专利名称：微生物菌剂及其制备方法和其在制备青贮饲料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌剂，本发明还涉及该微生物菌剂的制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。
背景技术：
青贮饲料是家畜在冬、春季节维生素、矿物质、蛋白质的重要来源，它可以提高家畜的繁殖率和泌乳力，并促进幼畜的生长发育，是饲养家畜不可缺少的基础饲料。在冬季漫长的我国北方，天气寒冷，季节性强，生长期短，青割饲料生产受到限制，青贮饲料是提供冬季多汁饲料最理想的方式，也是灾年饲料短缺时的理想贮备饲料。目前以农作物秸秆为青贮原料的青贮饲料，其规模化的生产主要是添加酵母菌来进行青贮原料的发酵，这种方法发酵时间长，通常需要2— 3个月，得到的青贮饲料蛋白含量低，其质量百分含量仅为4%左右、纤维素基本无降解、香味较淡，家畜食用后消化率低， 且青贮原料的利用率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物菌剂，以农作物秸秆为青贮原料，利用该微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短、蛋白含量高、纤维素降解幅度大、香味浓郁，家畜食用后容易消化，且青贮原料的利用率高；为此，本发明还提供一种该微生物菌剂的制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。为了实现上述目的本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。优选地，所述的酵母诱变菌是酵母菌经由12C+6辐射诱变得到的。优选地，所述绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌的体积份数比是1-3:1-2:1-3。更优选地，所述绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌的体积份数比是1 1 1、2 1 2或 3 · 2 · 3 ο再优选地，所述微生物菌剂还包括营养盐，所述营养盐的组分按重量份数计为尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份。再优选地，所述微生物菌剂还包括乳酸菌。加入乳酸菌可以增加青贮饲料的口感， 即适口性。本发明还提供微生物菌剂的制备方法，所述制备方法的步骤为
a、将酵母菌进行诱变得到酵母诱变菌；
b、将酵母诱变菌、绿色木霉、黑曲霉用PDA培养基进行斜面培养；
C、将步骤b中得到的经斜面培养的绿色木霉、黑曲霉分别在霉菌种子瓶培养基中进行扩大培养；
d、将步骤b中得到的经斜面培养的酵母诱变菌在酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养；
3e、将扩大培养后的酵母诱变菌与绿色木霉、黑曲霉混合，混合比例按照体积份数比绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌为1-3:1-2:1-3，制得微生物菌剂。本发明还提供该微生物菌剂在制备青贮饲料中的应用。优选地，所述青贮饲料的发酵时间为25天。更优选地，所述青贮饲料的青贮原料在发酵过程中pH值为6. 0。在此pH值下可以为霉菌提供良好的生长环境，同时也可抑制其他杂菌的生长，
应用本发明的微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短，发酵10天时纤维素和蛋白含量就有了明显的变化，发酵25天后纤维素含量和蛋白含量基本不再变化，蛋白含量达到了 9. 3%以上，纤维素含量降解了 10%-19%，制成的青贮饲料香味浓郁，提高了青贮原料的利用率，改善了青贮饲料的营养价值；进行了中试试验，能直接进行大规模生产；用该青贮饲料喂养动物，家畜食用后容易消化，缩短了动物采食时间，提高了采食量，家畜增重速度快。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法和所用的试剂及设备，如无特别说明，均为常规方法、常规试剂和设备。实施例1 1. 1菌种
绿色木霉菌株购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号GSICC 62010 ； 酵母菌株购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号GSICC修改为51951 ； 黑曲霉菌株购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号GSICC 60108 ； 乳酸菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 11026。1.2本实验中所用的仪器如下
温室固体发酵培养箱购自上海鸿都电子科技有限公司型号DPN-9272B; 粗纤维测定仪购自济南盛泰仪器有限公司型号ST-06 ； 粗蛋白测定仪购自济南盛泰仪器有限公司型号ST-04C ； 高压蒸汽灭菌锅。1.3 培养基。(1)斜面培养基的制备
乳酸菌斜面培养基配方牛肉膏0. 15g ；蛋白胨0. 5g ；NaCl :0. 25g ；琼脂=Ig ；水 50ml。马铃薯糖琼脂培养基(PDA)配方(用于绿色木霉、酵母诱变菌、黑曲霉)马铃薯 (去皮后切成小块，煮沸半小时):20g ；水100ml ；琼脂2g ；糖(培养霉菌时用蔗糖，培养酵母时用葡萄糖):2g。(2)种子瓶培养基的制备 乳酸菌种子瓶培养基配方
胰蛋白胨2g ；酵母膏0. 5g ；蛋白胨0. 5g ；葡萄糖0. 5g ；吐温80 :0. 005g ；番茄汁 25g，水 1000 ml。霉菌种子瓶培养基配方(用于黑曲霉和绿色木霉)蛋白胨3g ；硫酸铵5g ；硫酸镁0. 4g，蔗糖30g，磷酸二氢钾2g，水 1000ml。酵母诱变菌种子瓶培养基配方
葡萄糖10g ；蛋白胨10g;酵母浸出粉5g;磷酸二氢钾3g;水1000ml。1.4菌种的制备方法 1.4.1绿色木霉菌种的培养
1. 4. 1. 1绿色木霉菌种的斜面转接扩培养
取购买的绿色木霉菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的PDA斜面上，放入35°C 士0. 5°C的温室培养箱中培养3d。1. 4. 1. 2绿色木霉菌种种子瓶培养
取出1.4. 1. 1中已生长成熟的绿色木霉菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的孢子转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，在35°C 士0. 5°C温度下发酵 3d。1.4. 2黑曲霉菌株的培养
1. 4. 2. 1黑曲霉菌种的斜面转接扩培养
取购买的黑曲霉菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的PDA斜面上，放入士0. 5°C的温室培养箱中培养3d。1. 4. 2. 2黑曲霉菌种种子瓶培养
取出1. 4. 2. 1中已生长成熟的黑曲霉菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的孢子转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，在士0. 5°C温度下发酵3d。1. 4. 3乳酸菌菌株的培养
1. 4. 3. 1乳酸菌菌种的斜面转接扩培养
取购买的乳酸菌菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的乳酸菌斜面上，放入37°C 士0. 5°C的温室培养箱中培养20h。1. 4. 3. 2乳酸菌菌种种子瓶培养
取出1. 4. 3. 2中已生长成熟的乳酸菌菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的菌转接于种子培养基进行扩大培养，放入37°C 士0. 5°C的温室培养箱中培养20h。1. 4. 4酵母菌种的重离子束辐照诱变 1. 4. 4. 1菌种的活化
取已知效价且生产性能优良的酵母菌种一支，放置在恒温缓冲间(28°C 士0. 5°C)活化 30mino1. 4. 4. 2 12C+6离子束穿透诱变
对酵母分批设计多点的不同辐照剂量，以重离子加速器提供的12C+6离子束对酵母菌种孢子悬浮液二个样品进行辐照诱变，辐照剂量分别为0 Gy，20 Gy, 40 Gy, 60 Gy, 80 Gy, 100 Gy, 120Gy，然后将处理过的孢子悬液梯度稀释，准确吸取一个样品的孢子悬液0. 2ml/板， 倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落，以追求最佳诱变剂量。同时，以出发菌种另一个样品孢子悬液同法以普通分离平板培养基分离对照，以便进行菌落形态对比。待分离平板培养基在士0.5°C培养6-7d生长成熟，于冰箱中2-4°C保存备用。研究重离子束 12CT6对出发菌种诱变的剂量选择与诱变后筛选出高产菌株的比例。1. 4. 4. 3高效价菌株的筛选(1)单个菌落的挑选
在超净工作台上于分离好的平板上仔细挑选孢子丰满的单菌落，以及菌落形态有一定变异的单菌落，在记录好菌落详细形态及大小后转接于PDA斜面培养基上，于恒温箱内培养，培养温度为(28°C 士0.6°C)、培养时间为6-7d，培养后冷藏备用。(2)摇瓶初筛
①种子瓶发酵
取出已生长成熟的转接于PDA斜面上的菌种进行观察，取一定量长好的孢子转接于酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养，以200r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下进行种子瓶发酵。②发酵瓶发酵
取上步骤培养好的种子液以一定的接种量转接于酵母诱变菌发酵培养基(60ml/500ml 三角瓶)进行二级发酵，酵母诱变菌发酵培养基的配方与酵母诱变菌种子瓶培养基配方相同。转速设定为200r/min，恒温、恒湿条件下培养48h。1. 4. 4. 4 测定结果
①效价测定； 甜高粱渣发酵测定
将IOg甜高粱渣和20g水放入锥形瓶中，，每个辐照剂量按1% (IOOg接种Iml)的比例进行接种。接种后置于恒温箱中27°C培养7d。每天观察实验现象并做好记录，7天后用凯氏定氮仪测样品中的粗蛋白的含量。结果见下表1。表 权利要求
1.一种微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于所述的酵母诱变菌是酵母菌经由 12CT6辐射诱变得到的。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌的体积份数比1-3:1-2:1-3。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于所述绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌的体积份数比1:1:1、2:1:2或3:2:3。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂还包括营养盐，所述营养盐的组分按重量份数计为尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20 份。
6.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂还包括乳酸菌。
7.权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤为a、将酵母菌进行诱变得到酵母诱变菌；b、将酵母诱变菌、绿色木霉、黑曲霉用PDA培养基进行斜面培养；C、将步骤b中得到的经斜面培养的绿色木霉、黑曲霉分别在霉菌种子瓶培养基中进行扩大培养；d、将步骤b中得到的经斜面培养的酵母诱变菌在酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养；e、将扩大培养后的酵母诱变菌与绿色木霉、黑曲霉混合，混合比例按照体积份数比绿色木霉黑曲霉酵母诱变菌为1-3:1-2:1-3，制得微生物菌剂。
8.权利要求1-6任一权利要求所述的微生物菌剂在制备青贮饲料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述青贮饲料的发酵时间为25天。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述青贮饲料的青贮原料在发酵过程中 PH值为6.0。
全文摘要
本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。本发明提供的微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。本发明还提供该微生物菌剂的制备方法及其在制备青贮饲料中的应用。应用本发明的微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短，发酵10天时纤维素和蛋白含量就有了明显的变化，发酵25天后纤维素含量和蛋白含量基本不再变化，蛋白含量达到了9.3%以上，纤维素含量降解了10%-19%，制成的青贮饲料香味浓郁，提高了青贮原料的利用率，改善了青贮饲料的营养价值；进行了中试试验，能直接进行大规模生产；用该青贮饲料喂养动物，家畜食用后容易消化，缩短了动物采食时间，提高了采食量，家畜增重速度快。
文档编号C12R1/225GK102352315SQ20111027142
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者刘静, 唐嘉徽, 张向阳, 李文建, 梁剑平, 王曙阳, 肖国青, 陈积红, 马晓琪 申请人:中国科学院近代物理研究所