专利名称：一种提高基因重组肠道病毒71型vp1表达量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白表达量的方法，尤其涉及一种在哺乳动物细胞中提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白表达量的方法。
背景技术：
肠道病毒71型(EntemVims71，EV 71)引起是手足口病主要病原体，目前还没有预防手足口病的疫苗上市。常见的疫苗有灭活疫苗、DNA疫苗及重组疫苗、减毒活疫苗和多肽疫苗。其中重组疫苗是指利用重组DNA技术，将病原的保护性抗原基因在不同的表达系统中体外表达，生产能诱导机体产生保护性免疫反应的病原蛋白质，再经分离纯化而制备的疫苗。重组疫苗因安全性好、制备简单及成本较低等优点，在预防病毒性传染病方面已经广泛应用，EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在 24nm 30nm，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者又是由四种衣壳蛋白(VPl VP4)拼装成的五聚体样结构(图1)。四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其它三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本位于VP1-VP3上。EV71病毒衣壳蛋白VPl是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VPl 基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据.并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VPl基因成了 EV71疫苗开发的最重要研究对象。利用基因工程技术， 重组表达VPl蛋白，用于开发手足口病疫苗是当前研究的热点。目前，利用基因工程重组技术开发疫苗的难点在于如何提高重组蛋白的表达量和保持蛋白抗原性。
发明内容
本发明的目的是通过基因的改建，有效地提高在哺乳动物细胞中的肠道病毒71 型VPl蛋白的表达量，从而构建新型的重组肠道病毒71型VPl蛋白表达质粒，建立表达体系，并进行稳定表达株的全面筛选。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种提高重组肠道病毒71型VPl蛋白的方法，包括如下步骤将内部核糖体进入位点序列IRES进行弱化处理；弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启动子。优选的，所述筛选标记基因是二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表达载体是 PIRES-DHFR 或 ρ IRES-GS。进一步的，还包括通过氨甲喋呤或MSX加压扩增筛选标记基因两翼的基因。进一步的，所述弱化处理是指通过双顺反子载体将筛选标记基因二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因连在内部核糖体进入位点序列IRES的3'端，筛选标记基因的表达水平得到降低。本发明通过含弱化的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，简称为“IRES”)序列的含有双重筛选标记的表达载体来表达重组VPl蛋白，极大地简化筛选过程，提高筛选效率，提高获得高表达稳定株的概率，即经过一次单克隆筛选，即可获得大量稳定表达细胞株，单克隆细胞的阳性率达到95%。
图1是本发明中具有双重筛选标记的表达载体pIRES-DHFR/GS示意图。图2是VPl基因克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图。
具体实施例方式围绕重组蛋白表达水平低的问题，人们进行了大量的实验研究，以期提高其表达量。弱化技术，即通过有目的改造使得外源目的表达基因3'端下游的选择标记基因的翻译起始效率大大降低，基因表达被弱化。因此，提高外源基因的表达水平可以通过弱化选择标记基因表达，提高外源基因扩增水平来达到。因此，提高外源基因的表达水平可以弱化选择标记基因表达，提高外源基因扩增水平来达到。弱化选择标记基因的表达，可使得在使用与常规的表达载体相同的选择压力时，选择标记dhfr基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也相应得到提高。如一种双顺反子载体将dhfr基因连在外源基因的3'端，从而位于外源基因3'端下游的dhfr基因的翻译起始效率大大降低，dhfr基因表达被弱化。图1是本发明中具有双重筛选标记的表达载体pIRES-DHFR/GS示意图，如图1所示，本发明采用含内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite，IRES)序列的有双重筛选标记的表达载体一pIRES-DHFR/GS，该载体利用弱化的IRES连接目的基因和筛选标记基因-二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或谷氨酰胺合成酶基因(gs)，两个基因共用一个启动子，两段基因同时得到翻译，在翻译过程中核糖体至第一个基因终止密码子时，从mRNA 上解离下来，但由于存在IRES序列，核糖体又能自动结合mRNA，直接翻译IRES后的基因。 同时由于本载体使用的IRES序列经弱化处理，第二个基因的表达水平(DHFR或gs)是前一个基因即目的基因的1/10，如果细胞系要在含MTX或MSX的培养基中生存，必须高水平表达二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或谷氨酰胺合成酶基因(gs)，这样弱化的IRES前的目的基因相应高水平的表达。此外，由于MTX或MSX加压可以扩增DHFR或gs两翼的基因，经过多轮加压并提高加压筛选浓度，可以进一步提高目的基因的表达量。图2是肠道病毒71型VPl基因克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图。重组VPl蛋白表达在哺乳动物细胞中的表达，在哺乳动物细胞内的各种加工修饰，可以最大程度保持重组VP蛋白的免疫原性，用使用较多的BHK表达体系和广泛使用的 CHO表达体系分别进行表达研究。将克隆好的表达载体分别转染到BHK或CHO细胞中。转染48h后按照1 15传代，24h后加入相应的筛选药物MTX或MSX筛选稳定表达细胞株，并测定表达上清中的VPl抗原含量及生物活性。
权利要求
1.一种提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白的方法，其特征是包括如下步骤将内部核糖体进入位点序列IRES进行弱化处理；弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启动子。
2.如权利要求1所述的一种提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白表达量的方法，其特征是所述筛选标记基因是二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表达载体是 ρIRES-DHFR 或 pIRES-GS。
3.如权利要求1所述的一种提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白表达量的方法，其特征是还包括通过氨甲喋呤或MSX加压扩增筛选标记基因两翼的基因。
4.如权利要求1所述的一种提高基因重组肠道病毒71型VPl蛋白的方法，其特征是 所述弱化处理是指通过双顺反子载体将筛选标记基因二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因连在内部核糖体进入位点序列IRES的3'端，筛选标记基因的表达水平得到降低。
全文摘要
本发明通过分子生物学技术，构建含弱化的内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，简称为“IRES”)序列及双重筛选标记的新型表达载体，本载体可用来重组表达肠道病毒71型VP1蛋白，通过稳定表达株的全面筛选，能够有效地提高VP1蛋白在哺乳动物细胞中的表达量。
文档编号C12N15/85GK102242139SQ20101017061
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者李昂, 马境 申请人:上海吉美生物工程有限公司