专利名称：一种产类胰蛋白酶基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产类胰蛋白酶(trypsin-like protease,EC 3. 4. 21. 4)的基因工 程菌及其构建方法与应用，特别是一种高产类胰蛋白酶基因工程菌及构建方法与应用，属 于遗传工程领域。
背景技术：
迄今为止，酶制剂已被广泛地应用于制革、食品、发酵和纺织等行业。酶在制革工 业中的应用，最早仅限于酶脱毛和酶软化。随着科学技术的不断发展和进步，酶制剂在制革 行业中的应用范围也不断拓展、扩大，逐渐应用于制革准备工段乃至整个制革过程。种种 迹象表明，基于酶制剂的制革工艺方法的研究与开发，必将催生具有生态概念的制革新技 术——生物制革。其中在制革工业中应用较为广泛且应用时间较长的是胰酶，胰酶是一类 广泛应用于医药、食品、化工及制革等工业的混合酶制剂。胰酶最早是通过新鲜动物胰脏来 制备，通过绞碎，配料，磨浆，消化，过滤，干燥，球磨等工艺制备成为胰酶原粉，随后加填充 剂稀释成为不同酶活力标准的胰酶成品。动物源胰酶成分复杂，其中具有主要作用的是胰 蛋白酶(EC 3. 4. 21. 4)，虽然胰酶制备简便，但是制备过程比较粗放，产品不同批次间质量 参差不齐，品质难以控制，而对其进行精制则成本较大；另外动物源胰酶在皮革工业中存在 生物安全性低和标准化困难的缺点；制革工业中常用的的酶为蛋白酶，蛋白酶种类可分为 四大类丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类，链霉菌属 可以产生其中的除了半胱氨酸蛋白酶类的其他三类蛋白酶，已经发现了多种可产生蛋白酶 的链霉菌，主要包括灰色链霉菌QStr印tomyces ^risw人变铅青链霉菌(5 lividans、、弥 氏链霉菌(5 /rat/iae)和带小棒链霉菌(5 clavuligemsy^。通过对目前皮革工业中应用 较为普遍的动物源胰酶与链霉菌属^treptoiwce^胰蛋白酶的理论比较，链霉菌源胰蛋 白酶的酶活性质和作用方式均与动物源胰蛋白酶相同，而经过链霉菌胰蛋白酶氨基酸序列 和胰蛋白酶基因结构的比较，发现链霉菌源胰蛋白酶的氨基酸序列和基因结构同动物源胰 蛋白酶具有高度同源性，氨基酸序列相似度80. 9%，酶基因序列相似度79. 8%。然而，链霉菌 源胰蛋白酶的生产却由于链霉菌的发酵周期长，野生菌表达酶活低，及胰蛋白酶基因表达 调控复杂等因素而受到制约。对于动物源胰蛋白酶的重组基因工程菌的构建和表达研究较多，但是由于通过原 核生物表达真核生物蛋白在转录和翻译的调节上存在差异，因此得到外源表达胰蛋白酶多 数为包涵体蛋白，小鼠的胰蛋白酶编码基因同细菌碱性磷酸酶启动子(PhoA)在E. coli中 进行融合表达，并且通过添加外源激酶激活胰蛋白酶原，实现了胰蛋白酶的外源表达，但是 需要添加外源激酶激活，且产量较低，而链霉菌胰蛋白酶的活性表现不需要添加任何外源 激酶，对于链霉菌胰蛋白酶的研究起始较早，但是其集中在酶学性质和生理生化特性方面 的研究。对于链霉菌的胰蛋白酶的外源表达研究则主要集中在胰蛋白酶在不同的链霉菌宿 主中表达的生理生化作用的研究，且链霉菌的发酵周期普遍较长，发酵控制等相对较为困 难，并且链霉菌本身具有的蛋白质水解功能也会影响目的蛋白酶的产量。因此有必要对链霉菌胰蛋白酶进行重组基因工程菌的构建，来实现链霉菌胰蛋白酶的外源表达，及提高重 组菌胰蛋白酶的表达量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产类胰蛋白酶(trypsin-like protease, EC 3. 4. 21. 4)基因工程菌。所述基因工程菌染色体上携带有类胰蛋白酶(trypsin-like protease)基因 GprT)。所述类胰蛋白酶(trypsin-like protease)的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种类胰蛋白酶基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤 第一步类胰蛋白酶基因的获得及分析
iStreptomyces griseu) [Streptomyces griseu subsp griseus ATCC 10137，2010年5月沈日购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)]，对其类胰蛋白酶基 因进行PCR扩增及测序，其次，毕赤酵母G0Zdia pastoris)的表达系统有着特殊的密码 子偏好性，如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母(/^dia pastoris)可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过类胰蛋白酶基因在毕赤酵母中进行表 达的密码子适用指数(CAI)分析，发现在类胰蛋白酶基因中并无毕赤酵母无法识别及利用 的稀有密码子，其次，在进行PCR扩增所得类胰蛋白酶基因上下游分别加入feoTPI限制性内 切酶位点和Λ^ I限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示；
第二步类胰蛋白酶重组质粒的构建
为了使分基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子 AOXI的毕赤酵母表达载体(例如PPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用SprT基因序列5' 端的I限制性内切酶位点与3'端的Λ^ I限制性内切酶位点，将SprT基因克隆入载 体PPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵 母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗 性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有分基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行I和Λ^ I酶切， 连接得到含有SprT基因的重组质粒pPIC9K-SprT。第三步类胰蛋白酶基因工程菌的构建
将重组质粒pPIC9K-SprT电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的 组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含类胰蛋白酶基因的重组表达质粒pPIC9K_SprT可转化毕赤酵母 iPichia pas tor is GS115，hvitrogen)，成为能分泌表达外源类胰蛋白酶的功能酵母菌 由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-SprT上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组 表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-SprT可以定向整合到毕赤酵母染色 体DNA上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源SprT基因，信号肽指导 表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GS115 一环于25 mL YPD液体培养基中，28 °C 30 V振荡培养过夜，然后将上述培养液转入 100 mL YPD ( 500 mL三角瓶)液体培养基中，28 °C 30 V振荡培养，每隔1 h测定，培 养直至菌体浓度OD6c 为1.3 1.5，在冰水中冷却10 min以上，然后在4 V环境下，8000 r / min离心收集菌体，用40 mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置10 min，如此重复 步骤4三次，即无菌水洗涤3次，用300 PL预冷1 mol / L山梨醇悬浮细胞，从而获得受体 菌。然后取50 80 μ L受体菌和5 90 μ g线性化重组表达质粒DNA混勻，电击(电压 1500 V 电容25 μ F ；电阻200 Ω)处理，然后涂布于卡那霉素(10 yg / mL)抗性平板 筛选重组子，对阳性转化子进行PCR验证。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种类胰蛋白酶基因工程菌的应用方法。培养基组成(g/L):
种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15 ； 优化种子培养基为蛋白胨15，酵母提取物8，葡萄糖15，氯化钠10 ； 发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15，生物素0. 0002 0. 0005，甲醇10 50 ； 微量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100，ZnCl2 70，Na2MoO4 · 2H20 35，H3BO3 60，CoCl2 · 6H20 200， CuSO4 · 5H20 29，NiCl2 · 6H20 25，37% 盐酸 0. 9 mL。培养方法
接种一环转化子入250 mL三角瓶，装液量50 mL的种子培养基，培养温度 30°C， 摇床转速200 r / min，培养24h ；离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种 量接入装液量为50 mL发酵培养基的三角瓶(500 mL )中，发酵温度30°C，摇床转速200 r / min，发酵时间3 4天。类胰蛋白酶酶活测定方法
类胰蛋白酶能够选择性的切断赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，利用人 工合成的具有上述肽链的Na -苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯酰胺(ΒΑΡΝΑ)作为底物，在 410 nm下测定类胰蛋白酶催化BAPNA的产物对硝基苯胺的吸光系数，利用吸光系数在10 min内的变化率来反映类胰蛋白酶的酶活大小。酶活定义为在25 °C下，每水解1 Pg 的BAPNA所需的类胰蛋白酶的量，即为类胰蛋白酶的1个BAPNA水解单位。具体测定方 法为将43. 5 mg BAPNA先溶解于1 mL 二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于pH 8.0的，含有10 mM CaCL2的50 mM Tris-HCL缓冲液中，此即为类胰蛋白酶的底物溶液， 测定过程为在25 V下，测定10 μ L粗酶液同990 μ L ΒΑΡΝΑ溶液在光径1 cm的反应 池中，在410 nm下10 min内的吸光值变化，得到AA41tlnm / min，之后利用下面的公式计 算得到粗酶液酶活
BAPNA单位/ mL粗酶液=
8800
本发明构建了一株高效分泌表达类胰蛋白酶基因工程菌，解决了类胰蛋白酶产量低的 问题；应用该菌种生产类胰蛋白酶，产量高、工艺简单、便于工业化应用，该菌株生产的目的 蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产品纯度高。本发明为生物法产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现生物制革的清洁、低能耗，及皮革的生物安全性的生产。
具体实施例方式实施例1 类胰蛋白酶基因的扩增
类胰蛋白酶(Trypsin-like protease)的基因来源于灰色链霉菌(^&印如耶⑶·^ ^ri1SewJ中含类胰蛋白酶基因的编码序列(GenBank Accession No. M64471)，其中第639位 到第1307位是编码SprT的基因。在对基因进行密码子偏好性等分析后，在其5‘端及3' 端分别加上I和Λ^ I酶切位点，SprT基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。引物 序列为F1: 5’ CCGGAATTCGTCGTCGGCGGAACCCG 3’ Rl: 5' ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAGCGTGCGGGCGG3’。实施例2 重组质粒pPIC9K_SprT的构建
SprT基因体外扩增片段的和表达载体pPIC9K分别进行Λ^ I和feo/P I双酶切，回 收后用T4连接酶进行连接。连接反应体系为(10 μ L ):目的基因片断2 μ L，载体DNA 2 μ L，IOX Τ4 连接酶 Buffer 1 μ L，T4 DNA 连接酶 1 μ L，ddH20 4 μ L。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下
(1)无菌状态下取感受态细胞200μ L置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1 2PL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30 min ；
(3)42°C热休克90 sec (准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1 2min ；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μ L ；
(6)用无菌铺菌器将200μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37 V平放20 min 直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。实施例3 类胰蛋白酶基因工程菌的构建
将表达载体pPIC9K-SprT用Sac I酶切线形化。酶切体系(50 μ 体系)重组质粒 10 μι, Buffer 5 μ , Sac I 3 μ , ddH20 32 μ 。37 °C水浴 3 h，用 PCR 产物纯化试剂盒 对线形化产物进行纯化回收，电击法转化毕赤酵母GS115，具体方法如下
(1)接种活化后的毕赤酵母GS115—环于25 mL YPD液体培养基中，28 °C 30 °〇振 荡培养过夜；
(2)将上述培养液转入100mL YPD (500 mL三角瓶)液体培养基中，28 °C 30 °〇振 荡培养，每隔1 h测定，培养直至菌体浓度OD6tltl为1. 3 1. 5 ；
(3)在冰水中冷却10min以上；
(4)4 V ,8000 r / min离心收集菌体，用40 mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中 放置10 min ；
(5)重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次；
(6)用300μ 预冷1 mol / L山梨醇悬浮细胞；
(7)加入10μ 线形化质粒，在冰水中混勻5 min ；
(8)放入冰预冷的无菌电转化杯(0.2 cm)中，在1500 V，电击1 2次；(9)加入1mL预冷的1 mol / L的山梨醇溶液；
(10)取上述100 200μ 涂布YNB平板(或离心涂布100 μ )；
(11)28 °C 30 °〇倒置培养1 2天，挑选白色菌落。实施例4 基因工程菌的筛选 1、基因工程菌的G418筛选
接种转化子于25 mL YPD液体培养基中J8°C 30°C振荡培养过夜，离心收集菌体，无 菌水悬浮，取100 μ 分别涂布于含G418终浓度为0. 5,1. 0、2 mg / mL的YPD平板培养基 上，筛选转化子。2、双酶切验证提取转化子质粒，进行EcoR I和Afco I双酶切，对产物进行电泳验 证。3、类胰蛋白酶酶活性测定
(1)重组子和空载体PPIC9K转化的毕赤酵母GS115分别接种于20mL YPD液体培养 基，30。C振荡培养过夜(稳定期)；
(2)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入100mL MGY培养基(加入1 mL 100X生 物素)中；30°C，200 r / min振荡培养48 h ；
(3)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入30mL丽液体培养基(加入300 μ 甲醇， 300 μ 100Χ生物素)中；30 °C，200 r / min振荡培养7天；定时进行酶活测定。类胰蛋白酶酶活测定方法
类胰蛋白酶能够选择性的切断赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，利用人 工合成的具有上述肽链的Na -苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯酰胺(ΒΑΡΝΑ)作为底物，在 410 nm下测定类胰蛋白酶催化BAPNA的产物对硝基苯胺的吸光系数，利用吸光系数在10 min内的变化率来反映类胰蛋白酶的酶活大小。酶活定义为在25 °C下，每水解1 Pg 的BAPNA所需的类胰蛋白酶的量，即为类胰蛋白酶的1个BAPNA水解单位。具体测定方 法为将43. 5 mg. BAPNA先溶解于1 mL 二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于pH 8.0的，含有10 mM CaCL2的50 mM Tris-HCL缓冲液中，此即为类胰蛋白酶的底物溶液， 测定过程为在25 V下，测定10 μ L粗酶液同990 μ L ΒΑΡΝΑ溶液在光径1 cm的反应 池中，在410 nm下10 min内的吸光值变化，得到AA41tlnm / min，之后利用下面的公式计 算得到粗酶液酶活
隱单位“"且酶液
实施例5 发酵生产类胰蛋白酶
种子培养基蛋白胨15 g / L，酵母提取物8 g / L，葡萄糖15 g / L，氯化钠10 g /
L；
发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15 g / L，生物素0.0002 0.0005 g/L，甲醇 10 50 g/L ；微量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100 g/L, ZnCl2 70 g / L, Na2MoO4 · 2H20 35 g / L, H3BO3 60 g / L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g / L, NiCl2 · 6H20 25 g / L, 37% 盐酸 0. 9 mL。培养方法
种子培养接种一环转化子入250 mL三角瓶，装液量50mL，培养温度 30°C，摇床转速200 r / min，培养M h ；
发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为 50mL的三角瓶(500 mL )中，发酵温度30 V，摇床转速200 r / min，3 4天后，发酵 液中类胰蛋白酶活性为0. 5U/mL。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
核苷酸序列表 <110>江南大学
<120> 一种产类胰蛋白酶的基因工程菌及其构建方法与应用 <160> 3
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 672 <212> DNA
<213> 灰色链霉菌(Sti^ptomyces griseu) <400> 1
gtcgtcggcggaacccgcgccgcccagggcgagttccccttcatggtccggctctccatg60ggctgcggcggcgccctctacgcccaggacatcgtcctcaccgccgcccactgcgtgagc120ggatcgggcaacaacacctcgatcaccgccaccggcggcgtcgtcgacctccagtcgtcc180agcgccgtcaaggtccgctccaccaaggtcctccaggcccccggctacaacggcaccggc240aaggactgggcgctcatcaagctcgcccagcccatcaaccagcccacgctgaagatcgcc300accaccaccgcctacaaccagggcacgttcaccgtcgccggctggggcgccaaccgcgag360ggcggcagccagcagcgctacctgctcaaggccaacgtcccgttcgtctccgacgccgcc420tgccgctccgcctacggcaacgagctcgtggccaacgaggagatctgcgccggatacccc480gacaccggtggcgtcgacacctgccagggtgactccggcggcccgatgttccgcaaggac540aacgccgacgagtggatccaggtcggcatcgtcagctggggctacggctgCgCCCggCCC600ggctacccgggtgtctacaccgaggtctcgaccttcgcttccgccatcgcctcggccgcc660cgcacgctctga672
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 2
ccggaattcg tcgtcggcgg aacccg26<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 3
ataagaatgc ggccgctcag agcgtgcggg egg3权利要求
1.一种产类胰蛋白酶基因工程菌，其特征在于染色体上携带有类胰蛋白酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述类胰蛋白酶的基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征所述基因工程菌为毕赤酵母GS115。
4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤第一步利用PCR技术得到链霉菌属类胰蛋白酶基因；第二步将PCR扩增得到的类胰蛋白酶基因片段与毕赤酵母常用表达载体pPIC9K双酶 切、连接，得到含有类胰蛋白酶基因的重组质粒；第三步将重组质粒电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的组成 型毕赤酵母重组菌株。
5.一种应用权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在接种一环所述基因工程菌入 250 mL三角瓶，装液量50 mL的种子培养基，培养温度 30°C，摇床转速200 r / min, 培养Mh ；离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50 mL 发酵培养基的三角瓶中，发酵温度30°C，摇床转速200 r / min，发酵时间3 4天。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述种子培养基为(g/L)种子培养基蛋 白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述所述种子培养基为(g/L):蛋白胨15， 酵母提取物8，葡萄糖15，氯化钠10。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述所述发酵培养基为(g/L)酵母氮源 基础培养基12 15，生物素0. 0002 0. 0005，甲醇10 50 ；微量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100，ZnCl2 70，Na2MoO4 · 2H20 35，H3BO3 60，CoCl2 · 6H20 200，CuSO4 · 5H20 29，NiCl2 · 6H20 25，37% 盐酸 0. 9 mL。
全文摘要
本发明公开了一种产类胰蛋白酶的基因工程菌及其构建方法与应用，属于遗传工程领域。本发明通过将体外扩增所得的类胰蛋白酶基因连接到毕赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色体上，构建了一株高效分泌表达类胰蛋白酶的基因工程菌，发酵3～4天后，得到0.5U/mL的酶活，解决了类胰蛋白酶产量低的问题。应用该菌种生产类胰蛋白酶，产量高、工艺简单、便于工业化应用。
文档编号C12N1/19GK102094040SQ20101058090
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者令桢民, 堵国成, 张东旭, 陈坚 申请人:江南大学