专利名称：一种获得rpgr 基因新的转录剪切形式的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法。
背景技术：
X染色体连锁遗传性视网膜色素变性(XLRP)是一种常见的遗传性致盲眼病，具有发病早，损害严重等特点；资料显示，其在世界范围内的发病率约为1/3500，且有逐年上升趋势，是目前主要的致盲性眼病之一。RPGR基因是一个与此疾病密切相关的的基因，但RPGR基因表达的特征和机制目前尚未见深入报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种获得RPGR基因新的转录剪 切形式的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法，包含以下步骤(I)从犬类组织中提取出核糖核酸；(2)设计特定的寡脱氧核糖核酸引物SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2 ；(3)用逆转录-聚合酶链式反应扩增出cDNA片段，；(4)应用pGEM -3Zf(+)克隆载体将扩增的cDNA片段克隆至大肠杆菌中，获得重组克隆菌落，(5)收集重组克隆菌落中的菌体，置于裂解液中，经过裂解反应后，进行琼脂糖凝胶电泳中；检验后筛选出所有带有cDNA片段的克隆菌落； (6)对筛选出的克隆中的cDNA片段进行顺序分析，通过与RPGR基因现有转录剪切形式比对，最终获得一种RPGR基因新的转录剪切形式。其中，所述的逆转录-聚合酶链式反应的反应体系为
加入最终浓度
AMV/Tfl 5倍浓缩反应缓冲液10微升I倍
dNTP混合液(每种dNTP IOmM)I微升0.2mM
正向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
反向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ硫酸镁25mM 2微升ImM
AMV逆转录酶 I微升0.1单位/微升
TflDNA聚合酶5单位/微升，I微升0.1单位/微升
RNA样品5微克/微升，3微升0.3微克/微升
无核酸酶的纯净水18微升 最终体积50μ1所述的逆转录-聚合酶链式反应的反应程序为45 °C , 40 50分钟；92-95 °C I. 5-2. 5 分钟;93_95C 30-45 秒钟，55-60。。，I. 5-2. 5 分钟，65-67 °C，I. 5-2. 5 分钟，共45 55个循环；62-67°C,8-10分钟；4°C，反应结束。
所述的裂解液配方为蔗糖100毫克/毫升，氢氧化钠100mM，SDS O. 1% (V/V)，核糖核酸酶A 10微克/毫升。有益效果在研究工作中应用了一系列先进的分子生物学技术；其关键步骤首先为一组带有特定顺序的寡脱氧核糖核苷酸片段的设计，其中包括了正向和反向的引物片段；随后采用逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)手段，扩增出相关的cDNA片段。经过克隆、筛选以及DNA顺序分析，发现了一个国内外都从未报道过的、新的RPGR基因转录剪切形式。这一发现为阐明RPGR基因的表达及功能提供了重要的信息，有及其重要的意义。
图I寡脱氧核糖核苷酸片段引物、包括正向和反向引物在RPGR基因中的位置图2新的RPGR基因转录剪切形式的示意图。
具体实施例方式以下结合附图通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明本发现的关键在于从组织中提取出完整的RNA、特定的寡脱氧核糖核苷酸引物的设计以及成功的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。以下实例分步介绍本发现的具体过程。实施例I本实施例以犬类大脑组织为材料，采用复合的RNA提取手段。依据GenBank(美国国立卫生总署基因数据库)中的RPGR基因DNA顺序，应用MacVector (MacVector，Inc.)软件，设计出本研究所需的特殊寡脱氧核糖核苷酸引物。针对本研究的特点设定逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的反应条件。(I)从大脑组织中提取RNA 首先使用常规的组织RNA提取手段(Chomczynski方法，见参考文献)从大脑组织中提取出RNA ;将已得到的RNA沉淀物用QIAGEN公司产品-RNA纯化药盒(RNeasy)的裂解缓冲液(RLT)溶解；然后按照Rneasy的标准步骤，再次纯化并浓缩。以保证RNA中随后逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)必需的mRNA的完整和RNA样品的浓度及纯度。(2)设计寡脱氧核糖核苷酸引物
首先根据目标cDNA片段的长度，确定寡脱氧核糖核苷酸引物(包括正向及反向引物)在RPGR基因中的位置；然后依据GenBank中RPGR基因的DNA顺序，设计出寡脱氧核糖核苷酸引物 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2。(3)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)依据所需扩增的cDNA片段长度、寡脱氧核糖核苷酸引物的顺序等因素，设定了逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的条件；以扩增必须的cDNA片段。逆转录-聚合酶链式反应的反应体系为
加入最终浓度
AMV/Tfl 5倍浓缩反应缓冲液10微升I倍
dNTP混合液(每种dNTP IOmM)I微升0.2mM
正向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
反向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
硫酸镁25mM 2微升ImM
AMV逆转录酶 I微升0.1单位/微升
TflDNA聚合酶5单位/微升，I微升0.1单位/微升
RNA样品5微克/微升，3微升0.3微克/微升
无核酸酶的纯净水18微升 最终体积50μ1逆转录-聚合酶链式反应的反应程序为45°C，40 50分钟；92_95°C I. 5-2. 5分钟；93-95C30-45 秒钟，55-60°C，I. 5-2. 5 分钟，65-67°C，I. 5-2. 5 分钟，共 45 55 个循环；62-67°C，8-10分钟；4°C，反应结束。(4)克隆所得的cDNA片段应用pGEM -3Zf(+)克隆载体(美国PR0MEGA公司产品)将扩增的cDNA片段克隆至大肠杆菌中，获得数百个重组克隆菌落，以供后续的筛选。(5)筛选出带有相关的cDNA片段的克隆收集每个克隆菌落中的菌体，置于裂解液中，经过裂解反应后，加入到琼脂糖凝胶电泳中；检验后筛选出所有带有cDNA片段的克隆菌落。(6)对筛选出的克隆菌落中的cDNA片段进行顺序分析，最终确认RPGR基因的一种新的转录剪切形式即第五至第十一个外显子缺失，第四外显子与第十二外显子直接相连；基因仍保留原有的译读框架(见图2)。以上所述的即为本发现的优选实施方式。
权利要求
1.一种获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法，其特征在于包含以下步骤(1)从犬类组织中提取出核糖核酸；(2)设计特定的寡脱氧核糖核酸引物SEQID No. I和SEQ ID No. 2 ；(3)用逆转录-聚合酶链式反应扩增出cDNA片段，；(4)应用pGEM -3Zf(+)克隆载体将扩增的cDNA片段克隆至大肠杆菌中，获得重组克隆菌落，(5)收集重组克隆菌落中的菌体，置于裂解液中，经过裂解反应后，进行琼脂糖凝胶电泳中；检验后筛选出所有带有cDNA片段的克隆菌落；(6)对筛选出的克隆中的cDNA片段进行顺序分析，通过与RPGR基因现有转录剪切形式比对，最终获得一种RPGR基因新的转录剪切形式即第五至第十一个外显子缺失，第四外显子与第十二外显子直接相连；基因仍保留原有的译读框架。
2.根据权利要求I所述的获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法，其特征在于所述的逆转录_聚合酶链式反应的反应体系为加入AMV/Tfl 5倍浓缩反应缓冲液10微升 dNTP混合液(每种dNTP I OmM) I微升正向引物溶液50pmol 2微升反向引物溶液50pmol 2微升硫酸镁25mM 2微升 AMV逆转录酶 I微升 Tfl DNA聚合酶5单位/微升，I微升 RNA样品5微克/微升，3微升无核酸酶的纯净水18微升最终体积50μ1
3.根据权利要求I所述的获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法，其特征在于所述的逆转录-聚合酶链式反应的反应程序为45°C，40 50分钟；92-95°C，l. 5-2. 5分钟； 93-95°C, 30-45 秒钟，55-60。。，I. 5-2. 5 分钟，65-67°C，I. 5-2. 5 分钟，共 45 55 个循环； 62-67°C，8-10分钟；4°C，反应结束。
4.根据权利要求I所述的获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法，其特征在于所述的裂解液配方为鹿糖100毫克/毫升，氢氧化钠lOOmM，SDS O. 1% (V/V)，核糖核酸酶A 10 微克/晕升。最终浓度 I倍 0.2mM ΙμΜ ΙμΜ ImM·0.1单位/微升 0.1单位/微升 0.3微克/微升
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种获得RPGR基因新的转录剪切形式的方法。首先从组织中分离出核糖核酸；设计特定的寡脱氧核糖核酸引物片段，通过逆转录-聚合酶链式反应扩增出cDNA片段。经过克隆、筛选和顺序分析，证实了存在于RPGR基因转录过程中的一种新的剪切形式，即第五至第十一个外显子缺失，第四外显子与第十二外显子直接相连；基因仍保留原有的译读框架。这个剪切形式在国内、外都从未见诸报道。这一发现为了解RPGR基因的表达及功能提供了重要信息。
文档编号C12N15/12GK102925445SQ20111022542
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者顾烽, 刘军, 王平, 顾大年, 李则孝 申请人:刘军, 顾烽, 王平