专利名称：一种abcb1基因多态性检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种ABCBl基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
肿瘤多药耐药存在多种机制,其中以ABC转运蛋白超家族(ATP-binding cassettetransporter superfamily)成员介导的细胞内药物外排在MDR中起了重要作用，也是目前国内外研究的热点之一。多药耐药基因ABCBl (multidrug resistance I,或称MDR1)又名多药耐药相关蛋 白(multidrug resistance protein，MRPl)，是 P-糖蛋白(P-glycol protein, P-gp)的编码基因。多药耐药基因MDRl的表达产物P-糖蛋白是一种ATP依赖型膜转运蛋白，它可以将药物及许多其他相关分子从细胞内排出，参与许多正常的生理活动。药物基因组学研究发现，在不同种族和个体间ABCBl基因多态性与P-gp表达和功能的改变密切相关，其中26号、21号和12号外显子的单核苷酸多态性(SNPs)最引人注目，这些SNPs改变可直接影响药物在细胞内的有效浓度，ABCBl基因在许多肿瘤细胞中均呈高表达，是导致肿瘤细胞对药物产生耐受的重要因素之一。目前，对ABCBl基因多态性进行检测、分析的方法很多，如直接测序法、Realtime-PCR、PCR-RFLP分析法等等，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。本发明目标检测的ABCBI基因突变位点，如表所示表IABCBl位点突变(多态性)的内容
序号I ABCBl位点突变的内容简写
~ SEQ ID NO. 34的第61位核苷酸，发生T — C突变TOC
2SEQ ID NO. 35的第101位核苷酸，发生T - G/A突变T101G/A~
~ SEQ ID NO. 36的第81位核苷酸，发生C — T突变08 Τ
发明内容
本发明的目的之一是提供一种ABCBl基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于检测ABCBl基因三种常见基因型T61C、T101G/A和C81T的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下一种A BCBl基因多态性检测液相芯片，包括有(A).针对ABCBl基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对T61C位点的SEQ ID NO. 8及SEQ ID NO. 9 ;针对T101G/A位点的 SEQ ID NO. 10 及 SEQ ID NO. 11 和 / 或 SEQ ID NO. 12 ;和 / 或针对 C81T 位点的 SEQID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 7 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 21，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对ABCBl基因T61C位点的SEQ ID NO. 22及SEQ IDNO. 23 ;针对 T101G/A 位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25 ;和 / 或针对 ABCBl 基因 C81T位点的 SEQ ID NO. 26 及 SEQ ID NO. 27。优选地，所述ASPE引物为针对T61C位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 8组成的序列及由SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 9组成的序列；针对T101G/A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 10组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 11组成的序列和/或由SEQID NO. 5及SEQ ID NO. 12组成的序列；和/或针对C81T位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ IDNO. 13组成的序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 14组成的序列。本发明的另一目的是提供用于ABCBl基因多态性检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于ABCBl基因多态性检测的特异性引物，其为针对T61C位点的SEQ ID NO. 8及SEQ ID NO. 9 ;针对 T101G/A 位点的 SEQ ID NO. 10 及 SEQ ID NO. 11 和 / 或 SEQ ID NO. 12 ；和 / 或针对 C81T 位点的 SEQ ID NO. I 及 SEQ ID NO. 14。本发明的主要优点在于I.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ABCBl基因多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，三种多态性位点检测可通过一步多重PCR即可完成三个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。5.本发明中的ABCBl基因突变检测液相芯片为多个位点多种基因型的并行检测提供了一种不同构思的技术方案，并产生了显著的技术效果。同时，由于高通量高特异性等技术特征，更加符合实际应用的需求。本发明的液相芯片技术将代表着生物靶标检测的技术发展趋势。
具体实施例方式实施例IABCBl基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对ABCBl基因三种常见基因型T61C、T101G/A和C81T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表2ABCB1基因的ASPE弓丨物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种ABCBl基因多态性检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对ABCBl基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对T61C位点的SEQ ID NO. 8及SEQ ID NO. 9 ;针对T101G/A位点的 SEQ ID NO. 10 及 SEQ ID NO. 11 和 / 或 SEQ ID NO. 12 ;和 / 或针对 C81T 位点的 SEQ IDNO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 7 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 21，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求I所述的ABCBl基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 T61C 位点的 SEQ ID NO. 22 及 SEQ ID NO. 23 ;针对 T101G/A 位点的 SEQ ID NO. 24及 SEQ ID NO. 25 ;和 / 或针对 C81T 位点的 SEQ ID NO. 26 及 SEQ ID NO. 27。
3.根据权利要求I所述的ABCBl基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对T61C位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 8组成的序列及由SEQ ID NO. 2及SEQID NO. 9组成的序列；针对T101G/A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 10组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 11组成的序列和/或由SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 12组成的序列；和/或针对C81T位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 13组成的序列及由SEQ IDNO. 7和SEQ ID NO. 14组成的序列。
4.根据权利要求I所述的ABCBl基因多态性检测液相芯片，其特征是， (A)所述ASPE引物为针对T61C位点的由SEQID NO. I和SEQ ID NO. 8组成的序列及由SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 9组成的序列；针对T101G/A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 10组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 11组成的序列和/或由SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 12组成的序列；和/或针对C81T位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 13组成的序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 14组成的序列； (B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 21，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C)所述扩增引物为:针对T61C位点的SEQID NO. 22及SEQ ID NO. 23 ;针对T101G/A位点的SEQ ID NO. 24及SEQ ID NO. 25 ;和针对C81T位点的SEQ ID NO. 26及SEQ ID NO. 27
5.根据权利要求1-4任一项所述的ABCBl基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.一种用于ABCBl基因多态性检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对 T61C 位点的 SEQ ID NO. 8 及 SEQ ID NO. 9 ;针对 T101G/A 位点的 SEQ ID NO. 10 及 SEQID NO. 11 和 / 或 SEQ ID NO. 12 ;和 / 或针对 C81T 位点的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14。
全文摘要
本发明公开了一种ABCB1基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对T61C位点的SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9；针对T101G/A位点的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12；和/或针对C81T位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12N15/11GK102912003SQ20111021903
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者许嘉森, 刘志明 申请人:广州益善生物技术有限公司