专利名称：通过用自体血清培养自体角质形成细胞和成纤维细胞来生产用于生成皮肤的自体皮肤片 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于形成皮肤敷料或片的方法，所述皮肤敷料或片用于对患者中的皮肤损失进行覆盖、使其治愈、结斑、减轻。特别地，本发明涉及用于在实验室中实施的生产皮肤的方法。
背景技术：
目前，深度烧伤以及由不同创伤或疾病引起的其他皮肤组织损失造成皮肤损伤， 这些损伤需要对这些区域进行护理覆盖。已经用直接获自患者自身皮肤的皮肤移植物实施这种覆盖。该方法尽管有效，但在获得所述移植物的区域(大腿、背部、臀部)中产生显著的瘢痕(照片I)。此外，该方法必须在实施了全麻或局麻的外科手术中进行，这产生了任何外科手术所固有的并发症，例如严重的疼痛、感染、以及出血、新的手术、以及死亡(尽管百分率非常低)。此外，这还意味着较高的额外经济花费，例如住院、为治愈而进行的会诊、 治疗供体区域的瘢痕、用于手术的特殊材料以及将患者转移到更综合的医院，等。
皮肤撕脱伤造成对皮肤上皮组织的损伤，导致细胞损失，其在体内条件中被用成纤维细胞(其充当饲养层(alimentadora))产生的纤维基质替换。有多个报道涉及角质形成细胞培养物用于构建皮肤再生片，所有这样的报道都述及供体所提供的或来自尸体的细胞(异体的)，这意味着对供体和受体两者实施多项研究，培养在胎牛血清中，这使得该产品昂贵且在发展中国家中不可行，因此，角质形成细胞培养物在患者自身的血清(自体的) 中发育，在作为饲养层的同一患者的成纤维细胞(自体的)上，并且使用同一患者的角质形成细胞(自体的)，因此当覆盖出血的区域时避免了免疫和排斥反应，因此提高了侵袭性过程中皮肤的生存力，并且通过该方法在非常短的时间内获得了完全的上皮化(皮肤生长)， 结果良好且成本很低。
因此，用于覆盖受影响区域的替代机制一直是世界范围内的研究目标。在该范围内，用于生成皮肤的方法尤为突出，其允许替换损失的皮肤并且避免整个前述创伤。到目前为止，已使用来自尸体的细胞开发了此类方法，但该方法有一些缺陷，因为使用来自尸体的细胞在很多情况中产生免疫反应，这可产生组织排斥和令人不太满意的结果。此外，这些方法的成本是非常高的，因为使用来自尸体的皮肤意味着实施多种免疫相容性检查等，以排除接触传染病(例如HIV和肝炎)的可能性。
发明简述
自2008年起，一组外科医生和整形外科医生开始了这样的任务寻找用于生成皮肤而又避免前述并发症的方法。因此，他们决定研究这样的方法由受影响者的非常小份 (3mm)的皮肤生成皮肤，因此确保了使用所培养组织的益处并且避免了不相容风险、高成本和额外疤痕的缺点。
我们由取自患者皮肤的细胞生成皮肤的方法的优点对于全世界的科学以及整形外科和医学的未来具有非常重要的意义。其中，重要的是突出以下优点
1.该方法不生成除皮肤损伤以外的额外疤痕，因为从患者中尽可能少地且从不可见的位置取出皮肤。
2.不引起患者的创伤，因此不产生疼痛。
3.不具有免疫排斥问题，因为所使用的组织取自同一患者。
4.不需要将该方法作为手术实施。
5.该方法可由任何专业的护士和医生来操作。
6.治疗患者的医院不必要求用于取皮肤的特殊材料(称为取皮机(Dermatome)) 及其切割仪器，因为仅可使用一次，所以它们成本不利。这些产品对于本发明的皮肤培养方法来说不是必须的。
7.生产成本比来自尸体的皮肤便宜约80%，并且美学结果要好得多。
8.生产和经销成本比在20X20cm面积上外科操作的成本低50%。
经过基本的培训之后，该方法在世界上任何地方(包括发展中国家)都是可重复的，因为所有所使用的材料是任何实验室中常用且基本的那些。
下文中给出的简要比较分析将显示鉴于本发明的多个实施方案的现有技术。所述分析的目标是突出本发明的优点，其赋予用于获得请求保护之专利主题的必要特征。
有充足的文献说明现有技术，其中很详细地描述了所使用的方法并且以所引用的文献为基础，可与实现上述公开结论的本发明进行详细的比较。下文中将给出所述参考文献，其可供参考。
自很久以前就开发了用于细胞培养物的不同方法，所述细胞培养物用作出血皮肤区域的覆盖物和/或皮肤代用品。本发明产品的新颖性在于使用同一患者的血清(自体的)由自体细胞产生，在仅三天内获得皮肤的层。在另一种方法中，我们发现
1.人皮肤等同物
A.供体或尸体细胞培养物
该方法不同于本发明中所开发的方法，在于样品由尸体或供体的皮肤部分提供， 并且通过低温和防腐处理需要多种化学物质和化合物，储存冷冻的皮肤部分用于以后在对其有需要的患者中应用。这需要对供体和患者的免疫研究以降低排斥风险。主要差异在于
权利要求
1.一种利用皮肤产生片或敷料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤I-*第0天A-获得自体皮肤和血液样品；B-消化所述皮肤18小时；C-从患者的血液中获得自体血清；II-*第1天D-将自体皮肤的两层分离；E-将在消化之后获得的获自自体皮肤浅表层的角质形成细胞在自体血清中培养和复 制 72h ；F-培养和复制在消化之后所产生的获自深层的自体成纤维细胞；III-*第 2 天G-更换自体角质形成细胞的培养基；IV-*第3天H-将成纤维细胞接种在胶原网上；I-将所培养的角质形成细胞在成纤维细胞和胶原网上接种24h ；V-*第4天J-获得用于将其自身放置在对其有需要的个体上的最终产品例如皮肤片或敷料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤I-A包括以下步骤.1.从患者获得皮肤样品，其具有2mm2至4mm2、优选3mm2的面积和0.30mm至0. 65mm的厚度，.2.从需要所述(自体的)皮肤的个体获得量为约20 50cm3的血液样品。
3.根据权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于所述步骤I-B包括以下步骤.3.用约2cm3至10cm3磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗所获得的皮肤样品；.4.在4°C下将所述自体皮肤样品在0.25%胰蛋白酶溶液中放置18小时。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-C包括以下步骤.5.将所述自体血液样品以1200rpm离心10分钟，获得10cm3至25cm3血浆；.6.在4°C下储存所述血浆；.7.通过添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)、2cm3 至5cm3磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.5cm3至2cm3 10, 0001. U.青霉素、10mg硫酸链霉素以及 25/-lg两性霉素B使所应用的胰蛋白酶失活。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-D包括以下步骤.8.随后在镊子的帮助下将自体皮肤(外植体)分离成两层浅表的表皮和包含胶原纤 维的深层真皮；.9.用磷酸盐缓冲溶液(PBS)分别清洗所述外植物(两个皮肤层)多次(3至10次)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-E包括以下步骤.10.将皮肤的浅表部分收集在无菌管中；.11.将所述管以1200rpm离心10分钟；.12.弃去上清液；.13.将所产生的细胞沉淀重悬于5cm3至10cm3DMEM-HG培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基_高葡萄糖)中；.14.将包含在该液体中的细胞以约75，000至90，000个细胞/cm2的密度接种在无菌盒中；.15.通过在Neubawer室中进行细胞计数来核实细胞密度；.16.将所接种的细胞(角质形成细胞)在37°C下储存24小时。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-F包括以下步骤 10’ -在步骤9之后，将在消化之后获得的自体皮肤的深部接种到无菌盒中；.11’ -添加2cm3至5cm3DMEM_HG (Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)和2cm3至 5cm3从需要皮肤之个体的血液中获得的血浆；.12’ -将所得物在37°C下储存48小时以使成纤维细胞生长；.13’ -在48小时之后将所接种和储存的成纤维细胞提取并放置在无菌管中；.14，-将所述管以1200rpm离心10分钟；.15’ -弃去上清液；.16’-向细胞沉淀中添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄 糖)和2cm3至5cm3从需要皮肤之个体的血液中获得的自体血浆。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-G包括以下步骤.17.储存24小时之后提取角质形成细胞培养物的培养液或培养基；.18.再次应用2cm3至5cm3DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)以及 lcm3至10cm3自体血衆(源自患者的血液)；.19.再次在37°C下储存24小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-H包括以下步骤.20.将步骤16’中所获得的产品接种在所需大小的胶原网上；.21.核实自体成纤维细胞具有90%融合；.22.将该网置于振动台上最少4小时；.23.再次在37°C下储存最少20小时。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-I包括以下步骤.24.在更换培养基并对其进行储存24小时之后，使用2cm3至10cm3磷酸盐缓冲溶液 (PBS)从所述盒中分离角质形成细胞；.25.将具有细胞的该液体放置在无菌管中并以1200rpm离心10分钟；.26.弃去由离心所产生的上清液；.27.将细胞沉淀重悬于5cm3至10cm3自体血浆中；..28.将浸入血浆中的角质形成细胞接种到成纤维细胞和胶原网上，同时核实它们具有 250，000个细胞/cm2的密度；.29.将所接种的细胞在37°C下储存24小时；.30.然后观察融合和细胞在胶原敷料上的附着从而获得充足的自体组织皮肤层。
11.一种片或敷料，其特征在于其包含网基质，在所述网基质上放置胶原，随后放置角 质形成细胞并且随后放置成纤维细胞。
12.根据权利要求11所述的片或敷料，其特征在于使用权利要求1至10中任一项的方 法产生所述角质形成细胞和成纤维细胞。
全文摘要
该方法一般是基于从患者取皮肤样品和血液样品并且基于这两种要素培养皮肤，置于胶原片上以产生敷料，随后将所述敷料置于对其有需要的患者上。
文档编号C12N5/071GK103003415SQ201080067724
公开日2013年3月27日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者胡安·卡洛斯·桑布拉诺比格尔, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高纳席尔瓦 申请人:罗德里戈·福西翁·索托帕雷哈, 胡安·卡洛斯·桑布拉诺比格尔, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高纳席尔瓦