增加，偶联的多肽量越多，其分 子量增加的越大，附图1为载体蛋白BSA与多肽偶联前后凝胶电泳图，从附图1中，1为蛋白 marker ；2为BSA ；3为BSA-P ；4为KLH ；5为KLH-P，从图中可以看出，BSA、KLH与多肽偶联 后分子量有所增加，表明偶联成功，但BSA-P、KLH-P分子量并不单一，原因可能是每分子蛋 白与多肽偶联的数量不等所致。3. 2单克隆抗体制备结果测定3免小鼠血清，取效价最高的小鼠进行细胞融合，筛选阳性细胞株，克隆化， 得到两株能稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为4E7，其保藏号为3140。3. 3杂交瘤细胞上清液及小鼠腹水效价测定结果杂交瘤细胞4E7上清液效价结果分别为1 1280，小鼠腹水效价结果均为 1 32000。3. 4抗体亚类亚型鉴定结果如附图2所示，经southernbiotech试剂盒鉴定，杂交瘤4E7分泌抗体亚类均为 IgM，轻链类型均为k型。3. 5抗体特异性鉴定结果附图3中第1泳道为GST，分子量为26kDa第2泳道为GST与PFTK1 (1-139)多肽 片段的重组蛋白，其分子量40kDa。如附图3所示抗体4E7与抗原(GST-PFTK1)在分子量 40kDa有特异性结合，在分量为26kDa没有任何条带，表明抗体能够识别PFTK1，特异性很好。3. 6抗体纯化结果如附图4所示，1为marker，2、3、4为纯化后蛋白，上样量分别为10u 1、20u 1和5u 1， 5为小鼠腹水稀秆10倍上样。经分析，IgM重链分子量为69，轻链分子量为27，由于IgM是 一个五聚体，总分子量应该为961kDa。从附图4中可以看出，优球蛋白法纯化IgM能够得到 高纯度的IgM，达到86. 8%。实施例11)制备免疫原人工合成的1条多肽片段，命名为P，分别与KLH和BSA偶联，以 KLH-P做免疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。2)免疫采用常规方法，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳 化，皮下和腹腔混合方式免疫BALB/c小鼠；之后每隔2周，以不完全佐剂与免疫抗原乳化， 腹腔注射小鼠，免疫剂量与初次免疫相同，融合前3d，腹腔注射无佐剂抗原。3)筛选用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清。4)细胞融合、筛选及克隆化选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外 融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体细胞株。该杂交瘤细胞株命名为 4E7，是一种能够分泌抗PFTK1单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞于2009年7月7日 保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为 CGMCC No. 3140。5)单克隆抗体的提取与纯化采用体外制备腹水法，提取单克隆抗体，将克隆化 的细胞株体外扩大培养后，打入经产小鼠腹腔，产生大量腹水，采用优球蛋白沉淀法纯化单 克隆抗体。
权利要求
一种PFTK1蛋白激酶的多肽，其特征在于包含SPSSPTSPKFGKADSYEKLEKL的保留序列。
2.—种PFTKl免疫抗原，其特征在于是由如权利要求1所述半抗原与KLH偶联得到的。
3.—种PFTKl检测抗原，其特征在于是由如权利要求1所述半抗原与BSA偶联得到的。
4.一种能稳定分泌抗PFTKl的单克隆抗体的杂交瘤细胞4E7，保藏号3140，其是由权利 要求1所述半抗原制备得到的。
5.一种鼠源性抗PHiTl单克隆抗体，其是由权利要求2所述免疫抗原制备得到的。
6.一种如权利要求5所述单克隆抗体的制备方法，其包括如下步骤1)制备免疫原将权利要求1所述半抗原分别与KLH和BSA偶联，以KLH-P做免疫抗 原，以BSA-P做检测抗原；2)免疫采用常规方法，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳化，皮 下和腹腔混合方式免疫BALB/c小鼠；之后以不完全佐剂与免疫抗原乳化，腹腔注射小鼠， 免疫剂量与初次免疫相同，融合前，腹腔注射无佐剂抗原；3)筛选用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；4)细胞融合、筛选及克隆化选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融 合，经亚克隆获得稳定分泌抗PFTKl的单克隆抗体细胞株；5)单克隆抗体的提取与纯化采用体外制备腹水法，提取单克隆抗体，将克隆化的细 胞株体外扩大培养后，打入经产小鼠腹腔，产生大量腹水，采用优球蛋白沉淀法纯化单克隆 抗体。
7.一种蛋白激酶PFTKl的免疫检测试剂盒，其含有如权利要求5所述的鼠源性抗 PFKTl单克隆抗体的。
全文摘要
本发明提供了一种抗人蛋白激酶PFTK1的特异性单克隆抗体及其制备方法。该单克隆抗体具有与蛋白激酶结合的特异性强的特点。为研究蛋白激酶PFTK1生理生化功能提供了检测工具。
文档编号C12N15/06GK101928700SQ20091015779
公开日2010年12月29日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者任发政, 姜鹭, 曹雪, 葛克山, 郭慧媛 申请人:北京恒宇视野生物科技有限公司