专利名称：一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌，具体涉及一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。
背景技术：
一、L-鸟氨酸的生理功能和医疗保健价值L-鸟氨酸是一种非蛋白质氨基酸，是生物体合成精氨酸、脯氨酸等蛋白质氨基酸的前体材料。L-鸟氨酸又是生物合成多胺的材料，最普遍重要的多胺是腐胺，尸胺，亚精胺， 精胺。它们有促进生物组织生长和维持膜的正常状态的重要作用。由于多胺的带正电荷氨基能和DNA或者RNA的带负电荷磷酸基结合，促进植物细胞以及动物细胞中DNA转录和 mRNA的翻译；它们和膜蛋白质或磷脂结合，保持膜的稳定性。L-鸟氨酸在脲循环中起重要作用，在脲循环代谢中接受二个NH4+离子和一分子的 CO2,形成一个L-精氨酸分子，在精氨酸酶的作用下，精氨酸被水解成鸟氨酸和尿素，尿素被排出生物体外起到排除血氨的重要生理功能，而鸟氨酸又可以接受血液中的两个NH/1离子和一分子的CO2,形成新的L-精氨酸分子，周而复始的行使排除血氨的功能。L-鸟氨酸是已经研究过的能够刺激脑垂体诱导释放生长激素的最有效能的氨基酸，生长激素能够促进脂肪代谢，肌肉生长和肝细胞的再生，有利皮肤和组织伤口的愈合和修复。研究显示，鸟氨酸能够促进胸腺、肝脏和心脏组织的再生、加强肌肉的生长，增强免疫系统的功能。临床应用研究表明L-鸟氨酸盐对外科手术、烧伤病人、普通感染性疾病和肿瘤癌症的治疗有明显好处，L-鸟氨酸制剂对急性病人的恢复、对肝脏疾病、肝硬化病人的治疗有积极意义。研究表明，运动员补充L-鸟氨酸制品，肌肉运动质量和强度在五周后会有显著提高。由于体育锻炼和剧烈体力活动产生较多血氨，引起肌体疲劳，而L-鸟氨酸能够吸收血氨抑制疲劳，从而成为运动员和体力劳动者的常用营养补充剂。长时间以来，国际医药市场上流行的保肝护肝药品——鸟氨酸天门冬氨酸复合盐注射液，具有一定的销售规模，L-鸟氨酸是制备各种鸟氨酸药品保健品的基本原料，其需求量稳定且年年都有-定幅度的上升。二、L-鸟氨酸盐酸盐的生产方法L-鸟氨酸的生产方法有微生物发酵法和L-精氨酸弱碱水解法以及L-精氨酸酶水解法。1931年，Vickery, H. B.，和CookC. A.，发表了实验室中利用肝脏精氨酸酶制备鸟氨酸的论文(J. Biol. Chem.，94，393 (1931))。中国专利(申请[公开]号CN101323866A)公开了一种使用改造了的谷氨酸棒杆菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法，葡萄糖的转化率为33%，发酵时间56小时，产酸率可以达到5 7%，收率70 80%。中国专利(申请[公开]号CN100340M2C)公开了一种使用弱碱法(石灰乳)水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，水解液中精氨酸的浓度为10%，产品的收率可以达到 78 82%。中国专利(申请[公开]号CN1908177A)公开了一种使用微生物酶法(粪肠球菌精氨酸酶)水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，培养微生物时间36小时，发酵水解精氨酸时间44小时，水解液中精氨酸的浓度为12 15%，每升转化液中鸟氨酸的含量可以达到 90 112克。由于我国是一个水解法生产胱氨酸和精氨酸的强国，精氨酸的成本低廉，利用 L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸比起发酵法的生产成本更为经济，但是，化学水解法往往引起L-鸟氨酸消旋，采用弱碱水解法制备L-鸟氨酸，是用硫酸沉淀去除弱碱金属离子的，生成的硫酸盐往往过滤困难，而且会产生一定的固体废物。发酵法生产L-鸟氨酸盐酸盐的産酸率不高，且伴随着产生少量的其他氨基酸，而酶法生产L-鸟氨酸则可以克服化学水解法以及发酵法的弊端，且底物浓度高(15% )，不产生杂酸(其他氨基酸)，更利于产物的回收和精制。
发明内容
本发明目的是提供一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。构建的大肠杆菌工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No. M2010358,保藏物名称大肠杆菌T0P10/PBAD/Thio-T0P0-Arg-Bsub，拉丁语名称Escherichia coli, TOP 10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub保藏单位地址中国.武汉.武汉大学保藏日期2010年12月22日。本发明中的“T0P10/PBAD/Thio-T0P0-Arg-Bsub”，也可以按照 “TOPlO/pBAD/ Thio-TOPO-arg-Bsub”来表示，其中的大小写的区别不会导致矛盾，它们之间可以互相更换该培养物的培养条件、检测存活性条件培养基含100 μ g/ml Amp LB培养基，pH 7. 0，培养温度37°C。该培养物由如下方式得到枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No. 93009)中的精氨酸酶编码基因序列(arg-Bsub)，与pBAD/Thio-TOPO载体连接后，转化大肠杆菌T0P10。保存该培养物最适宜的方法冷冻真空干燥法该大肠杆菌工程菌能够有效的催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。本发明提供的构建高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因工程菌的技术方案是构建一种重组质粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)，该重组质粒携带枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因的编码序列(简写为arg-Bsub，注精氨酸酶基因简写为arg，枯草杆菌， Bacillus Subtilis，简写为Bsub，精氨酸酶基因简写为arg-Bsub)。用该重组质粒转化大肠杆菌T0P10，通过抗生素筛选得到阳性转化菌株，测定阳性菌株的精氨酸酶的活性，筛选出精氨酸酶高表达菌株，利用高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌株催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。具体步骤是构建所述的重组质粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)和转化宿主菌大肠杆菌T0P10。该培养物的培养条件和保存方法分别是培养基LB培养基，称取IOg蛋白胨、5g酵母粉与IOgNaCL溶于950ml的水中，调 PH至7. 0后，加水定容到1000ml，分装成IOOml份的三角瓶备用含100 μ g/ml Amp的3. 5mlLB培养基试管取分装有LB培养基的三角瓶，盖上瓶塞，121°C灭菌20min，待温度降至40°C以下时，加入5%的Amp储存液200 μ 1，混勻后立即无菌分装3. 5ml培养基到已灭好菌的玻璃试管，得到含100 μ g/ml Amp的3. 5mlLB培养基
试管，用于工程菌株的试管培养；含100 μ g/ml Amp的LB培养基玻璃平板取分装有LB培养基的三角瓶，分别称取1. 5g琼脂粉加进含IOOmlLB培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，121 °C灭菌20min，待温度降至 450C以下时，加入5%的Amp储存液200 μ 1，混勻后立即分装15_18ml培养基到已灭好菌的玻璃平板中，待培养基凝固后，置于4°C的冰箱中保存备用；菌株培养条件和保存方法把构建和筛选出来的工程菌株，涂布在含IOOyg/ mlAmp的LB培养基的玻璃平板上，37 °C培养，将平板上长出的单菌落接种到含IOOyg/ mlAmp的3. 5mlLB培养基试管中，pH7. 0，37°C，225r/min,振荡培养过夜，9小时，用灭菌吸管吸取0. 85ml细菌培养液，添加到灭菌的含有0. 15ml甘油的试管中，混勻，低温保存；长期保存方法冷冻真空干燥法。1.材料与试剂1. 1.遗传资源感受态大肠杆菌T0P10菌种(Escherichia coli T0P10)，购自武汉天源生物技术公司。线性TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO，购自武汉天源生物技术公司。枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)来自中国典型培养物保藏中心CCTCC(武汉大学)，保藏号 CCTCC No. 93009。登录GenBank，通过 GeneID :937760 获取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis) 168 菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列。1. 2其他材料与试剂提取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No. 93009)细菌基因组DNA所用得的试剂，DNA molecular weight marker，缓冲液，溶菌酶，RNase，蛋白酶K等，购自基因有限公司。其它化学常规试剂均为分析纯试剂。TaqDNA聚合酶、反应缓冲液，购自武汉天源生物技术公司。2.构建基因工程菌大肠杆菌TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub的具体步骤2. 1.设计合成一对TA克隆引物登录GenBanK，通过GeneID :937760获取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis) 168 菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列，据此，利用I^rimerer 5. 0软件设计一对扩增888bp精氨酸酶基因DNA序列，用于pBAD/Thio-TOPO载体TA克隆所需的引物，pi、p2。 (引物由英潍捷基[Irwitrogen](上海)贸易有限公司合成。)
ρ1 5‘ -GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3‘，共 26bp。p2 5' -GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3‘，共 23bp。2. 2.提取枯草芽孢杆菌基因组DNA采用改进的I^lva I等人的方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA。(I^aiva， I. Molecular coloning of a-amylase gene from Bacillus amylolique faciens and its expression in B. subtil is[J]. Gene, 1982,19 :81-87)(1).挑取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No. 93009)菌株平板培养的单个菌落，接种到装有IOml牛肉膏，蛋白胨液体培养基的试管中，32°C振荡培养12小时。(2). 5000rpm离心lOmin，得到菌体沉淀，STE洗涤1次，再次离心，菌体重悬于 4mlTE溶液中。(3) ·加入50mg/ml溶菌酶溶液8μ 1(终浓度为100 μ g/ml)，37°C保温20min。再加入 RNase (10mg/ml) 10 μ 1，至终浓度 25 μ g/ml，然后加入 10% SDS 溶液 0. 5ml，37°C保温 30min。加入蛋白酶 K(20mg/ml)10y 1，终浓度为 50 μ g/ml，37°C保温 60min。(4).再加入等体积的水饱和酚，混勻，8000rpm离心5min，取上清于另一个离心管中。(5).上清液中加入等体积的酚氯仿(1 1体积)混合液，混勻，SOOOrpm离心 5min,取上清置于另一个离心管中。(6).加入1/5体积的3M醋酸铵，2倍体积无水乙醇，轻缓反转离心管，使溶液充分混勻，DNA形成丝状析出物。(7) · 8000rpm离心5min，沉淀DNA，吸弃所有的上清液。(8).向DNA沉淀中加入Iml的70 %乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。SOOOrpm离心5min，沉淀DNA。吸弃所有的上清液。(9).敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净。(10).溶于 0. 5mlTE 溶液中，测定 0D260 及 0D280，A260/A280 应在 1. 8 2. 0。(11).提取后的基因组DNA通过0.9%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA带应集中均勻， 不含RNA。附牛肉膏蛋白胨液体培养基的配制方法牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g溶于 1000ml 纯净水中，pH7. 0。2. 3. PCR扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因PCR反应所用试剂，Taq DNA聚合酶，反应缓冲液和dNIPs和无菌纯水均来自 Invitrogen公司，PCR引物pi、p2由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司合成。以枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No. 93009)基因组DNA为模板，利用pi、p2引物进行PCR扩增精氨酸酶基因(argBsub)。PCR反应在50 μ 1反应体系中进行，参照pBAD/T0P0 ThioFusion Expression Kit使用说明书的方法进行PCR，T0P0克隆，细胞转化和转化菌株蹄选。(1).制备50 μ 1反应体系。模板DNA，2y 1 (50ng) ； 10X PCR Buf, 5 μ 1 ；50mMdNTPs, 0. 5 μ 1 ；引物pi 和 p2，各 1μ 1 (IOOng) ； Taq DNA polymerase (1 单位/μ 1)，1μ 1 ；加无菌纯水至体积50 μ 1。
(2) .PCR 反应的程序为94°C预变性 ％iin，94°C变性 lmin，56°C退火 30sec，72°C延伸1. 5min ；共30个循环，最后72°C延伸lOmin。反应完毕后，置于冰中待用。
(3).取PCR扩增产物2 μ 1上样1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测为0. 9ΚΒ大小的DNA 片断(已知精氨酸酶基因是888个碱基对的DNA片断)，得到的DNA带轮廓应清楚，适用于直接进行TOPO-TA克隆反应。2. 4. TOPO克隆连接反应(重组质粒的构建)为了获得精氨酸酶基因表达的产物的活性和质量最大化，表达产生的酶蛋白需要有正确的折叠和最大的可溶性，我们认为N-末端融合有HP-硫氧还蛋白引导肽，较有利于维持细菌细胞内部的氧化还原环境，有利于表达蛋白质的正确折叠和增大其可溶性，有利于增加目标蛋白质的表达量。另外，TA克隆技术具有操作简单、快速、重组效率高等优点。 因此，我们选用TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO构建重组质粒pBAD/Thio-TOPO-argBsub。所用pBAD/Thio-TOPO载体、盐溶液和无菌纯水均来自hvitrogen公司。(1).准备Τ0Ρ0克隆反应体系新鲜的PCR反应产物1 μ 1，盐溶液1 μ 1，pBAD/Thio-TOPO载体1 μ 1，无菌纯水 3μ 1，总体积6μ 1。在小试管中震动混勻，短暂离心，集中反应液至试管底部。(2).连接反应把反应试管置室温(25°C)水浴进行TA连接反应15分钟。反应完成后，把反应试管置于冰中待用。2. 5.转化大肠杆菌T0P10感受态细胞转化用受体大肠杆菌T0P10感受态细胞，系hvitrogen公司试剂套件提供的化学诱导的感受态受体菌株，商品名为“one shot T0P10 Chemically Competent Ε. coli。(1).取TOPO克隆连接反应液2 μ 1，加进一小瓶的(50 μ 1)大肠杆菌Τ0Ρ10感受态细胞中，振摇混勻，瞬间离心集中细菌至小瓶底部。 (2).放到冰中，保持10分钟。(3). 42°C热休克细胞30秒钟，无需振摇，立刻转移置放在冰中。(4).向转化细胞中加入250 μ 1室温(25°C )的LB培养基，拧紧瓶盖，在37°C摇床上(225rpm)振摇1小时。(5).取50 μ 1和200 μ 1两个不同体积的转化液铺平板(含有100 μ g/mlAmp的 LB培养基平板)两个。(6). 37°C培养箱孵育平板，得到Amp抗性菌落，从中间筛选出酶活性最高的转化菌株，即是我们构建的大肠杆菌TOPlO/pBAD/thio-TOPO-argBsub基因工程菌株。2.6.阳性克隆的鉴定和筛选分别挑取20个Amp抗性的转化菌单个菌落，接入含有100 μ g/ml Amp的LB液体培养基中，370C，225rpm培养6小时，按0. 01 %的终浓度向培养物添加阿拉伯糖后继续培养 6小时，离心得到湿菌体，把0. Ig湿菌体加入5ml pH9. 0的5%精氨酸底物中，添加锰离子使终浓度成为 ο μ mol/L, 37°C温育60分钟，薄板层析检查鸟氨酸的生成量，从中筛选出精氨酸酶产量最高的转化菌——大肠杆菌基因工程菌株(TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub)。其中薄板层析所用的展层剂配比为正丁醇丙酮浓氨水水=10 10 5 2
2. 7.插入DNA片断的序列分析(1).把菌株 TOPOlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub 接入含有 100 μ g/ml Amp 的 LB 液体培养基中，370C，225rpm培养8_10小时，提取质粒，得到pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒 DNA。(2).将提取的 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重组质粒 DNA 送英潍捷基 Dnvitrogen] (上海)贸易有限公司进行DNA序列分析。(3).依据pBAD/TOPCKThioFusion表达试剂盒产品说明书提供的质粒DNA序列分析引物结合位点的序列信息，由英潍捷基[Irwitrogen](上海)贸易有限公司，合成 PBAD-正向引物pf，其序列是5’ -ATGCCATAGCATTTTTATCC，合成pBAD-反向引物pr，其序列是 5， -ATCTGTATCAGGCTGAAAATC。(4).利用正向引物 pf，5，-ATGCCATAGCATTTTTATCC 和 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段自载体DNA的第245位核苷酸起，至下游1073 个核苷酸的DNA序列。(5).利用反向引物 pr，5，-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC 和 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段至载体DNA的第834位核苷酸起，向上游延伸长1108个核苷酸的DNA序列。(6).通过拼接后，得到一段DNA片段的序列信息，共计1484个碱基对(见序列表 <223>DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列<400>3)，内含TA克隆的插入序列长894个核苷酸(见序列表<223>插入的精氨酸酶基因核苷酸序列表<400>6)，从第4位A起，至891 位的G，计888个核苷酸，其核苷酸序列和枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶基因编码序列完全相同(编码296个氨基酸)。设计PCR引物时在该酶的N-末端增加一个三联体密码GAA， 把天然的终止密码TAA修改为ACC，故插入序列为894 (888+6)个碱基对(编码298个氨基酸)。3. DNA序列分析的结果(1).融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的完整编码序列是由1350个核苷酸组成的。自起始密码ATG开始，是为N-末端有着123个氨基酸残基的HP-硫氧还蛋白引导肽编码的核苷酸序列，接着而来的是为298个氨基酸残基编码的插入DNA序列，内含组成枯草芽孢杆菌精氨酸酶的296个氨基酸残基的核苷酸编码序列，再至为C-末端的V5-抗原决定部位和多组氨酸标签的观个氨基酸残基编码核苷酸，共有1347个核苷酸，给449个氨基酸残基编码，加上一个终止密码，该阅读框共有1350个核苷酸，其完整的DNA序列见序列表 <223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列<400>4。(2).由核苷酸序列推导的融合酶蛋白有449个氨基酸残基组成，自N-末端向 C-末端方向排列，见序列表<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列 <400>6。由核苷酸序列推导的插入DNA片段编码肽链的298个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列，见序列表<223>插入DNA序列编码的氨基酸残基序列<400>7。除去首尾两个氨基酸残基以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。和GenBank公布的枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶的氨基酸残基序列完全一致，见序列表<223>枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列<400>8。4.酶法转化L-精氨酸生成L-鸟氨酸
本发明所述的菌株能够高效转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，工艺过程如下摇瓶培养，阿拉伯糖诱导条件下，每IOOml培养物可以得到3克湿菌体，9克湿菌体在IL反应液中20小时可以催化150克精氨酸定量转化为鸟氨酸，转化率可达到98%。。工程菌摇瓶发酵和酶法转化精氨酸的过程操作方法(1).取-80°C保存的 E. coli TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub 基因工程菌接种到 3. 5mlLB (含100 μ g/ml Amp)培养基试管中，37°C，225r/min，振荡培养16小时。(2).取培养活化好的菌液3ml接种到25ml含100 μ g/ml Amp的2%玉米浆培养基中，37°C，225r/min，振荡培养，培养时间18小时。2%玉米浆培养基由下列营养成分组成玉米粉20g/L、味精 15g/L、磷酸氢二钾 10g/L、硫酸镁 10g/L，pH7. 0 ；(3).取培养好的菌种液15ml接种到100ml 2%玉米浆培养基(含100 μ g/ml Amp)中，37°C，225r/min,振荡培养，当细菌生长至OD600 = 4 . 0时(6小时)，降温至30°C，并加入L-阿拉伯糖至0. 01%终浓度进行诱导，诱导10小时收集菌体。(4).将发酵好的菌液在4°C，5000r/min,离心lOmin，弃上清，收集菌体。按菌体量的10倍比例，悬浮于pH7. 0,0. 01mol/L无菌的磷酸缓冲液中，混勻，所得的菌悬液即为精氨酸工程菌粗酶液。(5).把150克L-精氨酸溶解于800毫升纯水中，用6M的盐酸调PH9.0，再加入90 毫升精氨酸酶工程菌粗酶液(相当于9克湿菌体)，加纯净水至1000毫升体积，加入Mn2+至终浓度为1(^!1101/1，在381的条件下反应20小时，取样，薄板层析检测残余精氨酸，溶液中的残余精氨酸< 2%，终止转化反应。其中薄板层析所用的展层剂配比为正丁醇丙酮浓氨水水=10 10 5 2。(6).将精氨酸酶解液用6M的盐酸调节PH至5. 0，加入活性炭23g，升温60°C，脱色30min后，过滤。滤液在80°C水浴、0. 08Mpa的真空下，浓缩体积至380ml，再加入8g活性炭室温脱色30min后，过滤。滤液在80°C水浴、0. 08Mpa的真空下，浓缩体积至230ml，加入 140ml食用酒精，搅拌均勻，置4°C冰箱中过夜。次日，滤出盐酸鸟氨酸结晶，用20ml左右食用酒精洗涤产品，得湿重143g，70°C烘干后127. 5g ；本次产品收率85. 0%，质量符合AJI92 版(第七版)。本发明的优点是1.目前使用的精氨酸酶多是来自高等动物肝脏的1型精氨酸酶，克隆表达动物肝脏来源的1型精氨酸酶时，需要由其HiRNA反转录成CDNA，再行PCR扩增出精氨酸酶的基因才能和载体重组，手续繁杂，操作困难。而PCR细菌基因则简单方便得多，利用大肠杆菌基因工程菌表达枯草杆菌精氨酸酶，具有安全高效，手续简便的特点，2.所表达的融合蛋白不但保持了高效表达的特性，酶蛋白的表达量达到细菌总蛋白的30%。而且精氨酸酶融合蛋白得到正确的折叠，在融合蛋白的形态下，表现出很高的酶活性，可以满足工业生产的要求。发酵培养得到菌体不需要破壁处理即可以直接用于催化L-精氨酸转化生产L-鸟氨酸。
4.用微生物产生的精氨酸酶代替动物来源的酶，不仅开辟了新酶源，而且能够减少动物传染疾病的机会，有利于产品出口。
图1 枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因PCR-TA克隆方案示意图序列表说明序列1弓丨物Pl的核苷酸序列序列2弓丨物P2的核苷酸序列序列3DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列序列4融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列序列5插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列序列6融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列序列7插入DNA序列编码的氨基酸残基序列序列8枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列关于序列3、4、5的关系的说明
权利要求
1.一种大肠杆菌基因工程菌株T0P10/PBAD/Thio-T0P0-Arg-Bsub，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO. M2010358。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于菌株是大肠杆菌 E. coli TOPlO菌株，携带有pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub重组质粒，能够高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶，所表达产生的精氨酸酶蛋白的N-末端连接着HP-硫氧还蛋白引导肽链，C-末端带有V5-抗原决定部位和多组氨酸标签。
3.根据权利要求1、2所述的大肠杆菌工程菌株，其构建方法包括以下步骤第一步采用PCR技术把枯草芽孢杆菌，保藏号CCTCC No. 93009，的精氨酸酶基因扩增出来，扩增的双链DNA的两条链的3’ 一端都具有一个突出的脱氧腺苷酸，A，扩增的DNA片断记作argBsub，把此DNA片断和质粒pBAD/Thio-TOPO进行TA连接，得到重组质粒pBAD/ Th i o-T0P0-arg-Bsub,第二步用重组质粒pBAD/Thio-T0P0-arg-Bsub转化大肠杆菌宿主菌E. coliTOPIO, 得到高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌株T0P10/pBAD/ Thio-T0P0-arg-Bsubο
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于精氨酸酶基因是来自枯草芽孢杆菌保藏号CCTCC No. 93009的基因组DNA。
5.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于构建重组质粒pBAD/ Thio-TOPO-argBsub，其扩增基因时使用的两个引物的序列如下引物 P1 5 ‘ -GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3 ‘，共 26bp。引物 P2 5 ‘ -GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3 ‘，共 23bp。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于该菌株能够转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于该培养物的培养条件和保存方法分别是培养基LB培养基，称取IOg蛋白胨、5g酵母粉与IOgNaCL溶于950ml的水中，调pH至 7. 0后，加水定容到1000ml，分装成100ml份的三角瓶备用含100 μ g/ml Amp的3. 5mlLB培养基试管取分装有LB培养基的三角瓶，盖上瓶塞， 121°C灭菌20min，待温度降至40°C以下时，加入5%的Amp储存液200 μ 1，混勻后立即无菌分装3. 5ml培养基到已灭好菌的玻璃试管，得到含100 μ g/ml Amp的3. 5mlLB培养基试管， 用于工程菌株的试管培养；含100 μ g/ml Amp的LB培养基玻璃平板取分装有LB培养基的三角瓶，分别称取1. 5g 琼脂粉加进含IOOmlLB培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，121°C灭菌20min，待温度降至45°C以下时，加入5%的Amp储存液200 μ 1，混勻后立即分装15_18ml培养基到已灭好菌的玻璃平板中，待培养基凝固后，置于4°C的冰箱中保存备用；菌株培养条件和保存方法把构建和筛选出来的工程菌株，涂布在含100μ g/mlAmp 的LB培养基的玻璃平板上，37°C培养，将平板上长出的单菌落接种到含100yg/mlAmp的 3. 5mlLB培养基试管中，pH7. 0，37 °C，225r/min,振荡培养过夜，9小时，用灭菌吸管吸取 0. 85ml细菌培养液，添加到灭菌的含有0. 15ml甘油的试管中，混勻，低温保存；长期保存方法冷冻真空干燥法。
全文摘要
本发明公开一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub，和其构建方法。构建的基因工程菌是携带有一种重组质粒的大肠杆菌E.coli TOP10菌株，所述的重组质粒是携带有枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)精氨酸酶基因(arg-Bsub)完整序列的pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub。该菌株可把98％的L-精氨酸转化成L-鸟氨酸。
文档编号C12N1/21GK102234624SQ20111010317
公开日2011年11月9日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者刘爱福, 易清明, 王君英, 王炯 申请人:武汉远大弘元股份有限公司, 武汉远大弘元药业有限公司