专利名称：猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达上调的est序列的制作方法
技术领域：
本发明属于食品检验领域，具体地说，涉及利用猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激 引发表达上调的EST序列检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛。
背景技术：
药物盐酸克伦特洛(Clenbuterol-HCL，CLB-HCL)，俗称“瘦肉精”，是一种β -肾上 腺素受体激动剂(beta-Adrenergic agonists)，不仅可以提高畜禽的生长速度，降低料肉 比，还可以显著减少脂肪蓄积，提高胴体瘦肉率。但是CLB-HCL在动物体内存在广泛的积累 性残留，对食用者的安全造成潜在的危害，急性中毒事件屡有发生。到目前为止，没有任何 国家允许CLB-HCL作为生长促进剂用于食品动物的生产之中，欧盟、美国FDA及我国政府都 制定了严格的残留标准。但是由于CLB-HCL对动物生长的促进作用和降低胴体脂肪积蓄是 异常显著的，出于经济效益的考虑，少数养殖户在饲养肉猪的时候，过分依赖CLB-HCL，结果 导致问题猪肉上市危害群众健康。目前主要利用抗体杂交技术检测猪肉中CLB-HCL的残留，但能够检测到的一般都 是问题比较严重的猪肉，而对于前期饲喂CLB-HCL的猪却很难检测出CLB-HCL的痕迹。通 过对饲喂CLB-HCL的猪和普通饲料饲养的猪的研究表明，饲喂CLB-HCL可引起猪体内一些 关键基因的表达变化。表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序 列，这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基 因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。在通过mRNA差 异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆 到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种受到盐酸克伦特洛(Clenbuterol-HCL，CLB-HCL)刺激 引发表达上调的表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs) (rpfat_8229)。该序列 可以用于检测猪脂肪细胞是否受到盐酸克伦特洛的刺激，从而检测猪肉中是否存在残留的 盐酸克伦特洛。为了实现本发明目的，本发明提供猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达上调 的EST序列，其具有kq ID No. 1所示的核苷酸序列。本发明还提供检测上述序列的引物，其包括上游引物 5，-GTCGGCTTAGAGGACCTTCACTGC-3，和下游引物 5，-CGCGCGTTTCCGCAGCGAGACAG-3，。本发明进一步提供上述EST序列在检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛中的应用。具 体方法包括1)从普通饲料饲养的正常猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA ；2)设计引物，包括上游引物5，-GTCGGCTTAGAGGACCTTCACTGC-3，和下游引物5’ -CGCGCGTTTCCGCAGCGAGACAG-3’，通过荧光实时定量PCR技术得到正常猪的扩增曲线；
3)从样品猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA ；4)使用与步骤2)相同的引物进行荧光实时定量PCR，将得到的扩增曲线与步骤2) 中得到正常猪的扩增曲线做对照，根据基因表达情况检测样品猪中是否有盐酸克伦特洛残&3 甶ο本发明首次提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达上调的EST序列， 利用该序列设计引物，通过定量PCR扩增得到正常猪体内rpfat_82^基因的表达水平， 再通过定量PCR技术检测样品猪体内该基因的表达情况，从而确定样品猪中是否残留有 CLB-HCL0另外，本发明对于前期饲喂CLB-HCL的猪中CLB-HCL的检测具有显著的效果。
图1为本发明实验组与对照组猪肉中rpfat_82^基因的表达差异(定量PCR结 果)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例一.总RNA的提取1、取新鲜或_70°C冻存的猪肉样品，每30 50mg猪肉样品加入lmlTRIzon，勻浆 仪进行勻浆处理。样品体积一般不要超过TRIzon体积的10%。2.将上述样品在15 30°C放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 4°C, 12, OOOrpm 离心 10 分钟，取上清。4.向上清中加入氯仿，每使用Iml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡 15秒，室温放置3分钟。5. 4°C, 12, OOOrpm离心10 15分钟，此时溶液分三层黄色的有机相，中间层和 上层无色的水相，RNA主要存在水相中，把水相(约500 μ 1)转移到一个新的无foiase的离 心管中。6.向得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混勻，室温放置20 30分钟。7. 4°C, 12, OOOrpm 离心 10 分钟，弃上清。8.用 75v/v% 乙醇(无 RNase)洗涤沉淀。每使用 Iml TRIzon 用 Iml 醇对沉淀进行洗涤。9. 4°C，5，OOOrpm离心3分钟。用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。10.室温放置2 3分钟，晾干，加入30 100 μ 1无RNase的水，充分溶解RNA 后，置于-70°C保存。二 . cDNA第一链的合成1.在PCR管中依次加入Oligo (dT) 182μ 1IOmMdNTP2μ 1RNA4 μ 1 (约 3 μ g)
DEPC 水16 μ 12.于70°C变性5min，迅速置于冰上，静置lmin。3.向上述PCR管中依次加入Superscript II2μ 15 X第一链合成缓冲液8 μ 1RNasin2μ 10. IM DTT4 μ 14.混勻后，稍微离心。5. 42°C，反应 50min。6. 72°C，反应 15min。7.产物直接用于PCR反应或者置于_20°C保存。三.引物合成通过生物软件设计引物，包括上游引物5’-GTCGGCTTAGAGGACCTTCACTGC-3’和下游 引物 5’-CGCGCGTTTCCGCAGCGAGACAG-3，。四.利用定量PCR技术检测rpfat_8229的表达情况参照美国ABI公司定量PCR Mix试剂盒说明书操作。1.标准曲线的制定以GAPDH作为内标基因绘制标准曲线。2.按照下列反应体系在96孔板上加样SYBR Green Mix7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1下游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1ddH205· 9 μ 13.采用ΑΒΙ7900ΗΤ荧光实时定量PCR仪，按下列条件进行反应55°C 5min ；95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40 个循环。4.最后在 ABI7900HT 荧光实时定量 PCR 仪上 95°C 15s，60°C 15s，再次 95°C 15s 作熔解曲线，每个样品、阴性对照(以水为模板)及标准曲线各做3个重复。5.对实验结果进行统计分析，如果实验样品猪(饲喂CLB-HCL)和对照样品猪(普 通饲料饲喂)中该基因的表达量上调达2倍以上，则表明该猪饲喂了 CLB-HCL。结果分析对72头实验组猪(普通饲料中添加25ppm CLB-HCL, 1月龄猪，连续饲 喂3个月)和18头对照组猪(普通饲料饲喂，1月龄猪，连续饲喂3个月)的研究结果表 明，rpfat_8229在实验组猪中的表达明显上调。平均上调倍数为2. 49倍。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达上调的EST序列，其特征在于，其具有Seq ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.检测权利要求1所述序列的引物，其特征在于，其包括上游引物 5，-GTCGGCTTAGAGGACCTTCACTGC-3，和下游引物 5，-CGCGCGTTTCCGCAGCGAGACAG-3，。
3.权利要求1所述序列在检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，具体方法包括1)从普通饲料饲养的正常猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA；2)设计引物，包括上游引物5’-GTCGGCTTAGAGGACCTTCACTGC-3’和下游引物 5’ -CGCGCGTTTCCGCAGCGAGACAG-3’，通过荧光实时定量PCR技术得到正常猪的扩增曲线；3)从样品猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA；4)使用与步骤2)相同的引物进行荧光实时定量PCR，将得到的扩增曲线与步骤2)中 得到正常猪的扩增曲线做对照，根据基因表达情况检测样品猪中是否有盐酸克伦特洛残 留。
全文摘要
本发明提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达上调的EST序列，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用该序列设计引物，通过定量PCR扩增得到饲喂普通饲料的正常猪体内rpfat_8229基因的表达水平，再通过定量PCR技术检测样品猪体内该基因的表达情况，从而确定样品猪中是否残留有CLB-HCL。另外，本发明对于前期饲喂CLB-HCL的猪中CLB-HCL的检测具有显著的效果。
文档编号C12N15/11GK102051360SQ20101026701
公开日2011年5月11日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者位治国, 张瑾, 李宁, 赵要风 申请人:李宁