专利名称：一种快速建立转基因阳性细胞系的方法
技术领域：
随着生物技术的发展，转基因动物的研究及基因的功能研究成为目前的热点，核移植是获得转基因动物普遍采用的技术，基因功能的研究在阳性细胞系或转基因动物上进行更具有说服力，因此获得转基因阳性细胞系是核移植及基因功能研究的基础，快速、简便获得活性好的阳性细胞系势在必行。
背景技术：
传统的获得稳定转基因阳性细胞系一般需要二个步骤，首先将目的基因插入细胞的染色体上，采用的方法主要有脂质体转染法、电转染法，然后通过筛选去除阴性细胞，富集阳性细胞，所采用的方法主要是抗性基因筛选，目前所用的抗药基因主要有G418、卡那霉素，稻瘟菌素等。脂质体转染法或电转染面临的问题主要是对细胞损伤大，所获得转基因阳性细胞较少，部分未插入到染色体上的基因在胞质内也可长期表达，造成假阳性。通过G418 筛选获得稳定的转基因阳性细胞时，由于不同得细胞及目的基因对G418的浓度要求不一样，G418的浓度需要筛选，通过长期筛选获得的阳性单克隆细胞，还需经较长时间的培养才能获得足够数量的细胞进行后续实验，同时抗性筛选获得的阳性细胞系携带有抗性基因， 具有一定的潜在的生物安全问题。慢病毒载体有3质粒或4质粒系统组成，大体可分为包装质粒、包膜质粒及穿梭质粒，通过包装获得的高滴度慢病毒颗粒不仅能感染分裂的细胞，对不分裂细胞也具有较高感染性。根据RNA病毒感染细胞的原理，只要有标记基因(如绿色荧光蛋白)的表达，说明目的基因插入染色体，所获得转基因细胞即为阳性细胞。流式细胞分选术以其分选速度快， 灵敏度高，对细胞损伤小等优点，已在科研领域得到广泛的应用，根据转基因细胞中的绿色荧光蛋白可以高效分选转基因阳性细胞。结合慢病毒及流式细胞分选技术的优点可建立一种快速获得转基因阳性细胞系的方法。
发明内容
建立的转基因阳性细胞系方法具有快速、高效、省时、省力等优点，同时该方法获得的转基因阳性细胞具有较高的活性且传代次数少，尤其对于体外培养传代次数较少的细胞，如乳腺上皮细胞，采用该方法可较快获得转基因乳腺上皮细胞。以实验中获得的肌肉生长抑制素基因沉默成纤维细胞系为例构建携带有肌肉生长抑制素基因干扰片段的慢病毒穿梭质粒载体，包装质粒、包膜质粒及穿梭质粒共转染 293T细胞，获得病毒滴度为IO8的病毒颗粒，将病毒颗粒感染密度约40 %的成纤维细胞， 48h观察绿色荧光，待细胞扩大到3-4个25cm2的培养瓶后，进行第一次流式细胞仪分选，分选后阳性率到达95%左右，分选后细胞传2代后再次进行流式细胞仪分选，即可得到纯度达99%的转基因阳性细胞(见图3)。
具体实施例方式
1、构建慢病毒穿梭质粒载体，将目的基因插入慢病毒穿梭质粒载体。3、包装病毒，将包装质粒、包膜质粒及穿梭质粒共转染293T细胞，收集上清液，浓缩病毒颗粒并进行滴度检测。4、感染成纤维细胞。将50 μ L浓缩病毒液与500 μ L完全培养基混勻，缓慢滴加到细胞密度约40%成纤维细胞中，混勻。5、3天后观察荧光，感染4天后进行传代，待细胞扩大到3-4个25cm2的培养瓶后， 进行第一次流式细胞仪分选。6、分选后的细胞传2代后，进行第二次分选。分选后的细胞扩大培养，所得细胞即为稳定遗传的转基因细胞。
权利要求
1.本发明主要是发明了一种快速获得的转基因阳性细胞的技术，这种方法是采用慢病毒载体并结合流式细胞仪分选。
2.权利1中所指的慢病毒所采用的慢病毒载体须带有荧光标记，可不带抗药基因标记。
3.根据权利1，这种方法的核心是将慢病毒感染与流式细胞技术结合。
全文摘要
一种快速建立转基因阳性细胞系的方法。本发明公布了一种快速建立转基因阳性细胞系的方法。该方法将慢病毒与流式细胞仪的优点结合起来，首先将目的基因插入带EGFP基因的慢病毒穿梭质粒中，包装病毒，浓缩病毒颗粒，将病毒颗粒感染细胞，经2次流式细胞仪分选，即可得到稳定遗传的转基因阳性细胞系，阳性率达99％。该方法不仅缩短建立阳性细胞系的时间，而且可避免抗性基因带来的潜在危害，解决了目前建转基因细胞系难的问题。该发明尤其对建立体外培养代数较少，活性差或不适合抗性筛选的转基因细胞系具有重要的实用价值，可加快转基因动物及基因功能研究。
文档编号C12N15/86GK102485886SQ20101058090
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者唐大运, 朱化彬, 林秀坤, 陈晓亮 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所