专利名称：人肝癌细胞中sEH基因启动子区甲基化作用的调控元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因的转录调控，具体的说，对人肝癌细胞中^^H基因启动子区受转录因子SP1作用的调控元件以及甲基化对此转录调控的影响。
背景技术：
可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)最早于1W3年由Gill等在研究类似昆虫保幼激素萜类环氧化物的代谢时发现，因其主要位于细胞的可溶性成分如细胞质和过氧化物酶体中而命名。人类s五/f已经被克隆并表达，它是由两个62KD单体构成的同型二聚体，每个单体由富含脯氨酸的肽片段连接。两个区域均具催化活性C末端区域含有典型的a / e水解酶折叠结构，具有环氧化物水解酶的活性。N末端区域具有脂质磷酸酶活性，但其具体生物学作用尚不清楚。"W在哺乳动物组织中广泛存在，在肝脏、肾脏、肠和血管中活性较高。在花生四烯酸的代谢通路中，细胞色素P450 2J2和2J9是将花生四烯酸转化为环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids， EETs)的主要亚型。而EETs在细胞内半衰期较短，主要经s五/Z迅速催化降解为相应的生物活性较弱的物质，且其转化具有区域选择性。在许多组织中它与细胞色素P450 2J2和2J9共同集中分布，三者对维持不同组织中EETs的水平具有重要作用。
研究认为很多内源或外源性的环氧化物被认为是潜在的致癌物或者致突变物，并认为与肿瘤的发生发展有着密切的关系。最近的研究发现CYP2J2， 2J9在多种恶性实体肿瘤，如食管癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肠癌和小细胞肺癌等的表达较癌旁组织和正常组织均有明显升高，进一步发现P450 2J2， 2J9和EETs广泛参与肿瘤增殖的调控作用，并能促进肿瘤细胞的转移。而^五i/作为EETs的高效水解酶，可显著抑制其在肿瘤细胞中的表达及其致瘤作用。的表达模式与CYP 2J2和2J9相反，在恶性肝实体肿瘤组织中表达水平明显低于在癌旁正常组织。推测可能由于^￡ /在肝癌组织中的减少致使CYP 2J2， 2J9及其EETs表达水平升高进而致癌，所以s五/Z很可能作为肝癌变中的重要抑制因子，阻止肿瘤的发生。
研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。DNA的异常甲基化是肿瘤中最常见的分子改变形式之一，己成为探讨肿瘤发生机制新的研究热点。DNA甲基化多发生在CG含量较高的区域(CpG岛)，而此类区域正是转录因子SP1与基因组DNA结合位点。发生甲基化后DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶在甲基转移酶的催化下被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，会阻滞SP1与其相应的DNA结合位点的相互作用，进而抑制基因的转录表达。肝细胞癌是一种基因启动子CpG岛区域发生高频率甲基化异常的肿瘤，包括基因组总体甲基化水平降低与某些基因(特别是抑癌基因)启动区域发生的高甲基化。大量实验表明，在肝癌发生过程中存在着多种抑癌基因，如P16,P15,P53，Rbl等基因的启动子区CpG岛的高甲基化现象，干扰抑癌基因的转录，导致细胞异常增殖进而
引起细胞癌变。研究表明人A//5，侧翼区域富含CG 二联核苷酸，且有一系列SP1结合位点，在人肝癌细胞中，s五/Z表达的降低是否通过甲基化作用来影响转录因子SP1与其DNA结合位点的相互作用有关尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种s五/Z基因启动子区受转录因子SP1调控的元件，通过结合该调控元件来抑制高效水解酶EETs在肿瘤细胞中的增殖作用，阻滞肿瘤细胞的转移。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因启动子的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。
为了实现上述目的，本发明利用分子生物学在线软件http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx对肝癌细胞s五//基因转录起始位点前后可能存在的转录调控区域(-2000bp +1000bp)进行了分析，发现M/f 5，侧翼区域(-367bp到+602bp)富含CG二联核苷酸，平均在65%以上，认为存在CpG岛，可能存在甲基化作用的修饰，从中找出甲基化对s五/Z基因启动子关键作用位点，对肝癌细胞中s五/f基因的转录表达调控机制有着重要意义。
本发明中含有人肝癌细胞中s五/Z基因启动子的CpG岛序列，命名为^&Zf0.367，其长度为970bp。核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，保留了W/Z5，侧翼区域-367 +602bp，的片段，在SEQIDNo.l中+1为转录起始位点，按顺序往下游为+2......，往上游依次为-1......研究表明，在人肾上皮细胞系293T中，Wi/5，
侧翼区域存在三个SP1结合位点。为探讨人肝癌细胞系Hepe G2细胞中人^EF5，侧翼区域可能存在的SP1结合位点以及与甲基化作用的关系，须在甲基化和非甲基化状态下对5'侧翼区域进行缺失分析。为此采用美国加州大学Davis分校Bruce D. Hammock实验室已构建好的一系列启动子区不同SPl结合位点的嵌套缺失质粒以及本发明构建的SPl突变质粒(SPl结合位点的中间三个碱基分别进行C-A,G-A碱基突变后的重组质粒)。以甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理组为非甲基化组，无任何药物处理的对照组，利用萤火虫荧光素酶报告基因分析，比较实验组和对照组之间荧光素酶活性的差异，来探讨转录因子SPl对启动子区的转录调控机制。为减少细胞微环境所造成的误差，以e-gal质粒作为内对照，与上述嵌套缺失质粒同时共转染Hepe G2细胞，用酶标仪测定其光密度以调整因转染效率所带来的差异，每次实验重复三次。
分析表明人肝癌细胞系中，s五/Z5'侧翼区域存在5个SPl结合位点，SPlNo.l: GGGCGG (國62bp ~ -57bp); SPl No.2: GGGCGG (-95bp -90bp); SPl No.3:CCCGGCC (-127bp ~ -121bp); SPl No.4: CCCCGCC (-194bp -188 bp); SPl No,5:GGCCCGGGCC (-325bp ~ -316bp)。本发明进一步对上述5个SPl结合位点突变重组质粒的荧光素酶活性，以及加入5-氮-2-脱氧胞苷剌激后荧光素酶活性升高的倍数，分析上述5个SP1结合位点对^EH基因转录活性变化。结果显示SP1No.l、 SPlNo.2、 SPlNo.3、 SPl No.4禾卩SPl No.5均可调控s五/Z基因转录活性。其中spiNo.i未被甲基化修饰，可明显增加"://基因转录活性，去甲基化作用
对s五/Z的转录活性影响不大；SPlNo,2和SPlNo.4存在严格的甲基化牆饰，阻滞SP1与其相互结合进而抑制s五F的转录调控，去甲基化作用能显著增加的转录；SPlNo.3和SPlNo.5存在部分甲基化修饰，对^￡//的转录调控有一定的促进作用，去甲基化作用能更一步增加s五7/的转录。
与现有的技术相比，本发明的有益效果在于本发明首次利用启动子序列
不同SP1结合位点的嵌套缺失质粒，并成功构建^E/Z启动子区不同的SP1突变嵌套缺失质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达。确定了在人肝癌细胞中，5￡//基因启动子区特定转录因子SP1的结合位点，因受甲基化作用而不能结合SP1，进而致使s五/Z转录活性减低。本发明在一定程度上揭示了 ^BZ/在肿瘤细胞中的调控机制，从分子水平上探索包括肝癌在内的肿瘤发病机制，也有助于进一步认识甲基化在肿瘤发病的重要作用。本发明对研究可溶性环氧化物水解酶在肿瘤细胞中的转录调控机制以及以花生四烯酸代谢为轴心的药物研发及临床治疗具有重要意义。
图1为^E7/启动子区SP1调控元件突变嵌套缺失质粒构建流程图。图2为含^Ei/启动子区SPl结合位点嵌套缺失质粒在HepeG2中的基础与去甲基化作用后的相对荧光素酶活性分析。(a)为启动子区5'侧翼区(-100( ^/+28& )系列缺失重组质粒(在？01^3-8&8化载体图)的模式图；(b)为对
应缺失子的相对荧光素酶活性。
图3为含s5/f启动子区SPl结合位点的突变嵌套缺失质粒在HepeG2中的基础与去甲基化作用后的相对荧光素酶活性分析。(a)为s五/7启动子区5'侧翼区SP1结合为点系列突变缺失重组质粒(在pGL-3-Basic载体图，美国Promega公司)的模式图；(b)为对应突变缺失子的相对荧光素酶活性。
具体实施例方式
实施例1 5￡//启动子区SP1结合位点突变嵌套缺失质粒的构建
设计并合成5个SP1结合位点突变引物序列如下(黑体加粗为突变后的碱基)
SPl No.lForward 1: 5，-GGGGAGGAGGCAAACCCAGGGC-3，
SP1 No.2Forward 2: 5，-CCCGGGCAGAGGAAAGAGTCCC-3'
SPl No.3Forward 3: 5'-TCTTTCAAACCAGAGTCCAGCC画3，
SP 1 No.4Forward 4: 5，-GGTCCAAACCTTCCCGGCCTCC-3'
SP 1 No.5Forward 5: 5 ，-TCCAGGAAGGCAAAGGCCTGGG-3'
SPl共用下游引物Reverse: 5，-GGTACCTATCGATAGAGAAATGTTC-3，
应用TaKaRa Mutan BEST Kit (大连宝生物工程有限公司)首先以含有W//启动子区(-1000/+28& ^01^3-8&3化质粒为模板(命名为pB-1000)，分别以上述5对突变引物使用高保真DNA聚合酶PCR扩增不同SPl结合位点突变质粒。PCR产物胶回收纯化后，末端平滑化及5'末端磷酸化反应。然后采用DNA高效连接液Ligation Solution I使PCR产物自身连接后，质粒DNA转化入DH5a感受态细胞，涂LA培养盘，37"C培养8-12小时，挑选单克隆。于LA培养液中，37。C摇菌培养12小时后，采用Plasmid Mini Kit (QIAGENE公司)小提质粒DNA。测序证明":/Z基因启动子区不同SP1结合位点突变质粒DNA己定向克隆到萤火虫荧光素酶基因上游。^E/Z启动子区嵌套缺失质粒命名依次为pB-42、pB國56、 pB-99、 pB-144、 pB-192、 pB-298和pB-lOOO。突变重组质粒分别命名依次为pB-56mu、 pB-99mu、 pB-144mu、 pB-192 mu禾Q pB-298 mu。上述质粒收藏于汕头大学医学院心血管中心。以pB-99mu为例的整个质粒构建流程如图1所示。
实施例2人肝癌细胞^^//基因启动子不同SP1结合位点在甲基化和去甲基化
作用下的转录活性分析
A方法
1. 细胞培养人肝癌细胞系HepeG2在37。C， 5%(302含10%小牛血清的常规DMEM培养基中贴壁生长，用0.25%的胰酶消化液进行消化传代。
2. 质粒大量提取和纯化采用Plasmid Midi Kit (德国QIAGENE公司)提取转染所需的试验质粒、突变质粒和内参质粒P-gal质粒DNA(美国Promega公司)，测定其含量和纯度。上述质粒用buffer EB (10Mm Tris-Cl， pH 8.5)稀释至400ng/ul，将实验质粒和内参质粒按4: l的体积比混合。
3. 瞬时转染和去甲基化作用细胞转染在超净工作台中操作，转染前24小时，在24孔板中铺种Hepe G2细胞，每孔500ul，细胞计数约5.0xl04。按照JetPEI 转染试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)说明书，24孔板每孔准备稀释l吗质粒DNA (0.8 ug试验质粒DAN和0.2ug卩-gal内参质粒DNA)到150mM氯化钠中，轻混匀为A液；另外每孔准备稀释适量JetPEI (1.2-2 pi)到50)ill50mM氯化钠中，轻混匀为B液。立即将B液倒入A液中，混匀，室温静置30分钟为C液后加入24孔板，每孔100^1，再向每孔加入400ul 10%小牛血清的DMEM培养液。24小时后实验组每孔加入终浓度为2.0 nmol/L的5-氮-2-脱氧胞苷，作用72小时，对照组每孔加10%小牛血清的DMEM培养基500ul常规培养。
4. 荧光素酶活性测定药物处理组和对照组细胞用PBS漂洗两遍后，每孔加入50^1裂解液RLB (Promega公司，Dual-Luciferas Reporter Assay System试齐廿盒)，室温静置15分钟冰上刮下细胞，混悬15秒，4°C， 13000rpm离心3分钟。取上清5ul与荧光素酶底物20ul混匀在96孔白色酶标板中，用荧光素酶报告测定仪(Promega公司)测定结果。
5. 卩-gal内参测定按说明书配置P-gal标准品，在96孔酶标板中混合样品和2x工作缓冲液， 一般各为25pl， 37°C， 30分钟至明显显色为止，采用酶标仪在420nm处读取OD值。
B.结果
人肝癌细胞Hepe G2中s五/f基因启动区不同SP1结合位点对荧光素酶活性的比较由图2可知，^EZ/启动子区5个不同SP1结合位点中，SPlNo.l、 SP1No.3和SPl No.5在无任何剌激时对的转录活性均有提高，而SPl No.2和SPl No.4对^^i/的转录活性无明显作用。在甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷刺激后SPl No.2、 SPl No.3、 SPl No.4和SPl No.5时对W//的转录活性均有2-3倍的显著升高，而SPl No.l结合位点则无明显作用。
SPl结合位点突变质粒荧光素酶活性分析，由图3可知，相对于SPl结合位点质粒未突变时，SPl No.3和SPl No.5突变质粒的荧光酶活性均有一定程度的降低，而且其去甲基化作用后的荧光酶活性也比无突变时有所减低；SPl No.2和SPl No.4突变质粒的荧光酶活性和无突变时无明显差异，二者去甲基化作用后的荧光酶活性也比无突变时有所减低；而SPl No.l突变质粒的荧光酶活性比无突变质粒有明显减低，即使去甲基化作用后也无明显改变。
结果说明在Hepe G2细胞中启动子区SP1 No. 1处于未甲基化状态可以增加^Ei/的转录，去甲基化作用对其影响不大；SPl No.2和SPl No.4两个SPl结合位点为高甲基化状态，对s五/f的转录无明显促进作用，而去甲基化可使明显增加5￡//的转录活性；SPl No.3和SPl No.5结合位点处于部分甲基化状态，去甲基化可进一步提高的转录。人Hepe G2细胞中s五/Z基因启动区相关序列
1
DNA
M://0.367序列启动子区CpG岛
CATCACTGGGAAATGGTAGATGGGGTGTGC +602bp
2
DNA
5个SPl结合位点突变引物(黑体加粗为突变后的碱基)
SP1 No. 1 Forward 1:5, -GGGGAGGAGGCAAACCC AGGGC-3'
SPl No.2Forward 2: 5，-CCCGGGCAGAGGAAAGAGTCCC-3，
SPl No.3Forward 3: 5，-TCTTTCAAACCAGAGTCCAGCC-3，
SPl No.4Forward 4: 5,-GGTCCAAACCTTCCCGGCCTCC-3，
SPl No.5Forward 5: 5'-TCCAGGAAGGCAAAGGCCTGGG-3'
SPl共用下游引物Reverse: 5，-GGTACCTATCGATAGAGAAATGTTC-2
3
DNA
人肝癌细胞系中^:/f 5'侧翼区域存在的5个SPl结合位点序列
SPl No.l: GGGCGG (-62bp-56bp)
SPl No.2: GGGCGG (-95bp-90bp)
SPl No.3: CCCGGCC (-127bp- 120bp)
SPl No.4: CCCCGCC (-194bp—187bp)
SPl No.5: GGCCCGGGCC (-325bp—316bp)
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8
权利要求
1.一种人肝癌细胞中sEH基因启动子区的CpG岛，其核苷酸序列如下SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所示的人肝癌细胞中^￡//基因启动子区的CpG岛，其特征在于 含有5个SP1调控元件SP1 No.l: GGGCGG (-62bp -57bp); SP1 No.2: GGGCGG (画95bp -90bp); SP1 No.3: CCCGGCC(-127bp ~ -121bp); SP1 No.4: CCCCGCC (-194bp 陽188bp); SP1 No.5: GGCCCGGGCC (-325bp ~画316bp)。
3. 如权利要求2所示的人肝癌细胞中^五/7基因启动子区SPl调控元件，其特征 在于未甲基化修饰的SP1 No.l、完全甲基化修饰的SP1 No.2和SP1 No.4、部 分甲基化修饰的SP1 No.3和SP1 No.5控制^E/Z基因转录活性。
4. 如权利要求2所示的人肝癌细胞中^^Z/基因启动子区SP1调控元，，其特征 在于去甲基化可调控SPlNo.2、 SPlNo.3、 SP1No.4和SP1No.5元件，增加 W/Z基因转录活性。
5. —种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的SP1调控元件连接的可操 作外源基因。
6. 如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述外源基因是报告基因。
全文摘要
本发明公开了一种人肝癌细胞中sEH基因启动子区甲基化作用的调控元件，涉及基因的转录调控领域。通过将其启动子SP1不同结合位点序列和部分SP1结合位点突变的嵌套缺失质粒插入荧光素酶报告基因上游构建一系列真核表达质粒，转染人肝癌细胞瞬时表达，确定了人sEH基因启动子在肝癌细胞中在甲基化作用下SP1关键作用位点对sEH基因的转录活性影响。本发明将有助于从分子水平上探讨包括肝癌在内的肿瘤发病机制，并为研究sEH基因在肿瘤细胞中的转录调控机制，以及以sEH为靶点的肿瘤预防和治疗开辟新的研究方向提供了参考。
文档编号C12N15/85GK101671671SQ200910157510
公开日2010年3月17日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者张东红, 毅 朱 申请人:张东红;朱 毅