专利名称：一种抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学肿瘤学技术领域，具体涉及一种抗Her2抗体与白细胞介素2的融合蛋白及其用途。
背景技术：
抗体的天然效应功能很弱，循环中高浓度IgG的存在可干扰抗体与效应细胞表面 FcR的结合。因此，增强抗体的效应功能一直是抗体研究领域的重要方向。自80年代起， 国内外先后开展了一系列携效应分子的抗体的研究工作，以试图增强抗体的效应功能。80 年代后期，免疫调节因子增强细胞免疫反应和抗独特型免疫反应在肿瘤免疫治疗中的作用受到了极大的关注。白介素2(IL-2)是免疫反应中的重要介导分子，也是已知最强有力的抗肿瘤细胞因子之一，具有广泛的生物学活性。自Rosenberg等人报道IL-2在肾细胞癌和黑色素瘤临床治疗中的抗肿瘤效应后，采用IL-2和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞) 联合治疗恶性肿瘤在临床上获得了广泛的应用。然而，IL-2以及其它细胞因子的全身用药常在远离肿瘤部位的循环中产生高浓度，而在肿瘤局部的微环境中却达不到治疗的最佳浓度。由于IL-2的全身用药可导致致命的副作用，这使IL-2的治疗剂量大受限制。人们迅速将注意力集中到如何提高细胞因子在肿瘤局部的有效浓度，从而避免全身性毒性反应。对于可触及的肿瘤，将细胞因子直接注射到肿瘤局部是一个解决的办法， 但对于肿瘤微小转移灶的治疗，直接注射的方法显然不可行。采用基因转移的方法，将重组细胞因子导入病人自身肿瘤细胞或纤维母细胞，通过基因修饰的细胞分泌细胞因子以诱导局部炎症反应，在某些情况下可产生全身性抗肿瘤免疫反应。然而，恶性肿瘤患者往往经历了放疗、化疗或骨髓、外周血干细胞移植，大剂量化疗可导致严重的免疫抑制。特别是在异基因骨髓移植时为防止移植物抗宿主病(GVHD)而应用强力T细胞抑制剂环胞素 A (cyclosporin Α)后，使这种依赖CTL反应的免疫治疗难以奏效。此外，该方法为病人特异性的，需要采用病人自身的肿瘤细胞，在体外进行基因修饰，然后再回输给病人，操作复杂， 耗费时间，费用昂贵。迄今为止，可评价的临床资料有限。一些研究者开始尝试利用抗体靶向性地传递免疫调节因子，使细胞因子的免疫治疗策略与增强抗体的抗肿瘤效应结合起来，以在肿瘤局部获得高浓度的细胞因子，有效地刺激细胞免疫反应，从而清除肿瘤。从理论上来说，与细胞因子基因治疗的方案相比，抗体-细胞因子融合蛋白(免疫细胞因子)的制备技术较简便，不受病人特异性的限制。而与免疫毒素相比，采用嵌合抗体或人源化抗体融合人源性毒性蛋白，则可有效地降低免疫原性。近年来，研究者构建了几种靶向不同肿瘤相关抗原的免疫细胞因子。动物实验表明，抗体细胞因子融合蛋白的抗肿瘤效应显著优于等剂量抗体与细胞因子的混合应用。目前已有两种免疫细胞因子已进入临床试验阶段ErbB-2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于I型生长因子受体家族成员。 ErbB-2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达， 而在正常组织中表达水平很低。因此，ErbB-2是肿瘤免疫治疗的理想靶分子。1998年美国 FDA批准人源化抗ErbB-2单抗Herceptin 用于ErbB-2过表达乳腺癌的临床治疗，成为继手术、放疗、化疗和内分泌治疗后新的乳腺癌治疗手段。然而单独应用Herceptin 治疗晚期乳腺癌，作为二线用药的总有效率仅为15%，作为一线用药的总有效率为23%。但是，并非所有Her2高表达的患者可从抗体治疗中受益，其中一半以上的患者对Trastuzumab治疗不敏感，且在用药一年后，较大比例的Trastuzumab治疗有效的患者出现耐药，导致治疗失败。Trastuzumab治疗无效及耐药的机制尚不清楚，但研究表明，发展具有不同作用机制的新型靶向Her2的药物，将填补现有产品治疗谱的空白，为更多的患者提供新的用药选择。采用基因工程方法，已成功设计、构建含抗ErbB-2 scFv、人IgGl的Fc段、IL_2的融合蛋白(HF)。HF保留了识别ErbB-2抗原的能力及IL-2的生物学活性。然而HF存在如下缺陷1、生物学活性低；2、表达水平低，不能用于规模化生产。这些缺陷使HF的临床应用受到了很大的限制，急需对HF进行分子改造以克服规模化生产的瓶颈，使HF能应用于Her2 阳性的乳腺癌的临床治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白。本发明的目的还在于提供一条Linker的氨基酸序列，所述Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，其优越之处为可显著提高融合蛋白在哺乳动物细胞表达系统中的产量及生物学活性。本发明的目的还在于提供一种含抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白基因的重组载体及其扩增引物。本发明的目的还在于提供了一种表达抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白的细胞系和宿主菌。本发明的目的还在于提供一种可治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物。本发明的目的还在于提供一种可治疗Her2阳性、Here印tin耐药的乳腺癌的抗体类药物。一种抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人 ⑶16单克隆抗体重链信号肽、ErbB2抗体重链可变区、Linker 1、轻链可变区、人抗体Fc片段、Linker 2及IL-2成熟肽。所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，所述Linker 1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示，所述Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 3 所示。所述基因载体中融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。含有权利要求3所述融合蛋白编码基因的细胞系。含有权利要求3所述的融合蛋白编码基因的宿主菌。扩增权利要求3所述的融合蛋白编码基因中任一片段的引物。一种治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物，其特征在于，它的活性成分是权利要求 1所述的融合蛋白。一种治疗Her2阳性、Here印tin耐药的乳腺癌的抗体类药物，其特征在于，它的活性成分是权利要求1所述的融合蛋白。本发明的有益效果1.本发明的抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白生物学活
4性及产量明显提高。2.本发明的抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白可在体内外有效抑制Her2高表达的肿瘤细胞增殖。3.本发明的抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白可在体内外有效抑制Here印tin耐药的乳腺癌细胞增殖。4.本发明的抗Her2抗体-白细胞介素 2融合蛋白可直接杀伤Her2高表达的乳腺癌细胞。
图1为含抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白的基因载体质粒图。图2为HFI与HF细胞培养上清中目的蛋白的含量。图3不同浓度的HFI和HF蛋白与抗原的结合活性。图4为HFI和HF细胞中IL-2的相对活性。图5HFI在体外对高表达Her2的乳腺癌细胞增殖的影响。图6HFI在体内对高表达Her2的乳腺癌移植瘤增殖的影响。图7HFI在体外对Here印tin耐药乳腺癌细胞BT474、MDA-453和SKBR3增殖的影响。图8HFI在体内对Here印tin耐药乳腺癌细胞移植瘤增殖的影响。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E. F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。以下实施例采用的实验材料来源E. coli JM109工程菌株购自天根生物科技有限公司；CH0、BT474、MDA-453、SKBR3、MCF-7 细胞购自 ATCC ；T4DNA 连接酶为 Gibco BRL 公司产品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶、克隆载体pGEM-T Easy为Promega 公司产品；Ex Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自QIAGEN公司；Protein A亲合层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清(FCS)、DMEM培养基、1640培养基为HyClone公司产品；MTX (氨甲喋呤)及MTT (四噻唑蓝)为Sigma公司产
P
ΡΠ O实施例1抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白基因表达载体的构建以含抗ErbB-2 scFv、人IgGl的Fc段、IL-2的融合蛋白基因载体pCID/HF为模板(载体中融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示)，用引物Pl (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示)和P2 (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示) PCR扩增含有编码抗人⑶16单克隆抗体重链信号肽基因序列、ErbB2抗体重链可变区基因、Linker及轻链可变区基因及人抗体Fc基因片段，条件为95°C变性2min ；然后94°C变性lmin、58°C退火lmin、72°C延伸2min，进行30个循环；最后72°C延伸lOmin。以NheI和 XhoI位点插入表达载体pCID中，获得载体pCID/ScFv-Fc。用引物P3(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示)和P4 (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 9所示)PCR扩增含有编码N末端含有优化后的具有优良特性的十肽 Linker及IL-2成熟肽的基因片段，条件为95°C变性2min ；然后94°C变性lmin、56°C退火
5lmin、72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸lOmin。以XhoI和MluI位点插入表达载体pCID/ScFv-Fc中，获得真核表达载体pCID/HFI。将pCID/HFI转化JM109感受态菌，筛选阳性克隆、扩增并纯化质粒DNA，具体步骤为1) 100 μ 1感受态菌置于冰水，加入DNA 0. 5 μ 1，静置30分钟；2) 42 °C 水浴 2 分钟；3)冰浴5分钟；4)加入不含抗生素的LB培养基，37°C下，150rpm振荡培养50分钟。5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37°C孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37°C摇床震荡培养。7)用试剂盒提取阳性克隆质粒DNA。用Nhe I和MluI双酶切鉴定质粒DNA，送Invitrogen公司测序，测得核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
H2O 18 μ
Buffer(IOx) 4 μ 双酶切体系为DNA 16 μ
Nhe I 1 μ
Mlu I 0.9 μ ο37°C水浴4小时。实施例2工程细胞株的筛选及HFI的表达将CHO/dhfr-细胞培养于含10% FCS,0. lmol/L次黄嘌呤、0. 016mol/L胸腺嘧啶脱氧核苷的IMDM培养基。按照Lipofectamine试剂说明书将重组载体PCI/HFI转染CHO/ dhfr-细胞。转染细胞培养48h后，采用夹心ELISA法检测融合蛋白的瞬时表达，方法同前。采用有限稀释法对转染的细胞进行克隆化培养，培养基为含10%透析FCS、10_6M MTX的 DMEM培养基。筛选过程中，在不同时间点，采用夹心ELISA法检测各细胞克隆的抗体表达水平。具体过程如下用羊抗人IgG(2yg/ml)包被96孔板，4°C过夜。用2%牛血清白蛋白封闭Ih后，加入转染的CHO细胞培养上清，37°C温育lh。洗涤5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(l 5000稀释)，37°C温育lh。洗涤5次后用OPD显色，测定0D490。 高表达克隆在含MTX选择性培养基中继续传代，并采用夹心ELISA法检测，筛选出最高表达克隆，作为工程细胞株。将HFI工程细胞与HF工程细胞均以5 X IO6接种于底面积为150cm2的培养瓶中， 在相同培养条件下(30°C、5% C02)，培养6天。收获培养上清，取5μ1 HFI与HF培养上清测其蛋白含量，结果表明(如图2所示)HFI培养上清中蛋白含量为0. 28mg/ml, HF培养上清中蛋白含量为0. 18mg/ml。取培养上清通过protein A亲和层析纯化，将纯化后的样品和培养上清通过 SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后分析。结果表明HFI的纯度大于90%。 实施例3HFI与HF抗原结合活性和生物活性检测实验
收集1 X IO6个SKBR3细胞，经PBS缓冲液洗涤后，加入纯化后的HFI及HF，冰浴震荡孵育30min，用PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗人IgG，冰浴下震荡孵育30min，用PBS 洗3次，上机(Becton Dickinson公司)分析，以未与转染细胞培养上清孵育的细胞作为阴性对照。将培养的CTLL-2细胞用1640培养基洗3次，计数后，以3X IO4/孔接种于96孔板，同时加入纯化后的HFI及HF，以倍比稀释的IL-2标准品作为阳性对照。培养18h后，加入 10 μ 1 MTT(5mg/ml)，继续培养 4h。以 10% SDS-0. 01mol/L HCl 裂解细胞，测 A490 值。结果表明(如图3所示)，HFI的抗原结合活性略高于HF，HFI的生物学活性显著高于HF(如图4所示)。实施例4HFI在制备杀伤Her2高表达乳腺癌细胞的药物方面的应用1、体外杀伤高表达Her2的乳腺癌细胞MCF-7细胞及MCF-7/Her2 (高表达Her2的MCF-7细胞)以3 X IO4/孔接种96孔板，同时加入纯化后的HFI，以商品化Here印tin作为对照药物。培养96h后加入10 μ 1 MTT(5mg/ml)，继续培养 4h。以 10% SDS-0. 01mol/L HCl 裂解细胞，测 A490 值。结果表明(如图5所示)，HFI能在体外有效杀伤高表达Her2的乳腺癌细胞。2、体内杀伤高表达Her2的乳腺癌细胞4周龄裸鼠，背部皮下植入雌激素缓释药片。次日，将对数生长期BT474细胞按 IX IO7/只接种于裸鼠右腋皮下。将实验动物随机为3组，6只/组。移植瘤接种后第5天开始给药。对照组(control)生理盐水，0. Iml/次/只，每周两次；Here印tin组商品化 Herceptin,按照3mg/kg/次/只，注射体积为0. Iml，每周两次；HFI组HFI纯化样品，按照 0. 5mg/kg/次/只，注射体积为0. 1ml，每周两次。从移植瘤接种开始，每两天测量移植瘤体积，计算公式为移植瘤体积=长径X短径72。结果表明，HFI能在裸鼠体内有效抑制移植瘤的生长，其疗效明显优于Here印tin 治疗组(如图6所示)。实施例5HFI在制备抗Herceptin耐药乳腺癌细胞增殖的药物方面的应用1、HFI体外抑制Here印tin耐药乳腺癌细胞的增殖采用在培养体系中逐步提高Herceptin浓度的筛选方法，对高表达Her2的乳腺癌细胞BT474、MDA-453和SKBR3细胞进行驯化。经过6个月的筛选获得了三株Here印tin耐药的细胞株(BT474-Herc印R、MDA-453-Herc印R 和 SKBR3_Herc印R)。将上述三种Here印tin耐药细胞以3 X IO4/孔接种96孔板，同时加入纯化后的 HFI,以商品化Here印tin作为对照。培养96h后加入10 μ 1 MTT (5mg/ml)，继续培养4h。以 10% SDS-0. 01mol/L HCl 裂解细胞，测 A490 值。结果表明，HFI在体外对高表达Her2的乳腺癌耐药细胞BT474、MDA-453和SKBR3 的增殖具有较强的抑制作用(如图7所示)。2、HFI体内抑制Here印tin耐药乳腺癌细胞的增殖4周龄裸鼠，背部皮下植入雌激素缓释药片。次日，将对数生长期BT474-HerC印R 细胞按IXio7/只接种于裸鼠右腋皮下。将实验动物随机为3组，6只/组。移植瘤接种后第5天开始给药。对照组生理盐水，0. Iml/次/只，每周两次；Here印tin组商品化 Herceptin,按照3mg/kg/次/只，注射体积为0. 1ml，每周两次；HFI组HFI纯化样品，按照0. 5mg/kg/次/只，注射体积为0. 1ml，每周两次。从移植瘤接种开始，每两天测量移植瘤体积，计算公式为移植瘤体积=长径X短径72。 结果表明，HFI在体内对高表达Her2的乳腺癌耐药细胞BT474的增殖具有较强的抑制作用(如图8所示)。
权利要求
1.一种抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人CD16 单克隆抗体重链信号肽、ErbB2抗体重链可变区、Linker 1、轻链可变区、人抗体Fc片段、 Linker 2及IL-2成熟肽。
2.根据权利要求1所述一种抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，所述Linker 1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示，所述Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示。
3.一种含抗Her2抗体-白细胞介素2融合蛋白的基因载体，其特征在于，所述基因载体中融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
4.含有权利要求3所述融合蛋白编码基因的细胞系。
5.含有权利要求3所述的融合蛋白编码基因的宿主菌。
6.扩增权利要求3所述的融合蛋白编码基因中任一片段的引物。
7.一种治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物，其特征在于，它的活性成分是权利要求1 所述的融合蛋白。
8.一种治疗Her2阳性、Here印tin耐药的乳腺癌的抗体类药物，其特征在于，它的活性成分是权利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了属于医学肿瘤学技术领域的一种抗Her2抗体与白细胞介素2的融合蛋白及其用途。该融合蛋白包括人CD16单克隆抗体重链信号肽、ErbB2抗体重链可变区、Linker 1、轻链可变区、人抗体Fc片段、Linker 2及IL-2成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的融合蛋白能抑制Herceptin耐药乳腺癌细胞增殖，并且能够杀伤Her2高表达乳腺癌细胞。本发明为抗Her2抗体与白细胞介素2的融合蛋白在抗肿瘤方面的临床应用奠定了基础。
文档编号C12N15/62GK102199218SQ201110110358
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者施明, 郭宁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所