专利名称：一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体杂交瘤DYOl及单克隆抗体。
背景技术：
肿瘤的早期诊断对于肿瘤患者的治疗和预后有着非常重要的意义，目前临床常用的肿瘤标志物诸如甲胎蛋白AFP和CEA缺乏足够的检测特异性和灵敏性，因此需要选择更加特异性的检测靶点。细胞内蛋白质降解主要有两条途径蛋白酶体途径和溶酶体途径。多数短寿命的蛋白质通过蛋白酶体途径降解。通过蛋白酶体途径降解的蛋白质大部分首先要经过泛素化，然后由蛋白酶体降解。故该途径又称泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway ；UPP)。WdcHIO属于人类泛素蛋白酶体途径中泛素偶联酶家族成员之一，编码与泛素依赖性蛋白降解有关的蛋白质——人类泛素偶联酶E2C (ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C/UBCH10)，又称细胞周期蛋白选择性泛素载体蛋白(cyclin-selective ubiquitin carrier protein)，是泛素化途径中细胞周期蛋白降解所必需的。近年来，由于该蛋白在细胞周期的调节、周期蛋白的降解、肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、恶变、诊断及治疗中的特殊地位而倍受关注。人类胁t^/O基因位于20号染色体，蛋白由179个氨基酸编码而成，分子量在 19. 6kDa,由于WdcHIO在细胞周期的调节、周期蛋白的降解、肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、恶变、诊断及治疗中的特殊地位而倍受关注。近年来针对不同肿瘤的研究中，越来越多的数据显示WdcHIO与肿瘤的关系十分密切，可促进细胞增殖和恶性转化，但WDCHIO的特异性致瘤作用及致瘤机制仍需进一步研究。WdcHIO是一种与癌症相关的泛素偶联酶，研究发现其在肺、胃、子宫、乳腺、卵巢、 膀胱等原发肿瘤组织中表达上调，且乳腺癌细胞中高表达WdcHIO可以促进乳腺癌细胞的增殖，抑制WdcHIO的表达可抑制乳腺癌细胞的生长。还有报道称WDCHIO的表达与高侵袭性和恶性程度较高的甲状腺癌相关，与卵巢癌的恶性程度也密切相关。同时消化道肿瘤肝癌、 食管癌、结肠癌以及结肠癌伴肝转移都与泛素偶联酶WdcHIO的高表达有联系，所有的临床和实验室研究均表明泛素偶联酶WdcHIO有作为潜在的多种不同肿瘤的临床诊断靶标的可能。因此制备泛素偶联酶WdcHIO的单克隆抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为肿瘤标志物的可行性提供实验数据支持。由于人泛素偶联酶WdcHIO属于非分泌型表达蛋白，在临床血清标本中含量较低， 基本很难检测，通常在组织标本中表达量较高，具有临床检测和验证的价值，目前报道的文献不同肿瘤基本都是从基因水平或组织标本中检测人泛素偶联酶WdcHIO表达量升高。由此，制备能用于临床标本免疫组化检测的人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体进行大批量组织标本的验证，可为其作为肿瘤临床诊断靶标的验证提供有力工具。本发明与现有的人泛素偶联酶WdcHIO抗体相比具有以下的特点和优势 目前尚未有国产化的人泛素偶联酶WdcHIO的抗体，国外有一些公司有可以检测
UbcHlO的抗体产品，但大多数是多抗产品，像Abnova Corporation公司是鼠源性的多抗，Boston Biochem, Inc.禾口 Millipore 公司是兔源性的多抗，Everest Biotech、 Novus Biologicals、Raybiotech, Inc.和 IMGENEX 公司是羊源性的多抗，另外 Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司还有针对UbcHlO两个不同片段的抗体产品，只有Novus Biologicals公司有针对人泛素偶联酶E2C的鼠源性单抗产品，但其免疫原蛋白氨基酸序列为AAH50736包括180个氨基酸，且其单抗亚型为IgG3b 1型，只能用于ELISA和^festern。 同时，国外抗体的价格通常较昂贵，也限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及组织的免疫组化检测的抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明所述的检测人泛素偶联酶W3CHlO的抗体都是用原核重组表达的人泛素偶联酶 WdcHIO蛋白作为抗原免疫小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株 DY01，杂交瘤细胞为IgGl阳性，轻链均为κ型。所述抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 43；34。本发明中人泛素偶联酶WdcHIO的氨基酸序列为AAH16^2，如SEQ ID NO :1所示。 本发明中人泛素偶联酶WdcHIO的基因序列为NM_007019，如SEQ ID NO 2所示。本发明中WdcHIO的全长基因是由肝癌细胞H印G2中由RT-PCR的方法钓取。扩增人泛素偶联酶WdcHIO基因的引物序列为上游引物5’ - GTCGGATCCATGGCTTCCCAAAACCG -3，(SEQ ID NO :3)，下游引物5，- ATTGCGGCCGCTTAGGGCTCCTGGCTGG -3'(SEQ ID NO :4)。 上游引入BamH I内切酶位点，下游引入Not I内切酶位点。原核表达载体选择pET_22b (+ )。所述的保藏号为CGMCC No. 4334的杂交瘤细胞株DYOl的制备方法是取血清效价大于1 :104的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG_4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的人泛素偶联酶WdcHIO蛋白包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗人WdcHIO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为DYOl。应用此株杂交瘤细胞以1 X IO6/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ftOtein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，并通 a^pharose S-200分子筛脱盐，PBS洗脱，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到 90%以上。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明以重组人泛素偶联酶WdcHIO蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的阳性，并用此纯化抗体对肝癌细胞H印G2和SMMC7721进行flfestern-blot证明该抗体可以识别天然变性的人泛素偶联酶WdcHIO蛋白。本发明将此纯化抗体用于进行肝癌细胞SMMC7721的免疫荧光染色以及肝癌组织的免疫组化染色证明其能识别天然的人泛素偶联酶WdcHIO蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究人泛素偶联酶WdcHIO的功能和开发人泛素偶联酶WDCHIO的临床诊断试剂奠定了基础，为其作为肿瘤临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达人泛素偶联酶WdcHIO全长蛋白， 其氨基酸序列为AAH16^2，全长179个氨基酸。与国外现有抗体仅能用于ELISA和狗计吐！! 检测变性WdcHIO蛋白以及价格昂贵等特点相比，本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA 和Wfestern检测变性WdcHIO蛋白以外还可以应用于细胞免疫荧光和临床肿瘤组织标本免疫组化研究检测未变性的天然WdcHIO蛋白，同时降低了应用成本。国外现有WDCHIO抗体大多数都是多克隆抗体，特异性和灵敏度与本发明的WdcHIO单克隆抗体相比要低，并且国外现有的单克隆抗体只能与失去了高级结构的变性蛋白结合，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。 本发明针对人泛素偶联酶WdcHIO全长蛋白制备出的单克隆抗体对检测该蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为人泛素偶联酶WdcHIO功能研究和其作为肿瘤标志物的临床标本验证工作提供支持。
图1是本发明单抗DYOl亚型鉴定结果；
图2是本发明单抗DYOl对肝癌细胞!fepG2和SMMC7721免疫印迹的结果以及阴性对照结果，其结合条带的分子量为^kDa附近；
图3是本发明单抗DYOl对肝癌细胞SMMC7721免疫荧光染色的结果以及普通光镜下的对照结果(显微镜放大倍数200倍)；
图4是本发明单抗DYOl对肝癌组织免疫组织化学染色的结果以及阴性对照结果(显微镜放大倍数100倍)。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定 1、单抗DYOl的制备
1)重组人泛素偶联酶WdcHIO抗原制备
从肝癌细胞H印G2中调取WdcHIO基因，构建原核重组表达载体pET22b (+) /UbcHlO在大肠杆菌fecAericAia coli BL21中表达，利用Ni kpharose亲和层析纯化柱进行纯化， 获得纯度达90%以上的重组人WdcHIO蛋白。2)免疫小鼠
以纯化的重组抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。第一次免疫取重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混勻后，以每只50 μ g/500 μ L 的量多点皮下注射BALB/c小鼠；第二次免疫隔2周后，取重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量多点皮下注射BALB/c小鼠；
第三次免疫再隔2周后，取重组抗原与等体积的PBS混勻后，以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:104的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合； 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。3)免疫血清效价测定
采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50 μ g重组人泛素偶联酶蛋白溶解于IOml 0. 05M pH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C过夜。次日，使用PBS (含有 0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用 IOmM PBS 含 1 % BSA 封闭液 150 μ 1/ 孔，37°C 封闭lh，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天眼眶采血，鼠免疫血清用含1 % BSA IOmM PBS以10—1 10_8倍稀释，加入96孔板，100 μ 1/孔 370C lh, PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次后，加入1 1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG (Sigma, INC. )，100 μ 1/孔37°C lh,同上洗板后，TMB显色，100 μ 1/ 孔，室温避光lOmin，加100 μ 1/孔2Μ H2SO2终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比> 2. 1为阳性来判断免疫血清的效价。3)杂交瘤的制备
取血清效价大于1: IO4的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混勻后，以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1 :1的比例混合，500Xg室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37°C水浴中，将在37°C 水浴保温的50%聚乙二醇(PEG, MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，Imin内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37°C预热的无血清1640培养基1ml、 2ml,3ml,4ml,5ml和IOml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500Xg室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) (HAT, Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200 μ 1。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半 HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma))培养一天，更换1640完全培养基。4)筛选分泌抗人泛素偶联酶单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗 UbcHlO单克隆抗体细胞株，标记为DYOl。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。5)腹水的制备和纯化
将DYOl杂交瘤细胞株以1 X IO6/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的Balb/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ftOtein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，并通过kpharose S-200分子筛脱盐，PBS洗脱， 以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。2、本发明单克隆抗体的特性鉴定1)抗体浓度的测定经杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的腹水经纯化后获得人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体DY01，分别使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度分别为0. 93mg/ml。2)抗体亚型鉴定采用Hbt公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，DYOl分泌抗体的亚型均为IgGl型，轻链均为κ链，如图1所示。3)纯化抗体的效价鉴定50 μ g重组UbcHlO抗原溶于IOml pH9. 6的0. 05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板每孔100 μ L，4°C过夜。PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20) 洗板三次，用IOmM PBS含BSA封闭液150 μ 1/孔，37°C封闭lh，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1纯化抗体，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1 TMB显色，37°C孵育 15min后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450 nm处检测。4)抗体的Wfestern blot鉴定收集肝癌细胞(H印G2和SMMC7721 )，用1 X SDS裂解缓冲液裂解后上样，经12%SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭过夜，PH7. 4的Tris-HCl缓冲液(含有0. 1% (V/V) Tween-20)洗膜3次，每次 lOmin，1:800加入经纯化的杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体DY01，室温孵育Ih后，pH7. 4的Tris-HCl缓冲液(含有0. 1% (V/V) Tween-20)洗膜 3次，每次lOmin，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育lh， TTBS洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1. 4ml SuperSignal 系列Western化学发光底物反应液(A:B=1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗WdcHIO单克隆抗体DYOl均出现单一的特异性条带，结果如图2所示。5)抗体的免疫荧光鉴定收集肝癌细胞SMMC7721，铺于玻璃片上生长过夜，PBS 洗涤细胞，使用预冷的多聚甲醛固定细胞，分别加入杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗WdcHIO单克隆抗体DYOl (1 500稀释)，37°C孵育lh，以PBS为阴性对照。PBS洗片后 1 1000加入荧光标记羊抗鼠二抗(Sigma)，37°C孵育lh，PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗WdcHIO单克隆抗体DYOl染色的细胞均观察到红色荧光，如图3所示。结果证明杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗WdcHIO单克隆抗体DYOl可识别天然的人WdcHIO蛋白。6)抗体的免疫组化鉴定从南方医院收集石蜡包埋的肝癌组织，利用纯化后的杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗WdcHIO单克隆抗体DYOl (1 500稀释)进行免疫组化染色，使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒，染色方法参照迈新试剂盒说明书，DAB显色，阴性对照组以PBS代替一抗，结果发现经抗WdcHIO单克隆抗体DYOl染色的组织标本上在细胞质中均发现棕色颗粒，如图4所示。肝癌细胞的免疫组化染色结果证明杂交瘤细胞CGMCC No. 4334制备的抗WdcHIO单克隆抗体DYOl可识别天然的人WdcHIO蛋白。
权利要求
1.一种抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4334。
2.一种抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体DY01，其特征是由权利要求1所述杂交瘤 DYOl分泌所得。
3.权利要求1所述抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体杂交瘤DYOl的制备方法，其特征是取血清效价大于1 :104的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用 50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的人WdcHIO包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗人WdcHIO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为DYOl。
4.一种检测人泛素偶联酶WdcHIO表达情况的免疫检测试剂，其特征是含有权利要求2 所述抗人泛素偶联酶WdcHIO单克隆抗体DYOl。
全文摘要
本发明公开了一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体。抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4334。其产生的单克隆抗体，能特异性的结合重组和天然的人泛素偶联酶UbcH10蛋白，本发明所述的抗体可用于ELISA、western-blot、细胞免疫荧光以及临床组织标本的免疫组织化学染色研究。同时本发明所述抗体可制备成实验室和临床检测人泛素偶联酶UbcH10表达情况的免疫检测试剂。
文档编号C12N15/06GK102234632SQ201110110398
公开日2011年11月9日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者姚小艳, 徐伟文, 李明, 杜红延 申请人:南方医科大学