专利名称：一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片的制作方法
一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
载脂蛋白C3(Ap0lip0pr0tein C3，apoC3, apoCIII)是富含甘油三酯(TG)的脂蛋白及高密度脂蛋白(HDL)的主要成分，在调节血浆TG水平中起重要作用，与血浆TG水平呈正相关，能抑制脂蛋白脂酶的活性及肝脏对富含甘油三酯的脂蛋白(trigtyceride-rich lipoproteins,TRLs)残体的摄取，以及抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的活性等，在 TRLs代谢调节中具有重要作用。
apoC3基因长约3. 1Kb，定位于人第11号染色体长臂q23区，与载脂蛋白apoAl/ A4 (即AI/AIV)共同形成一个基因家族。apoC3基因有4个外显子，3个内含子，内含子1位于蛋氨酸起始密码上游第13与14个核苷酸之间，内含子2、3分别插入第2与第40个氨基酸密码处。随着分子生物学的发展，apoC3基因多态性尤其是胰岛素反映元件(IRE)中的限制性片段长度多态性(RFLP)与高脂血症的相关性已得到深入地研究，其RFLP的突变与血浆高甘油三酯水平有关。
本发明目标检测的apoC3基因突变位点，如表所示
序号apoC3位点突变的内容简写1SEQ ID NO. 55的第254位核苷酸，发生C — A突变C254A2SEQ ID N0. 56的第91位核苷酸，发生A — G突变A91G3SEQ ID N0. 56的第64位核苷酸，发生G — A突变G64A4SEQ ID N0. 57的第73位核苷酸，发生C — T突变C73T5SEQ ID N0. 58的第89位核苷酸，发生C — G突变C89G6SEQ ID N0. 59的第99位核苷酸，发生G — T突变G99T7SEQ ID N0. 60的第90位核苷酸，发生G — C突变G90C
目前，对apoC3基因多态性进行检测、分析的方法主要有PCR-RFLP分析法、 Taqman技术、传统固相芯片等方法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法和固相芯片技术。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测；而传统固相芯片价格昂贵，而且敏感度不高，检测结果的可重复性差。再次，基于PCR技术的检测方法(PCR-RFLP)和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法都存在着检测通量的局限性，一次只能进行一种突变的检测，不能满足实际应用的需要。发明内容
本发明的目的之一是提供apoC3基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测 apoC3基因七种常见基因型C254A、A91G、G64A、C73T、C89G、G99T和G90C的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下
一种apoC3基因SNP检测液相芯片，主要包括有
(A).针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5， 端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为针对C254A SNP位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID NO. 16、针对A91G SNP位点的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18、针对G64A SNP位点的 SEQID NO. 19及 SEQ ID N0. 20、 针对 C73T SNP 位点的 SEQ ID N0. 21 及 SEQ ID N0. 22、针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID N0. 23 及 SEQ ID N0. 24、针对 G99T SNP 位点的 SEQID N0. 25 及 SEQ ID N0. 26、和 / 或针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID N0. 27 及 SEQ IDN0. 28 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0. 1-14 ；
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID N0.四 SEQ ID N0. 42 中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为针对C254A SNP位点的SEQ ID N0. 43及SEQ IDN0. 44、 针对 A91G 和 / 或 G64A SNP 位点的 SEQ ID N0. 45 及 SEQ ID N0. 46、针对 C73TSNP 位点的 SEQ ID N0. 47 及 SEQ ID N0. 48、针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID N0. 49 及 SEQ ID N0. 50、针对 G99T SNP 位点的 SEQ ID N0. 51 及 SEQ ID N0. 52、和 / 或针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID N0. 53 及 SEQ ID N0. 54。
优选地，所述ASPE引物为由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 15组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 16组成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 17组成的序列及由 SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 18组成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ IDN0. 19组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 20组成的序列、由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 21组成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 22组成的序列、由SEQID N0. 9和SEQ ID N0. 23组成的序列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 24 组成的序列、由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 25 组成的序列及由SEQ ID N0. 12和SEQ IDN0. 26组成的序列、和/或由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 27组成的序列及由SEQ IDN0. 14和SEQ ID N0. 28组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种用于poC3基因SNP检测的特异性引物。
具体技术方案如下
一种用于poC3基因SNP检测的特异性引物，包括有针对C254A SNP位点的SEQ ID N0. 15 及 SEQ ID N0. 16、针对A91G SNP位点的 SEQ ID N0. 17 及 SEQ IDN0. 18、针对G64ASNP 位点的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20、针对 C73T SNP 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22、针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ IDNO.对、针对 G99T SNP 位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26、和 / 或针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28。
本发明的主要优点在于
1.本发明所提供的apoC3基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中，经过大量试验，反应验证，得到最优组合的液相芯片系统，所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体 ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，七种SM^s检测可通过一步多重PCR即可完成六条含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例lapoC3基因SNP检测液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
针对apoC3 基因的七种常见基因型 C254A、A91G、G64A、C73T、C89G、G99T 和 G90C 的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列” 组成。ASPE引物序列如下表所示
表lapoC3基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
CN 102533950 A
权利要求
1.一种apoC3基因SNP检测液相芯片，其特征在于主要包括有(A).针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的 tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为针对C254A SNP位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID NO. 16、针对A91G SNP位点的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18、针对G64A SNP 位点的 SEQID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20、针对 C73T SNP 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22、针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24、针对 G99T SNP 位点的 SEQID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26、和 / 或针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ IDN0. 28 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. 1-14 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 29 SEQ IDN0. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的apoC3基因SNP检测液相芯片，其特征在于，所述扩增引物为针对 C254A SNP 位点的 SEQ ID NO. 43 及 SEQ ID NO. 44、针对 A91G 和 / 或 G64A SNP 位点的 SEQ ID NO. 45 及 SEQ ID NO. 46、针对C73T SNP位点的 SEQ ID NO. 47 及 SEQ IDN0. 48、 针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID NO. 49 及 SEQ ID NO. 50、针对 G99T SNP 位点的 SEQ ID N0. 51 及 SEQ ID N0. 52、和 / 或针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID N0. 53 及 SEQ IDN0. 54。
3.根据权利要求1所述的apoC3基因SNP检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE引物为由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 15组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 16组成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 17组成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 18组成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 19组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ IDN0. 20 组成的序列、由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 21组成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 22组成的序列、由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 23组成的序列及由SEQ IDN0. 10和SEQ ID NO. M组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 25组成的序列及由SEQ ID N0. 12和 SEQ ID N0. 26组成的序列、和/或由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 27组成的序列及由SEQ ID N0. 14和SEQ ID N0. 28组成的序列。
4.根据权利要求1所述的apoC3基因SNP检测液相芯片，其特征在于，(A).所述ASPE引物为由SEQID NO. 1和SEQ ID N0. 15组成的序列及由SEQ IDN0. 2 和SEQ ID N0. 16组成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 17组成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 18组成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 19组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 20组成的序列、由SEQ ID N0. 7和SEQ IDN0. 21组成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 22组成的序列、由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 23组成的序列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. M 组成的序列、由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 25 组成的序列及由 SEQ ID N0. 12 和 SEQ ID N0. 26 组成的序列、和由 SEQ ID N0. 13 和 SEQ ID N0. 27 组成的序列及由SEQ ID N0. 14和SEQID N0. 28组成的序列；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID N0. 29 SEQ IDN0. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与㈧中所选的tag序列互补配对；(C).所述扩增出引物为针对 C254A SNP 位点的 SEQ ID N0. 43 及 SEQ ID N0. 44、针对 A91G 和 G64A SNP 位点的 SEQ ID NO. 45 及 SEQ ID NO. 46、针对 C73T SNP 位点的 SEQ ID NO. 47 及 SEQ ID NO. 48、 针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID NO. 49 及 SEQ IDN0. 50、针对 G99T SNP 位点的 SEQ ID NO. 51 及 SEQ ID NO. 52、和针对 G90C SNP 位点的 SEQ ID NO. 53 及 SEQ ID NO. 54。
5.根据权利要求1-4任一项所述的apoC3基因SNP检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5-10个T。
6.一种用于apoC3基因SNP检测的特异性引物，其特征在于，包括有针对C254ASNP位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID NO. 16、针对A91G SNP位点的SEQ ID NO. 17及SEQ ID NO. 18、 针对 G64A SNP 位点的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20、针对 C73TSNP 位点的 SEQ ID N0. 21 及 SEQ ID N0. 22、针对 C89G SNP 位点的 SEQ ID N0. 23 及 SEQ ID N0. 24、针对 G99T SNP 位点的 SEQ ID N0. 25 及 SEQ ID N0. 26、和 / 或针对G90C SNP 位点的 SEQ ID N0. 27 及 SEQ ID N0. 28。
全文摘要
本发明公开了一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物分别为针对C254A SNP位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16、针对A91G SNP位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、针对G64A SNP位点的SEQID NO.19及SEQ ID NO.20、针对C73T SNP位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、针对C89G SNP位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对G99T SNP位点的SEQ IDNO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对G90C SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的apoC3基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。
文档编号C12Q1/68GK102533950SQ20101059099
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者孙贤标, 朱泽尧, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司