专利名称：一种酿酒酵母菌株及其选育方法以及该菌在酒精生产上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能快速生长且适于高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌株及其 选育方法，以及利用该菌高温浓醪发酵淀粉生产燃料乙醇的方法，属工业微生物发酵工程 技术领域。
背景技术：
世界石油资源日趋枯竭，大力发展、使用燃料酒精，是国家一项新能源战略。木薯 燃料酒精的研究和成功产业化，具有很大的战略意义和社会效益。目前木薯原料生产燃料 乙醇大部分采用间歇式稀醪发酵，存在技术水平低，发酵效率低，能耗大，环境负荷大及经 济性有待进一步提高等问题。美国企业浓醪发酵酒精浓度普遍可达15% (ν/ν)以上，而国 内浓醪发酵酒精浓度仅为11%-12% (ν/ν) 0经实际测算，每提高的发酵醪酒分(玉米 为原料)，吨酒精收益约为30-40元，酒精生产企业中酒精含量每提高1 %，能耗下降3%，整 体经济效益提高3%。作为能源使用的燃料乙醇寻求环保、低成本的酒精发酵技术，浓醪发 酵技术是发展发酵燃料乙醇工业的有效途径之一。浓醪发酵可以提高设备利用率，可节能 省水，缩短发酵周期。目前，制约木薯原料浓醪发酵的主要瓶颈是发酵菌种和酶制剂。在浓 醪发酵中，由于可发酵性糖含量高，普通酿酒酵母菌在浓醪液中生长繁殖和发酵受到抑制， 且对温度敏感，高温耐受范围小，发酵最适温度通常为28 33°C，一般不超过36°C，而糖化 酶的最适温度为60°C。若提高发酵温度，酶活力上升，单位时间内可发酵性糖的转化率提 高，发酵周期会有所缩短，同时发酵温度的提高可减少冷却水的用量。在酒精生产过程中， 酒精含量对酵母菌的生长影响很大，普通酵母在乙醇浓度达11%左右时，发酵完全受到抑 制，所以在浓醪发酵时，有必要选用酒精耐性高的酵母菌。综上所述，耐高温、耐酒精和耐高 糖的酵母菌，可以更好地适合浓醪酒精发酵的要求，能够为酒精发酵工业带来显著的经济 效益。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种能快速生长且适于高温浓醪发酵 生产酒精的酿酒酵母菌株及其选育方法，以及利用该菌高温浓醪发酵淀粉生产燃料乙醇的 方法。本发明技术方案如下一种能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌，经中国科学院微生物研究所鉴定，其分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为Y09tj，已于 2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCCN0. 3476。所述酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476可在麦芽汁和含葡萄糖或麦芽糖或棉子糖的YPD培养基上生长，YPD培养基成分含蛋白胨20g/L、酵母粉5g/L和糖20g/L，乳白色，表面平滑， 边缘整齐，适宜生长温度为28 V -40°C，最适生长温度37°C，葡萄糖最高耐受浓度为62% (w/v)，且生长快速，且有很好的抗乙醇毒性，适于浓醪发酵生产酒精。所述酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476的选育方法，其特征是从常见的农家自酿甜酒中 分离并经紫外诱变筛选得到，方法如下(1)培养基YPD液体培养基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自来水定容至IOOOml ；YPD固体培养基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，自来水定容至 IOOOml ；种子培养基同前述YPD液体培养基；上述培养基经高温121°C灭菌20min ；发酵培养基30%-40%的淀粉，加自来水定容至100ml，加入量为llu/g淀粉的耐 高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅95°C液化2h，冷却至61°C，加入量为57u/g淀粉的糖化酶， 在61°C水浴锅糖化45min，再添加尿素0. Ig ；(2)出发菌株分离筛选菌种初筛取5g甜酒样品加入装有IOOml无菌生理盐水的小三角瓶中，置37°C摇 床振荡培养2h，静置5min，取上清液做浓度梯度稀释至10_6倍，取200 μ 1稀释液涂布于YPD 平板，37°C倒置培养2d，挑取较大的酵母单菌落转接于IOml含10%葡萄糖的YPD液体培养 基，置37°C，160r/min摇床培养，观察产泡沫的速度和量，闻发酵液中酒精浓度，初步筛选 产酒精快而多的菌株，经YPD平板分离划线法得到纯种，取一环活化好的菌种接于5ml液体 YPD培养基，370C，160r/min摇床培养16h得初筛菌种种子液；菌种复筛30g的淀粉按1 2.2(w/v)的料水比调好淀粉浆液，加入量为llu/g淀 粉的耐高温α “淀粉酶，在水浴锅95°C液化2h，冷却至61°C，加入量为57u/g淀粉的糖化 酶，在61°C水浴锅糖化45min，淀粉糊液冷却至37°C，加入终浓度为0. 1 %的尿素，分别接入 初筛菌种种子液，接种量为5%，置37°C，160r/min摇床发酵3d，定时取样测酒度和残糖，选 出生长发酵速度快，产酒率高，残总糖和残还原糖低的菌株，以此菌株作为出发菌株；(3)紫外线诱变育种酵母菌原生质体制备从活化好的菌种斜面上分别取一环接种于IOOml液体培养 基上，于30°C，200r/min摇床培养12 16h，收集对数生长期细胞，各取5ml加入离心管中 3500r/min，离心5min，用0. lmol/L，pH6. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗2次，30°C静置lOmin， 离心弃去上清液，加入含有纤维素酶和蜗牛酶的PB破壁溶液，于30°C水浴处理处理30min， 2000r/min，离心lOmin，用含0. lmol/L磷酸缓冲液、0. 7mol/L KCl、pH6. 0的高渗PB缓冲液 洗涤2次，离心收集原生质体；酵母菌原生质体诱变取IOml原生质体液置于带转子的9cm的平皿中，在15W紫外灯下距30cm磁力搅拌照射15-20s后，取0. 2ml涂在含5% NaCl的YPD固体培养基高渗 平板(ok)，30°C恒温避光培养3d ；平板初筛将紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分别放置在37°C、40°C进行培养， 选出生长快且菌落大的耐高温菌株，将选出的耐高温菌株的以同样的方法制备原生质体， 以同样的方法经紫外线照射，菌液涂布在含8% 15%酒精浓度的YPD平板，于37°C培养，选出生长快且菌落大的耐高温、耐高酒精菌株，再利用含0. 1% TTC的YPD固体培养基平板 筛选出产酒精能力强的突变菌株；发酵复筛利用平板初筛获得的菌株用发酵培养基进行发酵筛选，用显微镜观察 菌体的活菌数和出芽率，筛选出产酒性能最优的酵母菌Y09tj。所述酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476的性能测定方法及结果如下稳定性验证把酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476在YPD培养基，37 °C培养温度条件下传 代十次，然后进行耐温和耐酒精试验，并用发酵培养基进行发酵产酒试验，发现其生长发酵 速度快、产酒率高，其耐温和耐酒精的优良性状稳定遗传。生长曲线测定取一环活化好的菌种接于5ml液体YPD培养基，37°C，160r/min摇 床培养16h，取1ml转接到250ml新鲜液体YPD培养基，37°C，160r/min摇床培养24h，每隔 2小时取样，以未接种的液体YPD液体培养基为对照，测定不同培养时间下，菌悬液用分光 光度计于可见光600nm测定光吸收值0D_，根据光吸收值和时间绘制生长曲线图，如附图1 所示，酵母菌CGMCC NO. 3476比对照菌株生长速度快，接种5小时就可达到对数生长期，比 对照菌株提前了 4个小时。耐温测定将酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476接种入含10%的葡萄糖的YPD液体培养 基的试管中，试管内放有杜氏小试管，将试管分别放置在37°C、40°C、42°C和45°C培养箱， 次日观察试管的产气泡情况。结果发现在37°C产气情况很好，40°C产气情况为37°C的80% 以上，42°C有少量，45°C微量。耐糖测定将酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476接种入含10% -70%范围的葡萄糖的YPD 液体培养基的试管中，试管内放有杜氏小试管，放置在37°C培养箱，次日观察试管的产气泡 情况。结果发现在含葡萄糖为62%的试管内仍有气泡产生，说明其可耐高达62%的葡萄 糖。由此可见，酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476具备生长速度快，产酒率高，发酵周期短的 优势和耐高温、耐高糖和耐酒精等性能特点，适于高温浓醪发酵制取酒精。本发明还提供了利用酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476高温快速浓醪发酵淀粉生产燃料 酒精的方法，步骤如下1、种子液准备接种酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476于YPD液体培养基中，37°C摇床培养过夜，使0D_ 约为10左右，得种子液；2、浓醪液准备基于容器的容积，称取重量体积比30% 40%的淀粉置于容器中，加水搅拌均 勻，按20u/g淀粉加入液化酶，加热升温使液化温度为85-90°C，液化时间lh，使DE值为 15% -20%，得浓醪液；3、接种发酵浓醪液降温至37°C，按100u/g淀粉加入糖化酶，添加0. 1 % (m/v)的尿素，以5% 接种量接入种子液，置于37°C摇床进行同步糖化发酵，转速lOOr/m，发酵时间46h，即可得 酒精。本发明的技术优点和有益效果是1、酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476适宜生长温度范围广，一年四季均可使用，尤其保证
6夏季高温正常发酵，适合于南方的天气条件，有利于节省能耗。2、酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476性能稳定，长期冰箱甘油保藏发酵性能不降低，多批 次发酵结果都有较好的重现性。3、酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476生长快，发酵能力强，具有很高的抗乙醇毒性，并可 耐高葡萄糖浓度，最高可耐62%葡萄糖浓度，适宜浓醪发酵，利用本发明的方法平均产酒率 比其它生产菌提高1. 2%，出产酒率可高达16. 0% (v/v)，且发酵周期短，以含26. 8%总糖 的淀粉液化醪为底物发酵40h其酒度达15. 0%，一般工业用酵母菌为发酵70h其酒度仅达 14.5%。本发明发酵周期短，设备利用率可大幅提高。保藏信息说明一株能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj,目前保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期 为2009年11月24日，保藏编号为CGMCC NO. 3476。
图1是酿酒酵母菌CGMCC No. 3476和工业用菌在37°C的生长曲线。图2是酿酒酵母菌CGMCC No. 3476在500L发酵罐的发酵曲线图。
具体实施例方式实施例一三角瓶摇床试验1.高温发酵实验1. 1种子液的准备将斜面保存的酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476接种入装有 lOOmLYPD液体培养基的三角瓶中，37°C摇床培养过夜，使种子液的0D6(1(1约为10左右。1. 2工艺方案和基本条件工艺方案按照原料准备、调浆、液化、添加糖化酶、添加尿素发酵的步骤，采用液化 酶一次加入，液化温度85-90°C，液化时间lh，无糖化，降温到37°C后添加诺维信糖化酶并 接种发酵的发酵工艺。实验的基本条件如下(1)原料淀粉量33% (m/v)(2)调浆方法室温，加入自来水(3)液化震荡水浴锅加热至85-90°C，液化lh(4)淀粉酶用量22u/g原料(5)糖化酶用量105u/g原料(6)尿素用量0.1% (m/v)(7)接种量5%1. 3发酵实验将种子液接入液化醪，分别在温度为30°C、37°C、4(TC，转速100r/ min的摇床进行发酵产酒试验，发酵46h。1.4结果如表1所示，酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476在37°C时产酒量最高，在40°C 时的产酒量为最高产酒量的80%以上。
表1.酵母菌CGMCC No . 3476在不同温度下发酵的酒精含量 2.高温浓醪发酵实验2. 1种子液的准备，与1. 1相同。2. 2工艺方案和基本条件与本实施例1. 2的工艺方案和基本条件，除原料淀粉量 分别为30%、33%和40%外，其余相同。2. 3发酵实验将种子液接入30%、33%和40%的淀粉液化醪，在37°C，lOOr/min 的摇床进行发酵产酒试验，发酵46h。2. 4结果如表2所示酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476在高温浓醪条件下发酵产酒，产 酒度可达16. 28%。表2.酿酒酵母菌CGMCC No . 3476三角瓶浓醪发酵结果 3.与工业菌株的发酵对照实验3. 1种子液的准备与本实施例1. 1的相同3. 2工艺方案和基本条件本实施例1. 2相同3. 3对照发酵实验分别将对照工业菌株的种子液和酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476 的种子液接入淀粉液化醪，在37°C，lOOr/min的摇床进行发酵产酒试验，测定成熟发酵醪 的酒度、残还原糖和残糖。3. 4结果如表3所示，酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476比对照工业菌株的发酵时间缩 短了 14h，且产酒量也高一些。表3酿酒酵母菌CGMCC No. 3476与对照工业菌的发酵结果 实施例二 20L发酵罐小试1、种子液的准备将斜面保存的酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476接种入装有YPD液体 培养基的三角瓶中，37°C摇床培养过夜，使种子液的0D_约为10左右。2、工艺方案如下按照原料准备、调浆、液化、添加糖化酶、添加尿素发酵的步骤，采用液化酶1次加 入，液化温度85-90°C，液化时间lh，无糖化，降温到37°C后添加诺维信糖化酶并接种发酵 的发酵工艺。3、实验的基本条件如下(1)原料淀粉量33% (m/v)(2)调浆方法室温，加入自来水(3)液化边搅拌边加热至90 95°C，液化60min(4)淀粉酶用量22u/g原料(5)糖化酶用量105u/g原料(6)尿素用量0.1% (m/v)(7)接种量10%4、发酵实验将种子液接入液化醪，在温度为37°C，搅拌转速lOOr/min的条件下 发酵44h。5、结果酒精浓度可达到14.9% (v/v)，残还原糖0.55%，残总糖1.30%。实施例三500L发酵罐放大中试1、种子液的准备接种一环斜面保藏的菌种于装有100ml的YPD液体培养基的三 角瓶中，37°C摇床培养过夜，次日转接扩大培养，使种子液的0D_约为10左右。2、工艺方案与基本条件与实施例二相同。3、发酵将种子液接入液化醪，在温度为37°C，搅拌转速lOOr/min的条件下发酵 40h 48h，每隔4h取样测定其酒度和残糖。重复试验三批次。4、发酵结果结果如表4所示，发酵时间为40h时平均酒精浓度就可达到15.0% (v/v)，残还原糖0. 55%，残总糖1.20%。表4.酵母菌CGMCC No . 3476在500L发酵罐3批次的发酵结果
批次 酒精含量％ 发酵时间 残还原糖~~残总糖淀粉利用率 附图2是500L发酵罐的发酵曲线图，由图中看出，当发酵时间为40h，就可达到 15%左右的酒度，残还原糖下降不明显，发酵即可以结束。本发明技术方案中有关酒精含量、残还原糖及残总糖的测定方法如下1、酒精含量的测定
9
取1. 5ml发酵醪液，12，000r/min离心lOmin,取上清与10 %乙腈1 1 (v/v)混 合，气相色谱法测定酒精含量。2、还原糖、残总糖的测定还原糖测定取1ml发酵结束的醪液离心，取上清50 iU，加入450 ill蒸馏水， 375iUDNS，混勻，沸水浴5min，立即冷却，可见分光光度法测定0D54(i。空白用蒸馏水代替发 酵醪液，其他条件不变。残总糖测定先用20%盐酸10ml彻底酸解发酵醪液，再按还原糖测定法测定。
权利要求
一种能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌，其分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为Y09tj，已于2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.3476。
2.酿酒酵母菌CGMCCNO. 3476的选育方法，其特征是从常见的农家自酿甜酒中分离并 经紫外诱变筛选得到， (1)培养基YPD液体培养基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自来水定容至IOOOml ；YPD固体培养基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，自来水定容至1000ml ；种子培养基同前述YPD液体培养基；上述培养基经高温121°C灭菌20min ；发酵培养基30% -40%的淀粉，加自来水定容至100ml，加入量为llu/g淀粉的耐高 温α-淀粉酶，在震荡水浴锅95°C液化2h，冷却至61°C，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在 61°C水浴锅糖化45min，再添加尿素0. Ig ；(2)出发菌株分离筛选菌种初筛取5g甜酒样品加入装有IOOml无菌生理盐水的小三角瓶中，置37°C摇床振 荡培养2h，静置5min，取上清液做浓度梯度稀释至10_6倍，取200 μ 1稀释液涂布于YPD平 板，37°C倒置培养2d，挑取较大的酵母单菌落转接于IOml含10%葡萄糖的YPD液体培养 基，置37°C，160r/min摇床培养，观察产泡沫的速度和量，闻发酵液中酒精浓度，初步筛选 产酒精快而多的菌株，经YPD平板分离划线法得到纯种，取一环活化好的菌种接于5ml液体 YPD培养基，370C，160r/min摇床培养16h得初筛菌种种子液；菌种复筛30g的淀粉按1 2. 2(w/v)的料水比调好淀粉浆液，加入量为llu/g淀粉 的耐高温α-淀粉酶，在水浴锅95°C液化2h，冷却至61°C，加入量为57u/g淀粉的糖化酶， 在61°C水浴锅糖化45min，淀粉糊液冷却至37°C，加入终浓度为0. 的尿素，分别接入初 筛菌种种子液，接种量为5%，置37°C，160r/min摇床发酵3d，定时取样测酒度和残糖，选出 生长发酵速度快，产酒率高，残总糖和残还原糖低的菌株，以此菌株作为出发菌株；(3)紫外线诱变育种酵母菌原生质体制备从活化好的菌种斜面上分别取一环接种于IOOml液体培养基 上，于30°C，200r/min摇床培养12 16h，收集对数生长期细胞，各取5ml加入离心管中 3500r/min，离心5min，用0. lmol/L，pH6. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗2次，30°C静置lOmin， 离心弃去上清液，加入含有纤维素酶和蜗牛酶的PB破壁溶液，于30°C水浴处理处理30min， 2000r/min，离心lOmin，用含0. lmol/L磷酸缓冲液、0. 7mol/L KCl、pH6. 0的高渗PB缓冲液 洗涤2次，离心收集原生质体；酵母菌原生质体诱变取IOml原生质体液置于带转子的9cm的平皿中，在15W紫外灯 下距30cm磁力搅拌照射15-20s后，取0. 2ml涂在含5% NaCl的YPD固体培养基高渗平板， 30°C恒温避光培养3d ；平板初筛将紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分别放置在37°C、40°C进行培养，选出 生长快且菌落大的耐高温菌株，将选出的耐高温菌株的以同样的方法制备原生质体，以同 样的方法经紫外线照射，菌液涂布在含8% 15%酒精浓度的YPD平板，于37°C培养，选出生长快且菌落大的耐高温、耐高酒精菌株，再利用含0. 1% TTC的YPD固体培养基平板筛选 出产酒精能力强的突变菌株；发酵复筛利用平板初筛获得的菌株用发酵培养基进行发酵筛选，用显微镜观察菌体 的活菌数和出芽率，筛选出产酒性能最优的酵母菌。
3.利用酿酒酵母菌CGMCCNO. 3476发酵淀粉生产酒精的应用。
4.利用酿酒酵母菌CGMCCNO. 3476高温快速浓醪发酵淀粉生产燃料酒精的方法，步骤 如下1)种子液准备接种酿酒酵母菌CGMCC NO. 3476于YPD液体培养基中，37°C摇床培养过夜，使0D_约 为10左右，得种子液；2)浓醪液准备基于容器的容积，称取重量体积比30% 40%的淀粉置于容器中，加水搅拌均勻， 按20u/g淀粉加入液化酶，水浴加热使液化温度为85-90 0C，液化时间Ih，使DE值为 15% -20%，得浓醪液；3)接种发酵浓醪液降温至37°C，按lOOu/g淀粉加入糖化酶，添加0. (m/v)的尿素，以5%接种 量接入种子液，置于37°C摇床进行同步糖化发酵，转速lOOr/m，发酵时间46h，即可得酒精。
全文摘要
本发明公开了一种酿酒酵母菌株，分类命名为Saccharomyces cerevisiae Y09tj，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3476。本发明还提供了该菌株的选育以及高温快速浓醪发酵淀粉生产乙醇的方法。该菌株从自农家常见自酿甜酒中分离经紫外诱变选育得到。酿酒酵母菌CGMCC NO.3476生长快，发酵能力强，具有很高的抗乙醇毒性，并可耐高葡萄糖浓度，最高可耐62％(m/v)葡萄糖浓度，利用本发明的方法平均出酒率比其它生产菌提高1.2％，出酒率可高达16.0％(v/v)，且发酵周期短，仅需46h，设备利用率可大幅提高，发酵成本大大降低。
文档编号C12N15/01GK101845404SQ20101004562
公开日2010年9月29日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者孙靓, 廖思明, 杨登峰, 王成华, 王青艳, 申乃坤, 秦艳, 陆琦, 陆雁, 黄日波 申请人:广西科学院