专利名称：脂质酰基转移酶蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及工程加工和产生变体酶的方法。本发明还涉及新型变体酶和这些新型变体酶的应用。
背景技术：
月旨质:胆固醇酉先基转移酶已经为人所知一段时间(參见,例如Buckley-Biochemistry1983，22，5490-5493)。特别地，已经发现，与植物和/或哺乳动物的卵磷脂胆固醇酰基转移酶((LCAT)类似，甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)可催化磷脂酰胆碱和胆固醇之间的脂肪酸转移。Upton 和 Buckley (TIBS 20, May 1995，pl78_179)以及 Brumlik 和 Buckley (J. ofBacteriology Apr. 1996，p2060_2064)教导了能够在含水媒介中进行至醇受体的酰基转移的来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的脂肪酶/酰基转移酶。对于这个酶，已经鉴定了嗜水气单胞菌酰基转移酶的推定底物结合域和活性位点(參见，例如 Thornton et all988 Biochem. et Biophys. Acta. %9，I53-I59 和 Hilton &Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266，997-1000)。Buckley 等(J. Bacteriol 1996，178 (7) 2060-4)教导，Serl6、Asp 116 和 His291
是保持酶活性所必须保留的重要氨基酸。Robertson 等(J. Biol. Chem. 1994，269，2146-50)教导了嗜水气单胞菌的酰基转移酶的ー些具体突变，即Y226F、Y230F、Y30F、F13S、S18G和S18V，均没有包含在本发明中。WO 2005/066347涉及变体脂质酰基转移酶及其制备方法。这些变体酶均没有包含在本发明中。具有改善(增强)活性的变体脂质酰基转移酶的开发一直存在困难，尤其对于在一些应用中具有高特异活性的变体脂质酰基转移酶的发现更是如此。
发明内容
本发明是基于发明人发现的用于修饰的感兴趣特定位点的预期。发明人首次建立了脂质酰基转移酶模型并且利用所述酶的三级结构鉴定了用于修饰的具体区域。此外，发明人还制备并测试了根据其以上发现而修饰的酶，并确定了用于多个应用中的有利的变体脂质酰基转移酶。本发明的各方面体现在权利要求书和以下说明内容中。本发明ー个方面提供了用于制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少ー个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中定位于以下的氨基酸a)所述酶的峡谷区(即优选氨基酸残基31、27、85、86、119和120);和/或b)插入位点I和/或c)插入位点2，其中所述峡谷区、插入位点I和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6或16所示的酶的峡谷区、插入位点I或插入位点2的区域。在一个实施方式中，优选位置位于峡谷和/或插入位点I和/或插入位点2中的修饰与位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于峡谷和/或插入位点I和/或插入位点2之外的氨基酸的至少ー个修饰组合。本发明另一方面提供了用于制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少ー个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于以下位置的氨基酸:27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236 (优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明的另一方面提供了制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27和/或31位的氨基酸并与至少ー个进ー步的修饰组合，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置本发明另ー个方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架，从而在对应于所编码的氨基酸序列中以下氨基酸的位置形成至少ー个修饰(合适地为两个修饰)a)所述酶的峡谷区和/或b)插入位点I和/或c)插入位点2，其中所述酶的峡谷区、插入位点I和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，分别对应于本文SEQ ID No. 6或16所示的酶的峡谷区、插入位点I或插入位点2的区域。在一个实施方式中，优选位置位于峡谷和/或插入位点I和/或插入位点2中的修饰与位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于峡谷区和/或插入位点I和/或插入位点 2之外的氨基酸的至少ー个修饰组合。本发明另一方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架从而形成至少ー个修饰(合适地为至少两个修饰)，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)的氨基酸，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ IDNo. 6所示酶的相同位置的位置。本发明另一方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架，从而形成至少ー个修饰(合适地为至少两个修饰)，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31位的氨基酸并组合至少ー个进ー步的修饰，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ IDNo. 6所示酶的相同位置的位置。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130 位，其中所述位置编号被定义
为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明还涉及ー种方法，其包括改变紧邻于亲本酶(例如亲本脂质酰基转移酶)的催化三联体(优选催化三联体的Asp残基)的N-末端的底物链长特异性决定片段的长度，从而产生相对于所述亲本酶具有改变的底物特异性的改变的脂质酰基转移酶，其中所述亲本酶具有与本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌(A. salmonicida)的脂质酰基转移酶至少70%相同的氨基酸序列。优选地，所述改变包括在所述底物链长特异性决定片段中进行氨基酸插入或缺失，例如由不同脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段取代所述亲本酶的所述底物链长特异性决定片段，从而产生所述改变的脂质酰基转移酶。优选地，所述改变増加了可被所述脂质酰基转移酶转移的酰基链的长度。在一个实施方式中，优选所述方法包括测试所述改变的脂质酰基转移酶的改变的底物特异性。合适地，所述测试可以包括评价所述改变的或变体脂质酰基转移酶在含水环境下将酰基从底物转移至受体分子的能力。在一个实施方式中，所述测试包括评价所述变体脂质酰基转移酶和所述亲本酶转移不同长度的酰基链的能力。本发明还提供了改变的或变体脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少70%同一性的氨基酸序列，其中相对于本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶，紧邻于所述改变的脂质酰基转移酶的催化三联体的Asp残基的N-末端的底物链长特异性决定片段具有改变的长度。优选地，所述改变的脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。在另ー个方面，本发明提供了通过本发明的方法获得的(变体)脂质酰基转移酶多肽。在再一方面，本发明提供了包含编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列的核酸(优选分离的或重组的核酸)或载体，并且所述核苷酸序列在对应于所编码的氨基酸序列中ー个或多个以下位置的位置包含至少ー个修饰:27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236 (优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明的再一方面提供了包含编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列的核酸(优选分离的或重组的核酸)或载体，并且所述核苷酸序列在对应于所编码的氨基酸序列中ー个或多个以下位置的位置包含至少ー个修饰27和/或31，并组合至少ー个进ー步的修饰，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130 位，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。优选地，所述核苷酸序列编码本发明的脂质酰基转移酶并且在修饰前为本文SEQID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14 或SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列；或者为与 SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通过遗传密码子的简并性而与SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ IDNo. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15相关联的核苷酸序列；或者在中等严谨条件下或高严谨条件下与本文SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明在ー个方面提供了分离或重组的核酸，其编码具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No. 6或16的成熟区具有至少94%(优选至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少ー个修饰(优选至少两个修饰)第 27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或 236 位(优选第 27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明在ー个方面提供了分离或重组的核酸，其编码具有脂质酰基转移酶活性并包含与SEQ ID No. 6或16的成熟区具有至少94%(优选至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在对应于所编码核酸序列中第27和/或31位氨基酸的位置包含至少ー个修饰(优选至少两个修饰)，并且组合至少ー个进ー步的修饰，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。一方面提供了包含编码具有脂质酰基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸 (优选分离的或重组的核酸)或载体，其中所述核苷酸序列在中等或高严谨条件下与SEQID No. 10或SEQ ID No. 25或者SEQ ID No. 10或SEQ ID No. 25的互补序列的基本全长上杂交，其中所编码的多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸残基第31位的Q、H、N、T、F、Y或 C ;第 86 位的 R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L ;第 27 位的 R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F;H、R、D、E 85 ;第 119位的T或 I ;第 120 位的 K 或E ;第 122 位的 S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C ;第201位的R ;第245位的S ;第235位的A或V ;第232位的G或S ;第236位的G或E，其中所述位置是与SEQ ID No. 6相当的氨基酸位置。本发明在再一方面提供了由本发明的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。本发明一方面提供了在芽孢杆菌表达宿主，尤其是在地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)表达宿主中表达时，由本发明的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。
本发明另一方面提供了产生多肽的方法，所述方法包括向宿主细胞(优选芽孢杆菌表达宿主，尤其是地衣芽孢杆菌表达宿主)中引入所述核酸或载体，其中所述核酸或载体包含编码所述多肽的所述核苷酸序列，所述核苷酸序列与能够引导由所述核酸编码的多肽表达的调控序列可操作地连接；在所述调控序列引导所述核酸或载体编码的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞。本发明一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90% (优选至少95%，更优选至少98%，更优选至少99%)同一性的氨基酸序列并且在ー个或多个以下位置包含一个或多个修饰27、31、
85、86、122、119、120、201、245、232、235 和/或 236(优选第 27、31、85、86、119 和/或 120位，更优选第27和/或31位)。本发明另一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列，但在ー个或多个以下位置具有一个或多个修饰27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选第 27、31、85、86、119 和/或 120位，更优选第27和/或31位)。本发明一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90% (优选至少95%，更优选至少98%，更优选至少99%)同一性的氨基酸序列并且在第27和/或31位包含ー个或多个修饰且与至少ー个进一歩的修饰组合，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为
在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明另一方面提供了ー种的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列，但在第27和/或31位的ー个或多个位置具有ー个或多个修饰且与至少ー个进ー步的修饰组合。合适地，所述至少ー个进一歩的修饰可位于ー个或多个以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207和/或 130，其中所述位置编号被定
义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本发明的多肽可以是前肽(pro-p印tide)，其经历进一歩的翻译后修饰成为成熟肽，即具有脂质酰基转移酶活性的多肽。仅作为示例，SEQ ID No. 16与SEQ ID No. 6相同，但SEQ ID No. 16经历翻译后和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更具体地为38个氨基酸。因此，本文SEQ ID No. 6所示的多肽在ー些情况下(即在ー些宿主细胞中)可以被认为是前肽，其通过翻译后和/或转录后修饰而被进ー步加工成成熟肽。对于翻译后和/或转录后修饰，精确的修饰，例如切割位点，可根据宿主种类而略有变化。在ー些宿主物种中，可能没有翻译后和/或转录后修饰，这样，前肽可等同于成熟肽(即具有脂质酰基转移酶活性的多肽)。不期望受理论约束，与通过SEQ ID No. 6与SEQ ID No. 16比较的參照所示的切割位点相比，所述切割位点可以在任一方向移动数个残基(例如1、2或3个残基)。换而言之，例如不是在第235位-ATR至第273位(RRSAS)切割，而可以在例如残基232、233、234、235、236、237或238处开始切割。此外或可选择地，可以在残基270、271、272、273、274、275或276处终止切割。此外或可选择地，切割可导致去除大约38个氨基酸，在一些实施方式中切割可导致去除30-45个之间的残基，例如34-42个残基，例如36-40个残基，优选38个残基。本发明进一歩提供了制备食品的方法，其包括向所述食品的ー个或多个成分中添加本发明的多肽。本发明另ー方面提供了制备烘焙产品的方法，所述方法包括向生面团中添加本发明的多肽，并烘焙生面团以制备烘焙产品。本发明另一方面提供了本发明的或可通过本发明的方法获得(优选已经获得)的变体脂质酰基转移酶在处理蛋或基于蛋的产品以产生溶血磷脂的方法中的应用。本发明进一歩提供了制备溶血磷脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理磷脂以产生溶血磷脂。在再ー实施方式中，本发明提供了制备溶血糖脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理糖脂以产生溶血糖脂。本发明进一歩提供了植物油或食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用本发明的多肽处理所述食用油或植物油，从而水解其中存在的大部分极性脂质。本发明另ー方面提供了本发明的的或可通过本发明的方法获得(优选已经获得)的变体脂质酰基转移酶在降低食用油中的磷脂含量的方法中的应用，所述方法包括用所述变体脂肪分解酶处理所述油，从而水解大部分的所述磷脂，并将含水解磷脂的水相与油相分开。本发明另一方面提供了由本发明的方法获得的食品或烘焙产品。本发明另一方面提供了包含本发明的变体脂质酰基转移酶的清洁组合物或去污组合物。本发明再一方面提供了包含本发明的变体脂质酰基转移酶的面包和/或生面团改良组合物。涉及可用于本发明的核苷酸序列的其他方面包括包含本发明的序列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明的序列的质粒；包含用于本发明的序列的转化细胞；包含用于本发明的序列的转化组织；包含用于本发明的序列的转化器官；包含用于本发明的序列的转化宿主；包含本用于发明的序列的转化生物。本发明还涵盖利用以上来表达用于本发明的核苷酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移方法。本发明进ー步涵盖分离所述核苷酸序列的方法，例如从宿主细胞分离苷酸序列的方法。涉及可用于本发明的氨基酸序列的其它方面包括编码用于本发明的氨基酸序列、的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化生物。本发明还涵盖利用以上来纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移，然后纯化所述序列的方法。发明的详细内容除非另有说明，否则所有氨基酸位置编号均涉及当基于初级和/或三级结构(优选初级结构)比对时，本文SEQ ID No. 6所示的酶的相应位置。然而，在一些实施方式中，本文使用的氨基酸位置编号可以涉及当基于本文SEQ ID No. 16所示酶的三级结构比对时的相应位置。在分析脂质酰基转移酶的3-D结构(三级结构)时，可确定酶中适合产生具有改良性质的工程化脂质酰基转移酶的修饰位点。 本发明提供了鉴定脂质酰基转移酶中适合修饰的区域的工具。在一些优选的实施方式中，所述修饰导致改良的性质，其可包括a)改变脂质酰基转移酶的底物特异性，例如并且仅作为示例i)改变酶使用某些化合物作为受体的能力，例如提高酶利用碳水化合物(例如麦芽糖)作为受体分子的能力，由此改善酶产生碳水化合物酷的能力；或ii)改变酶利用饱和或不饱和的脂肪酸作为底物的能力；或iii)改变酶的特异性，从而使其优先利用来自脂质的Snl或Sn2位的脂肪酸；或iv)改变酶的底物链长特异性；b)改变酶的动力学；和/或c)降低酶进行水解反应的能力同时保持或增强酶进行酰基转移反应的能力。所述脂质酰基转移酶的三级结构掲示了不寻常且有趣的结构，该结构可使脂质酰基转移酶得到更有效的工程化加工。特别地，所述脂质酰基转移酶的三级结构已经掲示了穴(cave)和峡谷(canyon)结构。穴区中的改变可以(例如)改变如酶的底物链长特异性。现已发现峡谷中的改变(特别是ー些优选的关键修饰)对于例如增强或改变酶的底物特异性具有重要性。特别地,发明人已经发现,在峡谷中具有多个修饰,其等级高(rank highly)且产生具有改良性质的感兴趣变体，这些修饰可见于第31、27、85、86、119和120位。在ー些实施方式中，高度优选第31和/或27位。因此，在本发明的广义概念中，涉及在穴和/或峡谷区(优选峡谷区)内修饰脂质酰基转移酶，由此产生具有改变的活性/性质的经修饰的酶。在一些实施方式中，优选具有在峡谷区内的至少ー个修饰和峡谷区内或外的其他位置的至少ー个修饰的组合。在一些实施方式中，优选所述改变不在穴区内。在一个广义的方面，本发明可提供修饰脂质酰基转移酶(或者通过修饰核苷酸序列或者通过修饰氨基酸序列)，由此在以下残基产生ー个或多个修饰的方法27、31、85、
86、122、119、120、201、245、232、235、236，以及具有所述修饰的核酸和脂质酰基转移酶。在另ー个广义的方面，本发明可提供用于修饰脂质酰基转移酶(或者通过修饰核苷酸序列或者通过修饰氨基酸序列)，由此在以下残基产生ー个或多个修饰的方法27、
31、85、86、122、119、120、201、245，在ー些情况下，所述ー个或多个修饰可以与ー个或多个以下残基中的一个或多个进ー步的修饰组合23、81、82、289、227、229、233、33、207或130。本发明还提供了具有这些修饰的核酸和脂质酰基转移酶。与亲本酶相比，所述变体酶必须包含至少ー个氨基酸修饰。在一些实施方式中，与亲本酶相比，所述变体酶可包含至少2个，优选至少3个，优选至少4个氨基酸修饰。在本发明的一些实施方式中，编码本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的DNA序列经过修饰。合适地，本发明的方法可包括将变体酶配制成酶组合物和/或食品组合物，例如面包改良组合物的额外步骤。本发明进一歩提供了包含本发明所述的变体脂质酰基转移酶的面包改良组合物。优选地，产生变体脂质酰基转移酶的方法进ー步包括ー个或多个以下步骤I)结构同源性制图，或
2)序列同源性比对。如果脂质酰基转移酶的氨基酸残基同源于(即在初级和/或三级结构中具有相应的位置)或者类似于SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶中的特异残基或该残基部分(即具有组合、反应和/或化学相互作用的相同或类似功能性作用)，则脂质酰基转移酶的氨基酸残基可等同于(equivalent to)本文SEQ ID No. 16或6所示的脂质酰基转移酶的残基。在一些实施方式中，为了建立与初级结构的同源性，将脂质酰基转移酶的氨基酸序列与本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的初级序列，尤其是在序列已知的所有或多数脂质酰基转移酶中已知不变的残基组进行直接比较。在比对保守残基，允许必要的插入和删除以保持对齐(即避免通过任意删除和插入而消除保守残基)后，限定出了与SEQ ID No. 6或16的初级序列中的特定氨基酸等同的残基。在优选的实施方式中，保守残基的比对保留100%的此类残基。然而，保守残基的大于75%或低至50%的比对也足以限定出等同的残基。在优选的实施方式中，保持催化性丝氨酸和组氨酸残基的保守性。使用保守残基来限定其他脂质酰基转移酶中，例如在来自其他气单胞菌(Aeromonas)种以及任意其他生物的脂质酰基转移酶中与SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶相应的等同氨基酸残基。为了将亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 16 (參照序列)比对，可以イ吏用序列比ヌ寸，例如 ヌ寸比ヌ寸(http://www. ebi. ac. uk/emboss/a IiRn/index, html)。由此，可以确定并修饰在可选的亲本脂质酰基转移酶多肽中与參照SEQ ID No. 16或SEQ IDNo. 6所限定的一个或多个氨基酸对应的等同氨基酸。本领域技术人员易于理解，当使用emboss逐对比对时，标准设置通常足矣。可以利用“针(needle)”鉴定相应残基，以进行覆盖两个序列的全长的比对。然而，也可利用“水(water)”发现两个序列间相似性最佳的区域。可选择地，尤其例如，在亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 16的初级结构同源性低的情况下，可通过与SEQ ID No. 16或SEQ ID No. 6，优选与SEQ ID No. 16的结构模型的结构比对，确定可选亲本脂质酰基转移酶中与參照SEQ ID No. 6或SEQ IDNo. 16所限定的一个或多个氨基酸对应的相应氨基酸。因此，可通过在三级结构水平上确定与已经通过X-射线结晶学确定三级结构的脂质酰基转移酶的同源性，来定义等同的残基。在这种情况下，“等同残基”被定义为在比对后，与本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N对N、CA对CA、C对C、和O对0)在0. 13nm以内，且优选在0. Inm以内的那些残基。在定向并定位最佳模型后实现比对，从而产生所述脂质酰基转移酶的非氢蛋白原子的原子坐标与本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的最大重叠。如本领域已知的，最佳模型是在可得的最高分辨率下产生用于实验衍射数据的最低R因子的晶体学模型。将在功能和/或结构上类似于本文SEQ ID No. 6或16所示脂质酰基转移酶的具体残基的等同残基定义为，脂质酰基转移酶的的那些氨基酸，其优先采用使得其改变、修饰或者调节蛋白结构的构象，从而以限于并归结于本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的具体残基的方式导致底物属性，例如底物结合和/或催化作用的变化。此外，它们是脂质酰基转移酶的那些残基(在已通过X-射线结晶学获得三级结构的情况下)其占据类似位置的程度使得尽管给定残基的主链原子不满足基于占据同源位置的等同标准，但所述残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于本文SEQ ID No. 6或16所示的脂质酰基转移酶的相应侧链原子的0. 13nm以内。确定了本文SEQ ID No. 16所示的脂质酰基转移酶(其是包含N80D突变的杀鲑气 单胞菌脂质酰基转移酶)的三维结构的坐标，并将其示于下表中并应用于在三级结构水平上确定等同的残基。结晶利用悬滴扩散法获得酶的晶体，具体地，将液滴(5iU蛋白溶液(mg/ml in)与 5 u I 储备溶液(reservoir solution) : I. 4M 憐酸铵、0. IOM 憐酸钾、44mM 氯化钠、94mM氯化铵、2mM硫酸镁、2mM氯化钙，混合)放置在塑料盖玻片上并翻转到6x4Linbro平板的含Iml储备溶液的孔上，并使其在持续数天至2周长的时间内达到平衡。通过将预先生长的晶体浸入含IOmM(NH4)2PtCl4的储备溶液中，获得(NH4)2PtCl4的晶体。X-射线数据收集在斯坦福同步加速器辐射实验室(SSRL，Menlo Park, USA)，在Beamline 11. I上对应于钼MAD实验的拐点(入I)、低能远端(low energy remote,入2)和峰(X3)的波长，收集(NH4)2PtCl4M生物的多波长反常衍射数据。之后，以1.5 A的分辨率收集数据集ひ0)。利用Quantum 315CXD在100K收集所述数据集。利用Mosflm(Leslie, A. G. ff. (1999)Acta Crystallogr. , D55, 1696-1702)整合数据，并利用来自CCP4 套装(Collaborate computer project, Number 4 (1994) The CCP4 suite:programsfor protein crystallography. Acta Chrystallogr. , D50, 760-763)的 SCALA 程序绘图。数据统计概括在表A中。X-射线数据收集在斯坦福同步加速器辐射实验室(SSRL，Menlo Park, USA)，在Beamline 11. I上对应于钼SAD实验的峰(入I)的波长，收集(NH4)2PtCl4衍生物的多波长反常衍射数据。之后，以し5 A的分辨率收集数据集(入0)。利用Quantum 315CXD在100K收集所述数据集。利用MoSflm[如上文]整合数据，并利用来自CCP4套装[如上文]的SCALA程序绘图。数据统计概括在下表(模型部分-mod)中。结构解析和修正利用使用CCP4套装的2.8 A钼SAD数据ひ3或A1)和 S0LVE/RES0LVE 程序(Terwi 11 iger, T. C. and Berendzen, J. (1999) ActaCrystallogr.，D55, 849-861)确定初始结构。利用 O1。和 COOT (Jones, T. A.，et al. (1991)Acta Crystallogr. , A47, 110-119)进行模型构建。然后利用使用 REFMAC(Collaboratecomputer project, Number 4(1994)The CCP4 suite: programs for proteincrystallography. Acta Chrystallogr. , D50, 760-763)的1,5 A数据集(入 0)对追踪模型(traced model)进行修正。修正的统计数据概括在下表中。最終的模型包括不对称单元中的蛋白ニ聚体和1198个水分子。在所有分子中均没有观察到第一蛋氨酸残基的电子密度。PR0CHECK11 (Laskowski, G. N. et al. (1993) J. Appl. Chrystallogr. , 26, 91-07)表明，所有单体中 94% 的残基都位于 Ramachandran 图(Ramachandran, G. N. et al. (1968) Advan.Protein Chem. , 23, 283-437)的核心区，在不允许区或勉强许可区中没有残基。所有图像图均由PyMOL(Warren L. DeLano “The PyMOL Molecular GraphicsSystem. ” DeLano Scientific, Belmont, CA, USA, http: //www. pymol. org)绘制。表A :本文SEQ ID No. 16所示的脂质酰基转移酶(在本文中也称为具有N80D突变且经翻译后修饰(切割)的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶)的晶体參数、数据收集和修正统计数据的概述
权利要求
1.制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性且包含至少ー个修饰的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235和/或236位的氨基酸，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
2.如权利要求I所述的方法，其中，至少ー个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自ー个或多个以下位置27、31、85、86、119和/或120。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述峡谷区中的至少ー个修饰与所述峡谷区之外的进ー步的修饰组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述脂质酰基转移酶可进一歩包括位于ー个或多个以下位置的至少ー个进ー步的修饰23、81、82、289、229、227、233、33、207和 /或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述至少ー个修饰选自以下组成的组L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (优选 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (优选 M27V)；V85H、R、D_E;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C_LHtit I86S 或 A) ;A119T 或 I ;Y120K 或 E ;W122S、L 或 A (优选 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或 E。
6.ー种方法，其包括改变底物链长特异性决定片段的长度，从而产生相对于亲本酶具有改变的底物特异性的变体脂质酰基转移酶，其中，所述底物链长特异性决定片段紧邻于所述亲本酶的催化三联体(优选所述催化三联体的Asp残基)的N-末端，所述亲本酶与本文SEQ ID No. 6或16所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少70%的同一性。
7.—种(变体)脂质酰基转移酶多肽，其由前述任一项权利要求的方法获得。
8.编码脂质酰基转移酶的核酸，其核苷酸序列包含位置对应于所编码的氨基酸序列中ー个或多个以下位置的至少ー个修饰第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235、236位，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
9.如权利要求8所述的核酸，其中，所述核酸编码具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No. 6或16的成熟区具有至少94%氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少ー个修饰第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
10.编码具有脂质酰基转移酶活性的多肽的核酸，其中，所述核苷酸序列在中等或高严谨条件下与 SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 25，或者 SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 25 的互补序列在基本全长上杂交，其中所编码的多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸残基第31位的 Q、H、N、T、F、Y 或 C ;第 86 位的 R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L ;第 27 位的 R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或F ;H、R、D、E 85 ;第 119 位的 T 或 I ;第 120 位的 K 或E ;第 122 位的S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C ;第201位的R ;第245位的S ;第235位的A或V ;第232位的G或S ;第236位的G或E，其中所述位置是与SEQ ID No. 6相当的氨基酸位置。
11.如权利要求8或9所述的核酸，其中，所述至少一个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自ー个或多个以下位置27、31、85、86、119和120。
12.如权利要求11所述的核酸，其中，所述峡谷区中的至少ー个修饰与所述峡谷区之外的进ー步的修饰组合。
13.如权利要求8-12中任一项所述的核酸，其中，所述核酸在对应于所编码的氨基酸序列中ー个或多个以下位置的位置包括至少ー个进ー步的修饰23、81、82、289、229、227、.233、33、207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
14.如权利要求8-13中任一项所述的核酸，其中，所述至少ー个修饰选自以下组成的组L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (优选 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (优选M27V) ;V85H、R、D 或 E ;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L (优选 I86S 或 A) ;A119T 或 I ；Y120K或 E ;W122S、L 或 A (优选 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或 E。
15.如权利要求8-14中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列编码所述脂质酰基转移酶并且在修饰之前为本文SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或者为与本文SEQ IDNo. 25,SEQ ID No. 10,SEQ IDNo. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14或SEQ IDNo. 15所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通过遗传密码子的简并性而与SEQ ID No. 25,SEQID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15 相关联的核苷酸序列；或者在中等严谨条件下或高严谨条件下与本文SEQ ID No. 25、SEQ IDNo. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
16.变体脂质酰基转移酶多肽，其由权利要求8-15中任一项所述的核酸或核苷酸序列编码。
17.当在芽孢杆菌(Bacillus)表达宿主中，尤其在地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)表达宿主中表达时，由权利要求8-15中任一项所述的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。
18.产生多肽的方法，所述方法包括向宿主细胞(优选芽孢杆菌表达宿主，尤其优选地衣芽孢杆菌表达宿主)中引入权利要求8-15中任一项所述的核酸，其中编码所述多肽的所述核酸与能够引导由所述核酸编码的多肽的表达的调控序列可操作地连接；在所述调控序列引导所述核酸或载体编码的多肽的表达的条件下培养所述宿主细胞。
19.多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90%(优选至少95%，更优选至少98%)同一性的氨基酸序列，并且在一个或多个以下位置包含一个或多个修饰:27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、.232,235 和/或 236。
20.如权利要求19所述的多肽，其中，所述至少一个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自以下组成的组27、31、85、86、119和120。
21.如权利要求19或权利要求20所述的多肽，其中，所述峡谷区的至少ー个修饰与所述峡谷区之外的进ー步的修饰组合。
22.如权利要求19-21中任一项所述的多肽，其中，所述脂质酰基转移酶可进一歩包括至少ー个进ー步的修饰，所述修饰位于ー个或多个以下位置23、81、82、289、229、227、233、.33,207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
23.如权利要求19-22中任一项所述的多肽，其中，所述至少ー个修饰选自以下组成的组L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (优选 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (优选M27V) ;V85H、R、D 或 E ;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L(优选 I86S 或 A) ；A119T 或 I ；Y120K或 E ;W122S、L 或 A (优选 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或E0
24.如权利要求19-23中任一项所述的多肽，其具有脂质酰基转移 酶活性，并且除所述一个或多个修饰之外，包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列。
25.变体脂质酰基转移酶多肽，其包含与本文SEQID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶至少70%相同的氨基酸序列，其中相对于本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的所述脂质酰基转移酶，紧邻于所述改变的脂质酰基转移酶的催化三联体的Asp残基的N-末端的底物链长特异性决定片段具有改变的长度。
26.如权利要求25所述的变体脂质酰基转移酶，其中，所述改变的脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No. 6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。
27.制备食品的方法，所述方法包括向所述食品的ー个或多个成分中添加权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的多肽。
28.制备烘焙产品的方法，所述方法包括向生面团中添加权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的多肽，和烘焙所述生面团以制备所述烘焙产品。
29.权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的变体脂质酰基转移酶在处理蛋或基于蛋的产品以产生溶血磷脂的方法中的应用。
30.植物油或食用油的酶促脱胶方法，其包括用权利要求7、16-17或19-26中任ー项所述的多肽处理所述植物油或食用油，从而水解其中存在的大部分极性脂质。
31.由权利要求27或权利要求28所述的方法获得的食品或烘焙产品。
32.參考附图
和实施例的如本文整体描述的方法。
33.參考附图和实施例的如本文整体描述的核酸。
34.參考附图和实施例的如本文整体描述的变体脂质酰基转移酶多肽。
35.參考附图和实施例的如本文整体描述的变体脂质酰基转移酶多肽的应用。
全文摘要
本发明一方面提供了制备脂质酰基转移酶变体的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于以下的氨基酸a)所述酶的峡谷区(即优选氨基酸残基31、27、85、86、119和120)；和/或b)插入位点1(即氨基酸残基22-36)和/或c)插入位点2(即氨基酸残基74-88)，其中所述峡谷区、插入位点1和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本发明SEQ ID No.16或6所示的酶的峡谷区、插入位点1或插入位点2(或以上教导的相应氨基酸残基)的区域。优选的修饰为以下一个或多个L3IQ,H,N,T,F,Y或C(优选L31Q)；M27R,G，H,K,Y，D,N,V，C,Q,L,E,S或F(优选M27V)；V85H,R5D或E；I86R,Y，S,V，I,As,T,M,F,C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S,L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
文档编号C12N15/75GK102656264SQ200980162945
公开日2012年9月5日 申请日期2009年10月15日 优先权日2009年10月15日
发明者C·R·索达尔, 乔恩·D·米克凯尔森, 伯吉特·Φ·维特席本, 夏洛特·约翰森·韦泽尔, 夏洛特·霍斯曼斯·波尔森, 延斯·弗里斯贝克·瑟伦森, 洛宁·B·米勒, 玛格丽特·A·切尔温, 理查德·R·博特, 约恩·博尔奇·瑟, 莫藤·K·拉尔森, 莱恩·B·詹森, 詹妮·布伦斯特德, 赖克·H·洛伦岑 申请人:丹尼斯科公司