专利名称：一种提取家禽基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取家禽基因组DNA的方法。
背景技术：
分子遗传标记(molecular genetic marker)又称DNA分子标记，是指位于染色体 上确定位置，能够稳定遗传并可被检测的一段DNA序列。其来源于DNA的序列多态性，满足 孟德尔遗传定律，随DNA的复制而稳定传递。由连锁定律可知染色体上距离较近的DNA片段 能够连锁传递给下一代个体，这样DNA分子标记常被用来跟踪确定某个特定基因的在个体 中的传递规律，成为基因型易于识别的特殊表现形式。与细胞遗传标记，生化遗传标记和形 态遗传标记相比，分子遗传标记不受制于基因表达产物的限制，没有时空与组织的表达特 异性，不受外界环境和个体生长发育的影响，在基因组DNA中广泛存在，并且在群体中有很 高的多态性，可以运用越来越多的分子生物学手段来检测，如限制片段长度多态性(RFLP)、 以小卫星和微卫生星形式存在的可变数量串联重复片段(VNTR)、单引物PCR(SPAR)和随机 扩增多态性DNA(RAPD)等等。随着分子生物学的飞速发展，分子遗传标记的开发和使用成 本越来越低，实验室检测的手段越来越多，不仅简便易行而且效率更高。这样就可以使我们 摆脱对基因产物(表型，同功酶，血细胞表面抗原)的依赖，而转向更加中性的DNA分子标 记技术来分析基因连锁，进行遗传图谱的构建和基因的定位工作。 随着DNA分子标记技术的发展，其在动物生产与遗传育种中的遗传检测与亲子鉴 定，品种系纯度和遗传距离测定，群体遗传变异分析，经济性状遗传标记，动物起源与进化 中的亲缘关系分析等方面的应用越来越重要。标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的 分子遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项遗传育种技术。与利用表型性状，同功酶或 表面抗原相比，DNA分子标记具有标记点量多，不影响基因表达和个体表型，与不良性状连 锁的概率小等诸多优点。在生产实践中，育种工作者可以在个体一出生就提取其组织中的 基因组，通过DNA分子标记技术，准确地获得其遗传信息，辨别等位基因，进行有利性状个 体的早期筛选，为降低生产成本获得更大的经济效益服务。 在动物生产与遗传育种中运用分子标记技术的一个前提是首先要获得含有动物 群体准确遗传信息的载体_大量纯净的DNA样本。可用于提取DNA的组织很多，如皮肤、骨 骼、血液等。提取得方法也多种多样，有浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚法、水抽提法等。对于 牛、羊、猪等大动物一般采取从皮肤中提取基因组DNA，而对于禽类，由于其血细胞中含有细 胞核，而且血液的获取也很容易，所以常规方法是先抽取其血液添加各种抗凝剂制成抗凝 血，然后利用苯酚抽提的方法提取全血基因组DNA。以提取鸡群体基因组而进行采血为例，
一般有3处采血位置1)鸡冠；2)心脏；3)翅下静脉。在鸡冠采血由于鸡冠神经丰富，靠近
大脑，针剌对鸡的应激剌激太大，有可能造成猝死。在翅下采血虽然对鸡的应激较小，采血 量也易控制，但是操作难度较大，若群体数量很大，极其耗费人工和时间，使用无菌注射器 的成本也太高。在心脏采血难度更大，而且一般应用于急性实验，不在生产场中使用。在对 鸡群现场采血中一般采用无菌注射器一鸡一只在翅下静脉采血，这样的不仅对鸡的应激较
3大，并引起皮下淤血，影响家禽个体健康状态甚至显著降低家禽产蛋和产肉量，造成不小的 经济和效益损失；而且由于使用无菌注射器，导致翅下采血成本很高。由于要将针准确剌入 翅下静脉并抽血这对操作者的熟练度要很高，这无疑于增加了抽血的难度和家禽个体所受 的痛苦剌激，而且要现场对采出的血液进行抗凝处理，也是一个前期准备中耗时费力的项 目。由于翅下静脉采血获得血量较多，一般可达3-5ml左右，对于血细胞有核的家禽来说， 其平均采血量远大于DNA提取的所需要量，这不仅在一定程度上造成浪费也增大了对家禽 个体的不良剌激。并且在实践中抗凝剂是不能保证每管中是纯粹抗凝血状态的，这样就造 成凝血不均一并引起的提取DNA时吸取血细胞量的差异，造成提出的DNA沉淀有多有少，差 异显著，为后继DNA的精确实验带来不便。若是在抗凝血中发生溶血现象，导致吸取的血样 中血细胞过少，使最后DNA沉淀过少甚至出现没有的"空管"现象，造成返工重提，不仅影响 工作的进度和效果，更严重影响到下一步在实验室DNA的相关检测工作。对于要获得大群 体家禽群体的基因组DNA，用翅下静脉采血并制成抗凝血后再进行实验室DNA提取无疑是 一项耗时，耗力，高成本，低效率的工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取家禽基因组DNA的方法。
本发明提供的提取家禽基因组DNA的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将禽血与裂解液现场直接混合； (2)加入蛋白酶K，50-6(TC处理6-18小时； (3)在步骤(2)的溶液中加入等体积Tris-饱和酚，震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半 径、11000-13000rpm离心8-12分钟; (4)取步骤(3)的上清，加入等体积Tris-饱和酚震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半径、 11000-13000rpm离心8-12分钟; (5)取步骤(4)的上清，加入等体积溶液甲，震荡混匀，4t:、9.5cm离心半径、 11000-13000rpm离心8_12分钟；所述溶液甲是将Tris-饱和酚与氯仿等体积混合得到的 溶液； (6)取步骤(5)的上清，加入等体积氯仿，震荡混匀，4t:、9.5cm离心半径、 11000-13000rpm离心8-12分钟; (7)取步骤(6)的上清，加入无水乙醇，离心得到沉淀；用75% (体积百分含量) 乙醇水溶液洗涤沉淀，得到家禽基因组DNA。 所述步骤(1)具体可为将禽血与裂解液在采血现场直接混合，密封于1.5ml离心
管中至于冰盒中待用。 所述步骤(2)具体可为加入蛋白酶K，55t:处理12小时。 所述步骤(3)具体可为在步骤(2)的溶液中加入等体积Tris-饱和酚，震荡混 匀，4。C、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。 所述步骤(4)具体可为取步骤(3)的上清，加入等体积Tris-饱和酚震荡混匀， 4°C、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。 所述步骤(5)具体可为取步骤(4)的上清，加入等体积所述溶液甲，震荡混匀， 4°C、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。
所述步骤(6)具体可为取步骤(5)的上清，加入等体积氯仿，震荡混匀，4t:、 9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。 所述裂解液可采用任何购买的常用细胞裂解液，任何常规方法配制成的细胞裂解 液，如可采用如下制备方法将24. 5ml的20XSTE缓冲液和10ml 25% (质量百分含量)SDS 水溶液混合，加水至500ml ;所述20XSTE缓冲液由Tris-Cl、NaCl、EDTA和水组成，Tris-Cl 的浓度为1Ommol/L， NaCl的浓度为0. lmmol/L， EDTA的浓度为lmmol/L。
所述禽为雏鸡，所述禽血、所述裂解液、所述蛋白酶K的配比具体可为2-3iU禽 血700 ii 1裂解液0. 45U蛋白酶K。所述禽为成鸡，所述禽血、所述裂解液、所述蛋白酶K 的配比具体还可为20 ii 1禽血700 ii 1裂解液0. 45U蛋白酶K。
所述禽血可采自趾拓上关节内侧。 所述禽为雏鸡时，采血方式可为将雏鸡趾拓外翻，用针剌血管，取2-3 ii 1血。
所述禽为成鸡时，采血方式可为一人抓住鸡的双翅根部，并将鸡托起或使其平 卧，另一人拉住鸡的两腿，使其平伸，暴露趾拓后侧，趾拓腿关节上1-1. 5cm处用手圈紧按 压，可以发现趾拓腿关节有血管轻微鼓起，其为趾拓静脉所在，用酒精棉球擦拭其表面皮 肤，针剌采血取20iU血液。 本发明方法根据禽血中血细胞含有细胞核，并且抽提时容易被蛋白污染的特点， 对于禽血基因组的采集和分离，提出见血可提的原则，并整理出一套适合家禽养殖场分子 遗传鉴定实验需求的全血基因组DNA的采集和分离纯化方法。与已有方法相比，本发明方 法具有以下不同(l)摒弃抗凝剂和注射器使用，减少了成本和禽血的浪费，可以将遗传检 测采血对家禽个体健康和效益生产的影响减到最低；(2)在趾拓静脉采血，并提出具体的 操作方法，简单有效的采集血样；(3)直接在现场采集最少的血液样本并直接混合存储于 单管禽血裂解液中运输和存储，减少了禽类传染病(如禽流感)和血液污染机会，提高了生 物安全性的同时也便于后续实验室的分子鉴定工作；(4)本发明方法提出禽血基因组抽提 时应用饱和酚于4t:离心机中抽提两次，这样可以有效地去除蛋白污染，提高DNA纯度，凝 胶电泳无明显蛋白脱尾。
图1为基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳图；A :本发明的方法对1#至6#雏 鸡的基因组DNA电泳鉴定；B :对照方法对1#至6#雏鸡的基因组DNA电泳鉴定。
图2为分子标记分析中的琼脂糖凝胶电泳图；1-15 :对应15只2日龄雏鸡基因组 DNA样本PCR条带；16 :marker。 图3为微卫星电泳图；1-15为对应15只2日龄雏鸡基因组DNA样本电泳条带。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 禽血裂解液将24. 5ml的20XSTE缓冲液和10ml 25% (质量百分含量)SDS水 溶液混合，加水至500ml，高压灭菌后待用；所述20XSTE缓冲液由Tris-Cl、 NaCl、 EDTA和水组成，Tris-Cl的浓度为10,1/L， NaCl的浓度为0. 1,1/L， EDTA的浓度为1,1/L。
实施例1 、养殖场鸡群体基因组DNA的提取
—、采血 1、成年鸡趾拓静脉的采血 采取2人配合， 一人抓住鸡的双翅根部，并将鸡托起或使其平卧，另一人拉住鸡的 两腿，使其平伸，暴露趾拓后侧，在趾拓腿关节上1-1. 5cm处用手圈紧按压，可以发现趾拓 腿关节表面有血管轻微鼓起，其为趾拓静脉所在。用酒精棉球擦拭表面皮肤，将采血针于此 向近心端剌入，拔针后创口中自然流出暗红色静脉血，使用移液枪吸取20 ii 1血液注入标 号的带有700 iU裂解液的离心管中抽吸3次(若其不能自然凝血，可用酒精棉球压迫止 血；每一支采血针用完后立即放入75%酒精中，间隔若干只鸡后再次使用，可以有效避免 交叉污染；在鸡采血前，应保证有充足的饮水，这样便于血液的采集)。
2、雏鸡趾拓静脉的采血 雏鸡静脉趾拓静脉采血较成鸡操作简单，但采血量比成鸡量少，仅为2-3 iU，但这 样的采血量足够满足基因组检测的需要。事先配制好含有700ia裂解液的离心管待用。采 血时两人配合， 一人把雏鸡趾拓外翻，可以看见红色的血管，使用细针将从血管边缘轻剌一 下，便有少量血液流出，使用移液器将血液完全吸入，转移至含有700 ii 1裂解液的离心管 中摇匀即可，同时另一人使用酒精棉伤口残血擦净消毒，将雏鸡放回栏中。将含有血液的离 心管放入冰盒中保存。采完血后的雏鸡应不再流血，并可以自由觅食。
二、从鸡血样管中提取基因组DNA
以下离心的离心半径均为9. 5cm离心半径。 1、在步骤一的离心管(装有鸡血和裂解液)中加入15iU蛋白酶K(0.45U)，振荡 20-30分钟，55。C水浴震荡12小时; 2、加入等体积Tris-饱和酚，振荡15-20分钟，4°C 、 12000rpm离心10分钟，取上 清； 3、加入等体积Tris-饱和酚，振荡15-20分钟，4°C 、 12000rpm离心IO分钟，取上 清； 4、加入等体积溶液甲(将Tris-饱和酚和氯仿等体积混合)，振荡15_20分钟， 12000rpm，4。C条件下离心10分钟，取上清； 5、加入等体积氯仿，振荡15-20分钟，12000rpm，4。C条件下离心10分钟，取上清；
6、加入1000 iil无水乙醇，振荡1-3分钟，12000rpm，4t:条件下离心5分钟，取沉 淀； 7、加入700 iil 75% (体积百分含量)乙醇水溶液中洗涤1分钟； 8、8000rpm，4t:条件下离心5分钟，弃上清，干燥1-2小时后加入30-50 ii 1双蒸水
溶解过夜，次日至于_201:冷冻保存。 三、对照实验 利用酚氯仿法从鸡抗凝血中提取基因组DNA(以下离心的离心半径均为9. 5cm离 心半径)，步骤如下 1、吸取100 iil鸡抗凝血，置于1. 5ml离心管中； 2、加入500 iil禽血裂解液和15iU蛋白酶K(O. 45U)，振荡20-30分钟，55。C水浴
6震荡12小时； 3、加入等体积Tris-饱和酚，振荡15-20分钟，12000rpm室温离心IO分钟，取上 清； 4、加入等体积溶液甲(将Tris-饱和酚和氯仿等体积混合)，振荡15_20分钟， 12000rpm室温离心10分钟，取上清； 5、加入等体积氯仿，振荡15-20分钟，12000rpm室温离心10分钟，取上清；
6、加入1000 iil无水乙醇，振荡1-3分钟; 7、将白色絮状DNA沉淀加入700 iU 75% (体积百分含量)乙醇水溶液中洗涤1 分钟；8、8000rpm室温离心5分钟，弃上清，干燥1-2小时后加入100-150 y 1双蒸水溶解 过夜，次日至于-2(TC冷冻保存。
四、提取效果比较
1 、基因组DNA电泳分析 分别采用步骤二和步骤三的方法提取6只6日龄雏鸡(每只取样血8 ii 1)的全血 基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳(结果见图1)。采用步骤二方法提取禽血基因组DNA 可以有效地减低蛋白残留，所以在电泳时，多数DNA可以泳动进入琼脂糖凝胶，带区均一饱 满，而在点样孔中残留较少的DNA。而基于步骤三方法提取禽血基因组DNA，不能有效地去 除蛋白残留，导致DNA被大量残留蛋白结合，不易溶解，无法正常泳动，而被大量滞留在点 样孔中。并且抗凝血样由于血液抗凝处理后不免部分溶血，造成体系不均一，易造成基因组 提取中DNA产量不均一甚至会出现没能有DNA提取的空管出现，极大地的降低了实验检测
的进度和效率。结果表明，相比原有方法，本发明方法可靠易行，具有极大的优越性。
2、分子标记分析 采用步骤二的方法提取2日龄15只雏鸡(每只取样血2 iU)的全血 基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用MCW-67基因分子标记引物(上游引物 5' -GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT-3';下游引物5' -GAGATGTAGTTGGCACATTCCGAC-3')进行 PCR，然后将PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳(结果见图2)。
3、微卫星电泳 采用步骤二的方法提取2日龄15只雏鸡(每只取样血2iU)的全血基因组 DNA，以基因组DNA为模板，运用微卫星电泳技术进行早期的遗传标记分析(上游引物 5' -GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT-3';下游引物5' -GAGATGTAGTTGCCACATTCCGAC-3')，电泳浓 度15% PAGE。 DNA电泳和PCR以及微卫星电泳胶图均清晰可见，可见本发明方法具有实际应用 性和可靠度高的优点。
权利要求
一种提取家禽基因组DNA的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将禽血与裂解液现场直接混合；(2)加入蛋白酶K，50-60℃处理6-18小时；(3)在步骤(2)的溶液中加入等体积Tris-饱和酚，震荡混匀，4℃、9.5cm离心半径、11000-13000rpm离心8-12分钟；(4)取步骤(3)的上清，加入等体积Tris-饱和酚震荡混匀，4℃、9.5cm离心半径、11000-13000rpm离心8-12分钟；(5)取步骤(4)的上清，加入等体积溶液甲，震荡混匀，4℃、9.5cm离心半径、11000-13000rpm离心8-12分钟；所述溶液甲是将Tris-饱和酚与氯仿等体积混合得到的溶液；(6)取步骤(5)的上清，加入等体积氯仿，震荡混匀，4℃、9.5cm离心半径、11000-13000rpm离心8-12分钟；(7)取步骤(6)的上清，加入无水乙醇，离心得到沉淀；用75％(体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到家禽基因组DNA。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(1)为将禽血与裂解液在采血现场直接混合，密封于1.5ml离心管中至于冰盒中待用；所述步骤(2)为加入蛋白酶K，55t: 处理12小时。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为在步骤(2)的溶液中加入等体积Tris-饱和酚，震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟；所述 步骤(4)为取步骤(3)的上清，加入等体积Tris-饱和酚震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半径、 12000rpm离心10分钟。
4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(5)为取步骤(4)的 上清，加入等体积所述溶液甲，震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。
5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(6)为取步骤(5)的 上清，加入等体积氯仿，震荡混匀，4t:、9. 5cm离心半径、12000rpm离心10分钟。
6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述裂解液的制备方法如下将 24. 5ml的20XSTE缓冲液和10ml 25% (质量百分含量)SDS水溶液混合，加水至500ml ;所 述20XSTE缓冲液由Tris-Cl、NaCl、EDTA和水组成，Tris-Cl的浓度为1Ommol/L， NaCl的 浓度为0. lmmol/L， EDTA的浓度为lmmol/L。
7. 如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述禽血、所述裂解液、所述蛋 白酶K的配比为2-3 iU禽血700 iU裂解液0. 45U蛋白酶K ;所述禽血、所述裂解液、 所述蛋白酶K的配比为20iU禽血700iU裂解液0.45U蛋白酶K。
8. 如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述禽血采自趾拓上关节内侧。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述禽为雏鸡；采血方式为将雏鸡趾拓外翻，用针剌血管，取2-3iU血。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述禽为成鸡；采血方式为一人抓住鸡 的双翅根部，并将鸡托起或使其平卧，另一人拉住鸡的两腿，使其平伸，暴露趾拓后侧，趾拓腿关节上1-1. 5cm处用手圈紧按压，可以发现趾拓腿关节有血管轻微鼓起，其为趾拓静脉 所在，用酒精棉球擦拭其表面皮肤，针剌采血取20 iU血液。
全文摘要
本发明公开了一种提取家禽基因组DNA的方法，可应用于实际生产中大规模的采集和分离纯化家禽群体的基因组DNA。本发明提供提取家禽基因组DNA的方法，基于禽血血细胞含有细胞核的条件，提出禽血DNA基因组见血可提原则，彻底省去抗凝血和血液保存步骤，并提出在趾跖静脉采血，可以简单高效的收集血样并且对家禽的不良刺激小，最大程度的减少因为采血引起家禽产蛋和产肉的下降。在现场采集不多于20μl每只的血样，后直接将血样转入带有700μl禽血裂解液的1.5ml离心管中混合，并置于冰盒中带回实验室进行DNA提取工作，安全可靠，降低了大量禽类血液运输容易带来生物安全性的风险。针对禽血基因组提取中易出现蛋白污染的问题，本发明方法提出按原有苯酚法提取DNA，只需将饱和酚处理升至两次并在4度离心即可极大程度的去除蛋白污染，提高提取DNA纯净度，为后续的分子检测工作带来极大的便利。
文档编号C12Q1/68GK101768588SQ20101010083
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者孙研研, 李新, 杨宁, 蒋斌, 连玲, 郑江霞 申请人:中国农业大学