专利名称：具有聚合物骨架的荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。设计探针使得在未被激活探针中发生分子内猝灭，但猝灭剂部分在限定条件下从探针裂解，这使探针发出荧光。亦公开了适于体内成像的包含探针的光学显像剂以及药物组合物和试剂盒以及体内成像方法。
背景技术：
US 6，083，485及相似专利公开用具有2. 0或更小的辛醇-水分配系数的花青染料的体内近红外(NIR)光学成像方法。亦公开所述染料与分子量高达30kDa的“生物学检测单元”的缀合物，所述生物学检测单元与特定细胞群结合，或与受体选择性结合，或在组织或肿瘤中积聚。US 6083485的染料亦可与大分子缀合，所述大分子为例如聚赖氨酸、葡聚糖、聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羧基葡聚糖或级联聚合物样结构(分子量为IOODa到超过IOOkDa)。未公开特定染料-缀合物。US 6，083，486 (General Hospital Corporation)公开 NIR 荧光探针，所述探针仅在体内与靶标组织相互作用(即激活)后才发射大量荧光。探针在分子内猝灭，包含聚合物骨架和众多与骨架共价连接的OTR荧光染料。荧光染料相对于彼此保持在允许通过能量转移相互作用从而猝灭彼此的荧光的位置。设计探针使得(i)通过非生物可降解的连接 (linkage)来让荧光染料与骨架连接，但所述骨架含有激活位点；或(ii)通过含有激活位点的连接让荧光染料与骨架连接。US 6，083，486的“荧光激活位点”是探针内的共价键，其可由靶标组织中存在的酶裂解，即遭受特异性酶促裂解。聚合物骨架优选为多肽，例如聚赖氨酸。据信优选选项(ii)，以便酶促裂解(激活)使荧光染料分子从被约束在荧光猝灭位置中释放。因此，将酶促裂解设计为从探针释放荧光染料，以便除掉猝灭荧光的布置，并因此在体内在酶激活位点选择性地观察到荧光。WO 2004/028449公开可用作荧光染料的猝灭剂的非荧光双甘菊环(bisazulene) 二聚物。亦阐述了包含双甘菊环猝灭剂和与间隔基连接的OTR荧光染料的荧光探针，其中猝灭剂和荧光染料由靶标特异性激活位点分开。然后在靶标组织中在激活位点的代谢和键裂解导致荧光染料-猝灭剂相互作用的瓦解，结果荧光由被释放的荧光染料产生 (W02004/028449 的图 3)。WO 2007/109364公开猝灭的荧光染料缀合物和其在检测和治疗特征为有害细胞增殖的病症(包括癌症)中的使用方法。荧光染料缀合物包含树枝状大分子和至少两种荧光染料，每一种经由蛋白酶裂解位点与树枝状大分子在猝灭位置共价连接。优选至少一种荧光染料为光敏剂。树枝状大分子有助于为缀合的荧光染料提供必须的几何结构，以确保未修饰的缀合物猝灭。关于US 6，083，486，可代谢的基团可在骨架内，或处于使荧光染料与树枝状大分子骨架缀合的连接中。US 2007/0036725A1公开用于标记活性蛋白酶的基于活性的探针，其具有下式
权利要求
1.一种分子内猝灭的荧光探针，所述荧光探针包含分子量为IO-IOOkDa的聚合物骨架和(i)若干(ζ)种近红外荧光染料，每一种经由抗酶裂解和生物化学氧化的第一连接与所述骨架共价连接；( )若干(ζ)个猝灭剂部分，每一个经由可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的第二连接与所述骨架共价连接；其中Z为数值1-150的整数，其中所述猝灭剂部分与所述荧光染料处于荧光猝灭能量转移关系。
2.权利要求1的探针，其中所述第二连接可通过酶代谢裂解。
3.权利要求2的探针，其中所述酶为水解酶。
4.权利要求1-3中任一项的探针，其中所述聚合物骨架抵抗酶裂解。
5.权利要求1-4中任一项的探针，其中所述聚合物骨架包括多肽。
6.权利要求1-5中任一项的探针，其中所述聚合物骨架包括共聚物。
7.权利要求6的探针，其中所述共聚物包括赖氨酸-谷氨酸共聚物。
8.权利要求1-7中任一项的探针，其中所述猝灭剂部分选自 (i)非荧光染料；( )硝基取代的苯基部分； (iii)甘菊环二聚物。
9.权利要求1-8中任一项的探针，其中所述猝灭剂部分为非荧光的。
10.权利要求1-9中任一项的光学显像剂，其中所述猝灭剂为生物相容的。
11.权利要求1-10中任一项的探针，其中所述第一连接包含磺酰胺键或酰胺键。
12.权利要求1-11中任一项的探针，其中所述荧光染料为在600-1000nm范围内具有最大吸光度的荧光染料。
13.权利要求1-12中任一项的探针，所述探针还包含生物学靶向分子。
14.一种适于体内成像的光学显像剂，所述光学显像剂包含权利要求1-13中任一项的探针。
15.权利要求14的光学显像剂，其中所述探针提供为呈适于哺乳动物给予形式的药物组合物，所述药物组合物包含所述探针连同生物相容的载体。
16.权利要求15的光学显像剂组合物，所述组合物具有适于单个患者的剂量，并提供在合适的注射器或容器中。
17.一种用于制备权利要求15或权利要求16的光学显像剂组合物的试剂盒，所述试剂盒包括呈无菌固态形式的权利要求1-13中任一项的探针，使得当用生物相容载体的无菌供应品重构时，发生溶解获得所期需的组合物。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述无菌固态形式为冻干固体。
19.一种体内光学成像的方法，所述方法包括(i)将权利要求14-16中任一项的光学显像剂给予活动物或人受试者； ( )留出时间用于(a)探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚积，和(b)在所述靶标组织中的酶通过在一个或多个如权利要求1中所定义的第二连接处的酶促裂解来激活探针，以获得激活的探针；(iii)用具有所述激活探针的荧光染料可吸收的波长的近红外激发光照射所述靶标组织；(iv)用荧光检测仪检测来自所述激活的探针的荧光，所述荧光通过步骤(iii)中的荧光染料的激发而产生；(ν)任选过滤由所述荧光检测仪检测的光，以分出荧光组分；和(Vi)根据步骤(iv)或(V)检测的荧光，形成所述靶标组织的光学图像。
20.权利要求19的方法，其中步骤(iii)的激发光在性质上为连续波(CW)。
21.—种体内光学成像的方法，所述方法包括(i)将权利要求14-16中任一项的光学显像剂给予活动物或人受试者；( )留出时间用于(a)探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚积，和(b)所述靶标组织中的酶通过在一个或多个如权利要求1中所定义的第二连接处的酶促裂解来激活探针，以获得激活的探针；(iii)让具有非均一组成的所述受试者的光散射生物组织以预定的随强度变化的时间暴露于来自光源的激发光，以激发所述显像剂，所述组织多重散射所述激发光；(iv)检测因响应所述曝光而从所述组织多重散射的光发射；(ν)通过用处理器建立多个值来定量测定由发射产生的整个组织的荧光特性，所述值各自对应于所述组织内不同位置的荧光特性水平，所述荧光特性水平随所述组织的非均一组成而变化；和(vi)通过根据步骤(ν)的值绘制所述组织的非均一组成图谱来产生所述组织的图像。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中将所述体内光学成像用于帮助哺乳动物体的疾病进展的检测、分期、诊断、监测，或疾病状态的治疗的监测。
23.一种检测、分期、诊断、监测哺乳动物体的疾病进展或者监测哺乳动物体疾病状态的治疗的方法，所述方法包括权利要求19-21中任一项的体内光学成像方法。
全文摘要
本发明涉及通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。将所述探针设计为使得在未被激活探针中发生分子内猝灭，但猝灭剂部分在限定条件下从所述探针裂解，这使探针发出荧光。本发明亦公开适于体内成像的包含所述探针的光学显像剂以及药物组合物和试剂盒以及体内成像方法。
文档编号C12Q1/34GK102325551SQ200980157309
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者H·托勒斯豪格 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司