专利名称：一种高活性蚓激酶的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化学制药领域，具体涉及一种高活性蚓激酶的制备方法。
背景技术：
餐厨垃圾如何处理是一道难题，同时也是制约城市发展的问题，解决餐厨垃圾混乱处理的问题迫在眉睫。据统计，2000年我国餐厨垃圾产生量为4500万吨，并且以每年约 10%的速度递增，年新增餐厨垃圾达500万吨。而目前我国大多数城市对餐厨垃圾的管理基本处于空白，处于排放单位自行处置的状态。这直接导致了餐厨垃圾产生三个主要流向 其一，大部分未经处理，被收集起来直接养鸡喂猪；其二，少部分餐厨垃圾被人拉去提炼“潲水油”重返餐桌；其三，部分餐厨垃圾没有经过分类，和其他城市生活垃圾混在一起进入垃圾收运体系或者直接倒进城市排污系统。蚯蚓是一种杂食性的环节动物，它在自然生态系统中具有促进物质分解转化的功能。大量的实验研究表明，蚯蚓在其新陈代谢过程中能吞食大量有机物质，并将其与土壤混合，通过砂囊的机械研磨和肠道内的生物化学作用进行分解和转化。有机物质在蚯蚓消化道分泌的各种生物酶(蛋白酶、脂肪分解酶、纤维素酶、甲壳酶和淀粉酶)和微生物的联合作用下，能水解为易于同化的碳水化合物、脂肪、蛋白质以及较稳定的纤维素和几丁质，并使矿物质发生一定程度的分解，并进一步被转化为植物易于利用的简单化合物，如氨、碳酸和易矿化的尿素、尿嘌呤以及速效性的磷钾矿质养分。同时，通过蚯蚓在有机物料中的运动还可以改进物料中的水汽循环，使得物料和其中的微生物得以运动、相互混合，从而加强蚯蚓和微生物对物料处理的协同作用。蚯蚓的吞食量很大，1亿条蚯蚓一天可吞食40-50t垃圾，排出20t蚯蚓粪。蚯蚓在中医上又称地龙，在我国传统的中医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、定惊、利尿、降压等功效。蚯蚓体内的蛋白质含量非常丰富，且具有人体所需的10种氨基酸， 其含量和营养价值都很高，甚至超过大豆蛋白。蚯蚓体内的不饱和脂肪酸含量高，尤其是亚油酸，其具有抗癌、降血压、防止动脉硬化的作用。此外维生素和微量元素含量也很丰富，蚯蚓的药用价值已成为人们研究的热点。目前研究的最多的是蚯蚓体内的酶，包括其中的蚓激酶、血纤蛋白溶酶(也叫纤溶酶)、胶原蛋白酶等。蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤维酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用。在临床上，该酶可口服后经肠胃进入血液，同时可降低血液粘滞度、改善微循环。 对缺血性心脑血管病、陈旧性血栓病、高血压、动脉硬化、心肌梗塞等具有良好治疗作用，尤其对因脑血管病导致的肢体瘫痪及语言障碍的恢复效果显著。其特点是稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、口服有效、副作用小，许多国内外科研机构都在致力于这类新的溶栓酶新药的开发。蚓激酶在我国于1992年投入临床应用，目前已有多种蚓激酶制剂应用于临床，主要为各种胶囊制剂，如普恩复、百奥、博洛克、溶栓胶囊等，多用在心脑血管疾病方面。同时由于蚓激酶可改善血液流变、降低血小板聚集率，所以也用在与血液流变学相关的一些疾病中，如美尼尔病、突发性耳聋、肺心病、视网膜静脉阻塞等都有一定的疗效。根据目前临床应用结果显示，服用蚓激酶产品的患者都无不良反应。所以蚓激酶是一种安全、有效地溶栓制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活性蚓激酶的制备方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种高活性蚓激酶的制备方法，包括以下步骤(如图1所示)(1)将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，捣碎，过滤取滤液，得到蚯蚓粗蛋白溶液，再进行离心，取上清液；(2)将步骤(1)所得上清液进行超滤，得到粗酶液；(3)向粗酶液中加入硫酸铵，使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到20-45%，静置 3. 5-4h，然后离心，取上清液；往上清液中继续加入硫酸铵，使上清液中硫酸铵的饱和度增加到50-75%，静置3. 5-4h，然后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；(4)将酶液上kphadex G_25柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液；(5)将步骤(4)得到的洗脱液上DEAE-纤维素柱，然后用0. IM的NaCl溶液进行淋洗，再用0. 1-0. 6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液，得到高活性蚓激酶；步骤( 得到的合并洗脱液进行冷冻干燥，得到高活性蚓激酶干粉；步骤(1)所述蚯蚓是赤子爱胜蚓(Eisenia faetida)，用餐厨垃圾干粉饲养；步骤(1)和(3)所述磷酸盐缓冲液(PBS)的pH值为7. 8，浓度为lOOmmol/L，加入前在4°C预冷；步骤(1)所述磷酸盐缓冲液(PBS)按与蚯蚓1 1的体积质量比加入；步骤(1)所述过滤是用四层纱布过滤；步骤(1)或(3)所述离心是40CT 6000rpm 离心 10_15min ；步骤(2)所述超滤采用STM-DGM多功能膜分离系统(其能截留分子量大于IOkD 的分子)，工作温度:25-280C，料液pH值7. 8，压强0. 5-0. 7MPa,膜通量:9_12L/ (m2· h)，浓缩比5. 0 1-5. 2:1;步骤(3)所述操作是在4°C下进行；步骤(4)所述将酶液上柱，上样量不超过柱床体积的20%，下限值是柱床体积的 10% ；步骤⑷和(5)所述洗脱的流速为2ml/mim ；步骤(4)所述磷酸盐缓冲液的pH值为7. 8，浓度为5mmol/L ；步骤(5)中所述步骤(4)得到的洗脱液，是先在4°C放置5min，然后再上DEAE-纤维素柱；步骤(5)所述DEAE-纤维素柱，预先用pH值7. 8、0. OlM的磷酸盐缓冲液平衡；
步骤(5)所述DEAE-纤维素柱是 DEAE-Cellucose-52。由上述方法制备得到的蚓激酶，分子量在20_30kD之间，比酶活42000U/mg。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明以餐厨垃圾干粉喂养蚯蚓，再从蚯蚓中提取蚓激酶，实现了餐厨垃圾资源化利用和附加值的转移。(2)本发明以蚓激酶工业化生产为目的，对传统的酶分离纯化方法进行改进优化， 采用温和高效的生化分离新技术，如离心、超滤、盐析技术、超分子筛层析、离子交换层析等，能够显著提高蚓激酶的纯度，提取纯化的蚓激酶比酶活达42000U/mg，达到制药用酶的要求。(3)本发明方法具有操作简便、成本低廉等特点，易于工业化放大生产，且原料与操作过程中均无有害物质加入，使用安全。
图1是本发明的高活性蚓激酶的制备方法的流程示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1—种高活性蚓激酶的制备方法，包括以下步骤(如图1所示)1)用餐厨垃圾干粉为原料饲养赤子爱胜蚓；2)新鲜蚯蚓洗净按1 1 (w/v)加入4°C预冷的IOOmmol/L PBS (ρΗ7· 8)，于高速组织捣碎机捣碎，四层纱布过滤取滤液，得粗蛋白溶液。放置10min，6000rpm，4°C离心lOmin，
去沉淀，留上清液；3)上清液经泵加压进入STM-DGM多功能膜分离系统(其能截留分子量大于IOkD 的分子)，工作温度25 °C，料液pH值7. 8，压强0. 5MPa,膜通量12L/(m2. h)，浓缩比 5.0 1，超滤后得到粗酶液；4)在4°C条件下，向粗酶液中添加固体硫酸铵，使其饱和度达到20%，静置3. 5h， 6000r/min离心lOmin，取上清液；一次盐析后的上清液中继续添加硫酸铵，使其饱和度达到50%，静置4h,6000r/min离心15min，收集沉淀，用pH7. 8,0. lmol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；5)用蠕动泵将溶解的酶液缓慢泵入柱(S^hadex G-25柱)内(样品体积不超过柱床体积20% )。以5mmol/L PBS (pH7. 8)为洗脱液，流速为2ml/mim，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液；6)收集的蛋白液在4°C放置5min，上预先用0. OlM磷酸缓冲液(pH7. 8)充分平衡的DEAE-纤维素柱(DEAE-Cellucose-52)，用蠕动泵缓慢泵入柱内，然后用0. IM的NaCl溶液进行淋洗，再用0. 1-0. 6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为aiil/min，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液，得到高活性蚓激酶；实施例2一种高活性蚓激酶的制备方法，包括以下步骤(如图1所示)1)用餐厨垃圾干粉为原料饲养赤子爱胜蚓；2)新鲜蚯蚓洗净按1 1 (w/v)加入4°C预冷的IOOmmol/L PBS (ρΗ7· 8)，于高速组织捣碎机捣碎，四层纱布过滤取滤液，得粗蛋白溶液。放置10min，6000rpm，4°C离心lOmin，
去沉淀，留上清液；3)上清液经泵加压进入STM-DGM多功能膜分离系统(其能截留分子量大于IOkD 的分子)，工作温度27 °C，料液pH值7. 8，压强0. 7MPa,膜通量12L/(m2. h)，浓缩比 5.2 1，超滤后得到粗酶液；4)在4°C条件下，向粗酶液中添加固体硫酸铵，使其饱和度达到30%，静置3. 7h， 6000r/min离心lOmin，取上清液；一次盐析后的上清液中继续添加硫酸铵，使其饱和度达到60%，静置3. 8h,6000r/min离心15min，收集沉淀，用pH7. 8,0. lmol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；5)用蠕动泵将溶解的酶液缓慢泵入柱(S^hadex G-25柱)内(样品体积不超过柱床体积20% )。以5mmol/L PBS (pH7. 8)为洗脱液，流速为2ml/mim，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液；6)收集的蛋白液在4°C放置5min，上预先用0. OlM磷酸缓冲液(pH7. 8)充分平衡的DEAE-纤维素柱(DEAE-Cellucose-52)，用蠕动泵缓慢泵入柱内，然后用0. IM的NaCl溶液进行淋洗，再用0. 1-0. 6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为aiil/min，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液，得到高活性蚓激酶；实施例3一种高活性蚓激酶的制备方法，包括以下步骤(如图1所示)1)用餐厨垃圾干粉为原料饲养赤子爱胜蚓；2)新鲜蚯蚓洗净按1 1 (w/v)加入4°C预冷的IOOmmol/L PBS (ρΗ7· 8)，于高速组织捣碎机捣碎，四层纱布过滤取滤液，得粗蛋白溶液。放置10min，6000rpm，4°C离心lOmin，
去沉淀，留上清液；3)上清液经泵加压进入STM-DGM多功能膜分离系统(其能截留分子量大于IOkD 的分子)，工作温度 °C，料液pH值7. 8，压强0. 7MPa,膜通量9L/(m2. h)，浓缩比 5.2 1，超滤后得到粗酶液；4)在4°C条件下，向粗酶液中添加固体硫酸铵，使其饱和度达到45%，静置4h， 6000r/min离心lOmin，取上清液；一次盐析后的上清液中继续添加硫酸铵，使其饱和度达到75%，静置3. 5h,6000r/min离心15min，收集沉淀，用pH7. 8,0. lmol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；5)用蠕动泵将溶解的酶液缓慢泵入柱(S^hadex G-25柱)内(样品体积不超过柱床体积20% )。以5mmol/L PBS (pH7. 8)为洗脱液，流速为2ml/mim，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液；6)收集的蛋白液在4°C放置5min，上预先用0. OlM磷酸缓冲液(pH7. 8)充分平衡的DEAE-纤维素柱(DEAE-Cellucose-52)，用蠕动泵缓慢泵入柱内，然后用0. IM的NaCl溶液进行淋洗，再用0. 1-0. 6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为aiil/min，自动部分收集器收集，每管10ml。用紫外分光光度计测定每管洗脱液OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管蛋白液，得到高活性蚓激酶；以纤维蛋白平板法测定实施例1-3所得高活性蚓激酶的酶活。实施例1-3所得高活性蚓激酶的酶活分别为41590U/mg、42100U/mg、41820U/mg。以梯度电泳法测定实施例1-3所得高活性蚓激酶的分子量大小。实施例1-3所得高活性蚓激酶的分子量在20-30kD之间。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液，捣碎，过滤取滤液，得到蚯蚓粗蛋白溶液，再进行离心，取上清液；(2)将步骤(1)所得上清液进行超滤，得到粗酶液；(3)4°C下，向粗酶液中加入硫酸铵，使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到20-45%，静置 3. 5-4h，然后离心，取上清液；往上清液中继续加入硫酸铵，使上清液中硫酸铵的饱和度增加到50-75%，静置3. 5-4h，然后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；(4)将酶液上kphadexG_25柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液；(5)将步骤(4)得到的洗脱液上DEAE-纤维素柱，然后用0.IM的NaCl溶液进行淋洗， 再用0. 1-0. 6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD28tlnm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液，得到高活性蚓激酶；步骤(4)和(5)所述洗脱的流速为2ml/mim。
2.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)所述蚯蚓是赤子爱胜蚓。
3.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)和(3)所述磷酸盐缓冲液的PH值为7. 8、浓度为lOOmmol/L，加入前在4°C预冷。
4.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)所述磷酸盐缓冲液按与蚯蚓11的体积质量比加入。
5.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)所述过滤是用四层纱布过滤。
6.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)或(3)所述离心是在4°C下6000rpm离心10_15min。
7.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(2)所述超滤采用STM-DGM多功能膜分离系统，工作温度25- °C，料液pH值7. 8，压强 0. 5-0. 7MPa，膜通量9-12L/(m2. h)，浓缩比5. 0 1-5.2 1。
8.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(4)所述磷酸盐缓冲液的PH值为7. 8、浓度为5mmol/L。
9.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于步骤(5)所述 DEAE-纤维素柱是 DEAE-Cellucose-52。
全文摘要
本发明公开了一种高活性蚓激酶的制备方法，其包括以下步骤(1)将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液，捣碎，过滤取滤液，再离心，取上清液；(2)超滤，得到粗酶液；(3)硫酸铵分级沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；(4)将酶液上Sephadex G-25柱纯化；(5)再上DEAE-纤维素柱纯化，得到高活性蚓激酶。本发明以餐厨垃圾干粉喂养蚯蚓，再从蚯蚓中提取蚓激酶，实现了餐厨垃圾资源化利用和附加值的转移；对传统的酶分离纯化方法进行改进优化，提取纯化的蚓激酶比酶活达42000U/mg，达到制药用酶的要求；本发明方法具有操作简便、成本低廉的特点，易于工业化放大生产。
文档编号C12N9/48GK102242099SQ20111010321
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者张涛, 张璋, 彭乐, 林盛, 梁学世, 武佳韵, 潘淦, 王高锋, 芦双, 虞为, 赵盼盼, 邓金鹏, 郭文康, 陈世文, 陈孔亮, 陈纯纯, 马广智, 高艳明, 黄儒强, 黄陈玲 申请人:华南师范大学